角膜力學(xué)生物學(xué)的研究進展

薛超 王雁

生物力學(xué)是研究生命體運動和變形的學(xué)科，是應(yīng)用力學(xué)原理和方法對生物體中的力學(xué)問題定量研究的生物物理學(xué)分支，主要通過生物學(xué)與力學(xué)原理方法的有機結(jié)合，認識生命過程中的規(guī)律，解決生命與健康領(lǐng)域的科學(xué)問題[1]。隨著細胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，生物力學(xué)的研究已從器官、組織水平深入到細胞、分子、基因水平，由此產(chǎn)生了一門新興的交叉學(xué)科——力學(xué)生物學(xué)。

力學(xué)生物學(xué)是探討力學(xué)環(huán)境（刺激）對生物體健康、疾病或損傷的影響，研究生物體的力學(xué)信號感受和響應(yīng)機制，闡明機體的力學(xué)過程與生物學(xué)過程如生長、重建、適應(yīng)性變化和修復(fù)等之間的相互關(guān)系[2]。其通過理解力傳導(dǎo)-細胞感知和響應(yīng)力信號的分子機制從而關(guān)注細胞和組織的物理力和力學(xué)特性的變化是如何促進發(fā)育、細胞分化、生理學(xué)和疾病的方面。此外，對組織調(diào)節(jié)的力學(xué)基礎(chǔ)的深入了解也可能引導(dǎo)用于組織修復(fù)和重建的醫(yī)療器械的改進、生物材料和工程化組織的發(fā)展。

除了作為重要的屈光系統(tǒng)組成成分、對眼內(nèi)容物提供保護，人眼角膜還是承載組織，具有獨特的生物力學(xué)特性。疾病、外傷、手術(shù)、配戴角膜接觸鏡均會引起角膜形狀的改變進而影響成像質(zhì)量，了解及預(yù)測角膜對外在改變的反應(yīng)具有重要的臨床意義。因此，近年來角膜生物力學(xué)逐漸受到重視，已成為研究的熱點，而角膜的力學(xué)生物學(xué)研究相對較少?，F(xiàn)就近年來角膜力學(xué)生物學(xué)研究現(xiàn)狀及進展，進行闡述。

1 角膜的組織學(xué)和力學(xué)基礎(chǔ)

1.1 角膜解剖組織學(xué)及生物力學(xué)特性

角膜在組織學(xué)上分為5 層，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層、內(nèi)皮細胞層。上皮層被認為對角膜生物力學(xué)沒有作用或僅有極小的作用[3]。前彈力層是一層薄的彈性基底膜，其對于角膜生物力學(xué)的作用存在爭議，有研究表明去除前彈力層并不改變角膜力學(xué)屬性[4]。基質(zhì)層占角膜總厚度的90%，是承受角膜載荷起主要作用。基質(zhì)層的膠原纖維成分和纖維結(jié)構(gòu)決定了角膜生物力學(xué)彈性性能[3]。后彈力層是角膜內(nèi)皮細胞的基底膜，有限元評估表明前彈力層和后彈力層占20%角膜的彎曲剛度[5]。內(nèi)皮層為一單層細胞層，由六角形細胞構(gòu)成，其機械屏障作用及離子泵功能是維持角膜相對脫水狀態(tài)的關(guān)鍵，這一層可能通過調(diào)節(jié)角膜的水合作用而影響角膜的硬度[6]。

1.2 角膜基質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)

正常角膜基質(zhì)層主要由大量膠原纖維板層構(gòu)成，其中包含了角膜基質(zhì)細胞、蛋白多糖等成分。角膜基質(zhì)細胞是一種成纖維細胞，位于基質(zhì)板層中，作為基質(zhì)層的最主要細胞成分，調(diào)控著基質(zhì)成分的合成和降解。一方面，角膜基質(zhì)細胞合成分泌多種結(jié)構(gòu)性蛋白規(guī)則排列構(gòu)筑起纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，和蛋白多糖成分協(xié)助纖維間的連接組裝。另一方面，角膜基質(zhì)細胞可合成多種酶類，參與調(diào)控角膜基質(zhì)的合成及降解[7]。

細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）由角膜基質(zhì)細胞分泌，其賦予角膜一定的張力和韌性以保護眼內(nèi)容物，同時在維持角膜的透明特性以及發(fā)揮屈光功能方面也起著重要的作用。細胞外基質(zhì)對細胞起機械支持與連接作用，同時作為細胞之間信號傳遞的橋梁，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、黏附、擴散、遷移等生理過程，參與炎癥的發(fā)生及擴散、腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移等病理過程[8]。

