基于功能性裂隙燈生物顯微鏡對鞏膜鏡初戴者球結(jié)膜微循環(huán)改變的研究

范歆 黃惠敏 田麗 施策 鄧如芝 沈梅曉 呂帆

鞏膜鏡是一種大直徑（14～25 mm）的硬性透氧性接觸鏡，其鏡片與眼表之間的接觸點位于鞏膜，而不與角膜接觸，鏡片和眼表之間由淚液填充，形成較厚的鏡下淚液層，使鞏膜鏡具有良好的舒適度和光學(xué)性能，從而成為了圓錐角膜、不規(guī)則散光、嚴(yán)重干眼等眼表疾病的最重要的非手術(shù)治療手段之一[1-8]。

配戴接觸鏡后眼表血管反應(yīng)的常見表現(xiàn)是眼紅（充血），眼紅被認(rèn)為是評價接觸鏡適配成功和戴鏡耐受度的主要指標(biāo)之一[9-12]。傳統(tǒng)的結(jié)膜眼紅指數(shù)分級方法已廣泛應(yīng)用于接觸鏡的臨床試驗以評估戴鏡耐受度及戴鏡可能產(chǎn)生的并發(fā)癥[13-16]。然而，眼紅指數(shù)的分級不能直接提供有關(guān)血液循環(huán)的信息，且對細(xì)微的變化不敏感。此外，由于鞏膜鏡屬于硬鏡，其著陸于結(jié)膜、鞏膜，對眼表組織有一定程度的壓迫，因此配戴后也可能導(dǎo)致球結(jié)膜血管的局部受壓變細(xì)、變白，而使用裂隙燈顯微鏡評估時，對于這種血管變化的判斷往往存在不確定性，評估結(jié)果使可能因為個人的主觀判斷而存在一定的差異。長期配戴結(jié)膜血管局部受壓的鞏膜鏌，可能導(dǎo)致結(jié)膜新生血管的產(chǎn)生，甚至可能影響角膜緣供血、供氧而影響角膜緣干細(xì)胞代謝。在既往關(guān)于長期配戴軟鏡的研究中發(fā)現(xiàn)[17-18]，即便是柔軟的軟鏡，在配戴4～16 h后也會出現(xiàn)角膜緣充血，在長期配戴后因鏡片邊緣與球結(jié)膜之間的物理作用會導(dǎo)致下方球結(jié)膜微血管異常及重塑。而鞏膜鏡是硬性材料制作，即使鞏膜鏡成功適配，也可能因鏡片邊緣對球結(jié)膜的機(jī)械作用導(dǎo)致結(jié)膜皺褶、結(jié)膜下陷甚至脫垂的發(fā)生，若球結(jié)膜的形態(tài)改變對球結(jié)膜的血流造成影響，或是脫垂的結(jié)膜覆蓋角膜緣，還可能導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞代謝障礙甚至衰竭[19-20]。因此使用客觀可量化的指標(biāo)對鞏膜鏡配戴后的球結(jié)膜的微血管和微循環(huán)進(jìn)行評估，對更好地了解眼表與鞏膜鏡之間的相互作用至關(guān)重要[21-22]，并能為鞏膜鏡配戴的安全性及配戴者的眼表健康提供線索。

1 對象與方法

1.1 對象

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～30歲；②無鞏膜鏡配戴史；③無其他全身疾病及眼部疾病，如高血壓、糖尿病、中風(fēng)、圓錐角膜、角膜擴(kuò)張等；④最佳矯正視力（BCVA）≥1.0。排除標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)膜疾病，如翼狀胬肉、結(jié)膜瘢痕等；②實驗開始前7 d內(nèi)配戴過軟性接觸鏡、14 d內(nèi)配戴過硬性透氧性角膜接觸鏡（RGPCL）或1個月內(nèi)配戴過角膜塑形鏡；③無法配合鞏膜鏡配戴或固視不佳者。

于2020年5—6月在溫州醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生中招募22 名健康被檢者，共納入22 只眼，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選擇一眼作為實驗眼（13 只右眼，9只左眼）。我們根據(jù)計算，在設(shè)定a=0.05 并且檢驗效能為0.8時，需要每組至少10個樣本，而我們的研究中納入了22名被檢者，已經(jīng)達(dá)到樣本量要求。

本研究遵循赫爾辛基宣言，并經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院倫理委員會同意并批準(zhǔn)（批號：2020-J-41），所有被檢者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料

本研究使用鞏膜鏡（EliteTM 15.8，美國Custom Stable公司），Boston XO材料，最小中心厚度400 μm，總直徑15.8 mm，Toric設(shè)計。

1.3 試驗流程

每名被檢者均進(jìn)行包括眼軸長度、角膜曲率、裂隙燈顯微鏡檢查，并根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選擇一眼作為觀察對象，并根據(jù)其角膜K-flat×100（μm）選擇最接近的矢高值的試戴片進(jìn)行試戴，裂隙燈顯微鏡評估鏡片配適，要求中央及周邊皆有鏡片下淚液層存在，鏡片不接觸角膜，鏡片邊緣對球結(jié)膜的壓迫可接受。使用功能性裂隙燈生物顯微鏡（Functional slit lamp biomicroscopy，F(xiàn)SLB）分別于戴鏡前及戴鏡0、1、2、3 h拍攝顳側(cè)球結(jié)膜照片（見圖1）并分別拍攝鏡下和鏡外共6個區(qū)域獲得球結(jié)膜微循環(huán)和微血管影像（見圖2）。

1.4 圖像獲取及分析處理方法

圖1.配戴鞏膜鏡不同時間點球結(jié)膜微血管變化A：灰度處理后的不同時間點顳側(cè)球結(jié)膜圖像；B：256×256像素大小的球結(jié)膜區(qū)域經(jīng)過骨架化處理后的圖像。Dbox：血管密度Figure 1.Changes of microvascular of bulbar conjunctiva at different stages after wearing the scleral lenses.A:Temporal bulbar conjunctiva images at different time stages after gray processing.B:Skeletonized images of the bulbar conjunctiva region with a size of 256×256 pixels.Dbox,vascular density.

FSLB成像系統(tǒng)與流程在先前的研究中已有描述[18,23-26]，即一臺高速攝像機(jī)（60 D，日本 Cannon公司）和裂隙燈顯微鏡（SLM·4ER，重慶康華瑞明科技有限公司）組合而成，內(nèi)置綠色濾光片。拍攝球結(jié)膜圖像時，若選擇上、下球結(jié)膜區(qū)域，則需要拉開上、下眼瞼，對眼表會產(chǎn)生壓力，可能影響實驗結(jié)果；若選擇拍攝鼻側(cè)球結(jié)膜，拍攝區(qū)域范圍較小，且受反光影響，難以保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性。既往實驗也已經(jīng)證實了拍攝顳側(cè)球結(jié)膜的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性，因此本實驗拍攝范圍選擇顳側(cè)球結(jié)膜。拍攝顳側(cè)球結(jié)膜圖像時，設(shè)置裂隙燈顯微鏡放大倍率為25倍，拍攝視野為1.1 mm×0.9 mm，圖像大小為640×480像素（ISO 400，快門速度1/60 s），以60幀/s的速度采集至少6個顳側(cè)球結(jié)膜區(qū)域的圖像。設(shè)置裂隙燈顯微鏡放大倍率為16 倍，拍攝顳側(cè)球結(jié)膜微血管網(wǎng)照片。使用既往研究中曾發(fā)表的定制開發(fā)的軟件[18,23-25,27-30]，將獲取的包含球結(jié)膜微循環(huán)視頻剪輯并依次輸出連續(xù)的多幀圖像，然后對這些輸出的圖像進(jìn)行配準(zhǔn)，以補(bǔ)償眼球運動。然后對圖像中的血管進(jìn)行分割，視頻中的約30 幀連續(xù)圖像被用來進(jìn)行血管直徑分割，標(biāo)記血管輪廓，并測量血管直徑（D）。在血管壁確定之后，軟件自動標(biāo)記了血管中心線，通過軟件生成時空圖（Spacetime image，STI）。血管中紅細(xì)胞簇的移動距離作為Y軸，X軸表示時間，每個時間點表示視頻序列中的1 幀。STI中突出的條帶代表了紅細(xì)胞或血漿間隙在固定時間間隔內(nèi)的軸向移動距離。隨著紅細(xì)胞的移動，明顯的血流條帶清晰可見。由專業(yè)人員識別每個最長連續(xù)高強(qiáng)度帶兩端中間的2個點并手動標(biāo)記，使其形成一條斜線，其斜率即為軸向血流速度（Va），根據(jù)Va可計算出血流量（Q）（見圖3）。采用Photoshop、Matlab、Image J和 Benoit2.0軟件對球結(jié)膜微血管網(wǎng)照片進(jìn)行灰度處理，校正不均勻光照，降噪，提取并分割血管處理，以分析計算出血管分形維數(shù)，即微血管網(wǎng)密度（Dbox）。Dbox值越大，表明血管密度越大，分支形態(tài)越復(fù)雜。

圖2.配戴鞏膜鏡前后球結(jié)膜微循環(huán)圖像A：戴鏡前、后，分別選取鏡下及鏡外至少6個區(qū)域進(jìn)行拍攝；B：放大210倍后可觀察到血管中流動的紅細(xì)胞簇。ScCL，鞏膜鏡Figure 2.Temporal bulbar conjunctival microcirculation image before and after wearing the scleral lenses.A:Videos were acquired at least six locations,which were in the area under the ScCL and outside the ScCL.B:With a magnification of ×210,red blood cell clusters were seen in those fields.ScCL,Scleral lenses.

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

前瞻性臨床研究。使用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，D、Va、Q、Dbox以進(jìn)行描述，采用單因素重復(fù)方差分析不同時間點的D、Va、Q、Dbox差異，球結(jié)膜微循環(huán)參數(shù)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究共納入22名被檢者，其中男6名，女16名，年齡（26.2±1.4）歲，眼軸長度（25.05±1.10）mm，等效球鏡度（-3.86±2.22）D，角膜曲率K-flat（41.99±1.88）D。

2.1 鏡外區(qū)域球結(jié)膜微循環(huán)變化

在球結(jié)膜微血管方面，戴鏡0 h后Dbox快速升高，戴鏡1 h后Dbox開始下降，但仍高于戴鏡前。戴鏡前Dbox為1.408±0.124，戴鏡0 h時為1.482±0.100，戴鏡前后對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019）。在眼表微循環(huán)方面，戴鏡后D、Va、Q皆減小，戴鏡1 h后開始出現(xiàn)升高，D、Va隨時間的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。戴鏡前Q[（104.5±28.4）pl/s]與戴鏡后1 h時Q[（86.1±20.9）pl/s]差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）。見圖4。

2.2 鏡下區(qū)域球結(jié)膜微循環(huán)變化

鏡下區(qū)域Va、Q與鏡外區(qū)域變化一致，呈現(xiàn)先減小后升高趨勢，戴鏡1 h時達(dá)最低點，而D在戴鏡0 h時為最低點，而后逐漸增大。戴鏡0 h時[（17.63±2.11）μm]、戴鏡1 h時[（17.85±1.86）μm]、戴鏡2 h 時[（18.39±1.90）μm]的D 與戴鏡前[（17.71±1.49）μm]相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），戴鏡0～3 h呈逐漸升高趨勢。戴鏡1 h時Q[（61.6±22.8）pl/s]較戴鏡前[(77.4±27.0）pl/s]降低（P=0.033）；戴鏡3 h時Q[（76.9±22.3）pl/s]與戴鏡1 h時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.043）。見圖4。

2.3 球結(jié)膜微循環(huán)參數(shù)之間相關(guān)性

經(jīng)過Shapiro-Wilk檢驗D、Va、Q正態(tài)性，P值均大于0.05，D、Va、Q符合正態(tài)分布。鏡下、鏡外區(qū)域Va與D呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.20,P=0.010;r=-0.51,P＜0.001），Va與Q呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.81,P＜0.010;r=-0.83,P＜0.001）。角膜K值與D、Va、Q、Dbox無明顯相關(guān)性。見圖5。

3 討論

既往研究表明采用FSLB可以定量評估球結(jié)膜微血管和微循環(huán)系統(tǒng)，且具有較高準(zhǔn)確性[27,29-32]。本研究首次將FSLB應(yīng)用于鞏膜鏡配戴者的球結(jié)膜進(jìn)行成像，比較了戴鏡后不同時間點的球結(jié)膜微血管和微循環(huán)變化，結(jié)果顯示鞏膜鏡初戴者球結(jié)膜受鞏膜鏡壓力出現(xiàn)一過性循環(huán)障礙，之后球結(jié)膜的微循環(huán)速度逐漸升高，可能是由于眼表逐漸適應(yīng)鞏膜鏡，并因鏡片對眼表的刺激，球結(jié)膜血液循環(huán)逐漸加快。

圖3.配戴鞏膜鏡前后球結(jié)膜微循環(huán)圖像及時空圖像A、C：功能性裂隙燈生物顯微鏡拍攝的球結(jié)膜微循環(huán)圖像；B、D：經(jīng)過定制處理后的時空圖像，橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為紅細(xì)胞簇移動距離，紅色線段即手動標(biāo)記出的紅細(xì)胞簇移動距離，其斜率即為軸向血流速度（Va）。ScCL，鞏膜鏡Figure 3.Temporal bulbar conjunctival microcirculation and space-time image.A,C:Temporal bulbar conjunctival microcirculation imaged by functional slit lamp biomicroscopy;B,D:The space-time images processed by custom-build software,the Y-axis was time and the X-axis was the movement distance of red cell cluster.The red line was the manually marked movement distance of red cell cluster,and its slope was the axial blood flow velocity (Va).ScCL,Scleral lenses.

有學(xué)者研究表明，初戴者和長戴者配戴軟鏡后皆出現(xiàn)球結(jié)膜血管直徑、血流速度、血流量、血管密度的升高[18,23,28]，這可能是機(jī)械壓力、摩擦和一定程度的低氧供應(yīng)引起的血管反應(yīng)。因此推測配戴軟鏡后血流速度的加快，可能是因為軟鏡邊緣壓迫球結(jié)膜血管，導(dǎo)致角膜血供減少，從而反射性引起血流速度加快，以補(bǔ)償角膜血供[28]。同時，戴鏡后的角膜缺氧及眼表因適應(yīng)鏡片這一異物的存在而產(chǎn)生的自我保護(hù)機(jī)制可能誘導(dǎo)了眼表亞臨床炎性反應(yīng)的產(chǎn)生，進(jìn)一步誘導(dǎo)補(bǔ)償性的微血管變化[32-33]，這與本研究結(jié)果相符。鞏膜鏡配戴者戴鏡后，鞏膜鏡的機(jī)械壓力以及鏡下淚液層的負(fù)壓吸引力，使球結(jié)膜血管受壓，在配戴0～1 h內(nèi)出現(xiàn)球結(jié)膜Va、Vs、Q的降低，鏡下區(qū)域降低程度較鏡外區(qū)域更明顯，可能是因為鏡片的壓迫，使鏡下區(qū)域的血管受壓后，一部分血液被擠壓入鏡外區(qū)域的血管中。同時，鏡外區(qū)域的血管由于血液循環(huán)受阻而出現(xiàn)了過度充盈，血液被擠入之前肉眼無法觀察到的微血管中，從而出現(xiàn)Dbox升高。而戴鏡2 h后，為提供更多的血流量，球結(jié)膜D逐漸增大，Va、Q隨之升高，隨著血液交換的加快，鏡外區(qū)域的Dbox逐漸降低。有研究采用OCTA技術(shù)[34]對鞏膜鏡戴鏡和未戴鏡的圓錐角膜患者球結(jié)膜進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)戴鏡者的血管密度明顯低于未戴鏡者，與本研究結(jié)果不一致。可能是由于OCTA成像球結(jié)膜血管范圍較大，且可能受到結(jié)膜下鞏膜血管的影響，而本研究僅對鏡外區(qū)域的球結(jié)膜血管進(jìn)行了成像測量，而未測量鏡下區(qū)域。本研究中也已拍攝了眼前節(jié)OCTA，但目前暫時缺乏量化軟件，所以無結(jié)膜血流的OCTA結(jié)果，在之后的研究中，會加入相關(guān)OCTA研究結(jié)果。

圖4.配戴鞏膜鏡前后球結(jié)膜微血管及微循環(huán)隨時間變化趨勢A：血管密度（Dbox）；B：直徑（D）；C：鏡外區(qū)域軸向血流速度（Va）；D：鏡下區(qū)域Va；E：鏡外區(qū)域血流量（Q）；F：鏡下區(qū)域Q。ScCL，鞏膜鏡Figure 4.The trend of microvasculature and microcirculation in bulbar conjunctiva before and after wearing the scleral lenses.A:Vessel density(Dbox);B:Vessel diameter(D);C:Axial blood velocity(Va) in the area outside the ScCL;D:Va in the area under the ScCL;E:blood flow volume(Q) in the area outside the ScCL;F:Q in the area under the ScCL.ScCL,Scleral lenses.

在既往研究中，Jiang等[18]和Chen等[28]對短期配戴軟鏡的健康被檢者戴鏡前后球結(jié)膜微血管和微循環(huán)進(jìn)行了定量分析后發(fā)現(xiàn)，配戴軟鏡6 h后，球結(jié)膜D、Va、Q以及Dbox顯著增加，且在所有不同直徑大小的血管中，Va均增加。說明戴鏡后鏡片對眼表的刺激作用會使球結(jié)膜的微血管和微循環(huán)產(chǎn)生自我保護(hù)性亞臨床炎性反應(yīng)。鞏膜鏡與軟鏡不同，配戴鏡片不僅會對眼表產(chǎn)生刺激，還會壓迫血管，球結(jié)膜血流隨之減少，而球結(jié)膜微血管和微循環(huán)的適應(yīng)性改變最初表現(xiàn)在血管直徑的增大，隨著配戴時間的延長，Va和Q逐漸恢復(fù)。該現(xiàn)象說明在戴鏡初期，與眼表本身對鏡片的亞臨床炎性反應(yīng)相比，眼表受壓對球結(jié)膜血管造成的影響更大。

本研究尚存在一定的局限性。首先，本次納入的樣本較小。其次，研究中戴鏡時間僅為3 h，而未對更接近日常戴鏡時間的8 h內(nèi)進(jìn)行測量。因近年來對于鞏膜鏡沉降時間的研究表明[35]，配戴鞏膜鏡后，絕大部分的沉降都發(fā)生在戴鏡4 h內(nèi)，2 h內(nèi)鏡片沉降最快，鏡片的快速沉降期是球結(jié)膜受壓最明顯的時期，該時期可能對球結(jié)膜的血流變化影響更大，所以本研究僅對戴鏡3 h內(nèi)的球結(jié)膜血流改變進(jìn)行了測量。在未來研究中，我們會納入更多有不同眼表疾病的被檢者并觀察更長時間的日間配戴對其球結(jié)膜的影響。再者，我們未對被檢者摘鏡后次日的球結(jié)膜血流進(jìn)行測量，對于鞏膜鏡戴鏡后對眼表的影響是否在一夜睡眠后仍有影響還未知。

圖5.配戴鞏膜鏡后球結(jié)膜微循環(huán)參數(shù)之間相關(guān)性A：鏡外區(qū)域Va與D的散點圖；B：鏡下區(qū)域Va與D的散點圖；C：鏡外區(qū)域Va與Q的散點圖；D：鏡下區(qū)域Va與Q的散點圖。Va：軸向血流速度；D：血管直徑；Q：血流量。ScCL，鞏膜鏡Figure 5.Correlations between microcirculation parameters of bulbar conjunctiva after wearing the scleral lenses.A:Axial blood velocity(Va) and vessel diameter(D) in the area outside of the ScCL.B:Va and D in the area under the ScCL.C:Va and blood flow volume(Q) in the area outside of the ScCL.D:Va and Q in the area under the ScCL.ScCL,Scleral lenses.

綜上所述，本研究首次采用客觀、安全的FSLB對于鞏膜鏡戴鏡前后的球結(jié)膜微血管和微循環(huán)實現(xiàn)了戴鏡成像及定量分析，避免了主觀評估的不準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，鞏膜鏡初戴者的球結(jié)膜微循環(huán)先降低后升高，而鏡外的血管密度呈現(xiàn)與之相反的先升高后降低的現(xiàn)象，推測這一系列變化的產(chǎn)生是由于眼表受鞏膜鏡壓力，以及戴鏡后出現(xiàn)的適應(yīng)性炎性反應(yīng)。本研究所采用的評估方法及發(fā)現(xiàn)為鞏膜鏡的配戴的安全性及配戴者的眼表健康提供線索，為將來對鞏膜鏡長期戴鏡者的球結(jié)膜微循環(huán)和微血管監(jiān)測提供客觀量化的方法及基礎(chǔ)。

利益沖突申明 本研究無任何利益關(guān)系沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 范歆：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。黃惠敏、田麗：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與設(shè)計及資料的分析和解釋。施策：參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行核修。鄧如芝：行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)。沈梅曉：參與選題、設(shè)計，獲取研究經(jīng)費，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱。呂帆：獲取研究經(jīng)費，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