2 角膜力學(xué)生物學(xué)的作用機制

力學(xué)刺激是細胞生物學(xué)功能的重要決定因素，其在決定組織命運或病理狀態(tài)過程中與化學(xué)刺激同等重要。人體活細胞在整個生命過程中不間斷地承受各種力學(xué)刺激，體外環(huán)境和體內(nèi)生理條件的改變會引起應(yīng)力和應(yīng)變改變。而細胞能夠根據(jù)力學(xué)刺激的強度、方向和分布做出多種響應(yīng)[9]。理解細胞如何響應(yīng)力學(xué)刺激，可進一步研究這些力學(xué)信號傳播和分布而最終轉(zhuǎn)化成細胞內(nèi)生物學(xué)和化學(xué)響應(yīng)，即力學(xué)-化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)。角膜基質(zhì)層是承載應(yīng)力的主要結(jié)構(gòu)，角膜基質(zhì)細胞是角膜力生物學(xué)的主要研究對象[10]。在角膜受到外在的力學(xué)刺激或自身受力狀態(tài)發(fā)生改變時，角膜基質(zhì)細胞可能對力學(xué)刺激作出感受、響應(yīng)，接受到力信號的細胞可能發(fā)生某些生物學(xué)行為改變，如細胞形態(tài)、增殖凋亡狀態(tài)、基質(zhì)合成和降解分子表達情況發(fā)生變化，并與其周圍環(huán)境相互作用，使角膜組織發(fā)生相應(yīng)的生物學(xué)和力學(xué)改變[11]。

在成年人角膜組織中，角膜基質(zhì)細胞處于靜止狀態(tài)，不表達壓力纖維或產(chǎn)生大量的收縮力。不同的臨床狀況會引起角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的變化，從而引起角膜基質(zhì)細胞的響應(yīng)[12]。受傷、手術(shù)后或受到其他刺激后，角膜基質(zhì)細胞可被傷口周圍的生長因子和其他細胞因子激活并轉(zhuǎn)化為成纖維細胞[13]。角膜成纖維細胞增生，形成細胞內(nèi)應(yīng)力纖維，遷移至傷口，通過機械力作用對細胞外基質(zhì)進行重組。在特定的傷口中，轉(zhuǎn)化生長因子β-1（Transforming growth factor beta-1，TGFβ1）可誘導(dǎo)角膜成纖維細胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞，從而分泌α平滑肌肌動蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA），對基質(zhì)產(chǎn)生較強的牽引力，合成纖維化細胞外基質(zhì)[14]。

角膜和淚液中存在的肽生長因子，例如胰島素生長因子（Insulin growth factor，IGF）、血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（Fbroblast growth factor，F(xiàn)GF）、白介素1α（Interleukin 1 alpha，IL-1α），肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）和TGFβ可以調(diào)整角膜基質(zhì)細胞的表型，在角膜傷口愈合過程中起到了重要作用[13]。在細胞培養(yǎng)中，這些生長因子可以差異性地調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)細胞的增殖，細胞骨架構(gòu)成和ECM合成[15]。細胞表型的變化通常與細胞力學(xué)行為的變化相關(guān)。例如，在無血清條件下，IGF和PDGF可以刺激3-D基質(zhì)內(nèi)角膜基質(zhì)細胞的伸長，但不會刺激產(chǎn)生顯著的力。與此相反，應(yīng)力纖維形成和顯著的基質(zhì)壓縮表明TGFβ可增加角膜基質(zhì)細胞的收縮[13]。

細胞對可溶性生長因子和（或）生物物理環(huán)境的力學(xué)變化響應(yīng)受許多復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。在某些情況下，作用于細胞膜的力可以通過核骨架和細胞骨架復(fù)合物的連接體（Linker of nucleoskeleton and cytoskeleto，LINC）將肌動蛋白細胞骨架和核相耦合，直接誘導(dǎo)核結(jié)構(gòu)的變化[16]。下游關(guān)鍵信號級聯(lián)反應(yīng)的活性變化整合素，特別是Rho和Hippo信號通路能夠調(diào)節(jié)細胞對生長因子的力學(xué)分化。小GTPases（例如Rho、Rac和Cdc42）的Rho家族是許多類型的細胞中調(diào)節(jié)細胞力學(xué)活動的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，經(jīng)常介導(dǎo)細胞對生長因子和其他細胞因子的反應(yīng)[17]。Rho結(jié)合并激活Rho激酶可抑制肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）磷酸酶，導(dǎo)致MLC磷酸化水平升高和細胞收縮力增加[18]。Rho的激活通常會刺激應(yīng)力纖維的形成和其與剛性基材的粘連[19]。抑制Rho激酶后，細胞變得更加細長，并且沿隨機方向呈擴展樹突狀生長，細胞遷移速率明顯降低[10]。與Rho不同，Rac通常會通過形成較小的局部復(fù)合物和肌動蛋白聚合刺激細胞擴散和遷移[10]。Hippo信號通路的2個下游效應(yīng)子YAP和TAZ的活性，也與機械力的變化有關(guān)[20]。當Hippo信號被激活時，這2個轉(zhuǎn)錄因子都被LATS1/2磷酸化，然后被隔離在被標記的細胞質(zhì)中降解。但是，當Hippo信號不活躍時，YAP和TAZ被去磷酸化并轉(zhuǎn)運至細胞核，與TEAD結(jié)合并促進下游靶基因的表達[20]。有研究認為YAP/TAZ活性與ECM剛度有關(guān)，通過感受下游附著信號的變化，可能涉及Rho途徑[20]。

3 相關(guān)因素的角膜力學(xué)生物學(xué)作用

3.1 眼瞼和淚膜運動

有研究表明由流體流動引起的剪切應(yīng)力能夠調(diào)節(jié)角膜上皮和角膜緣細胞的行為[21]。淚膜具有動力學(xué)特性，其運動時能夠?qū)ζ湎碌募毎┘蛹羟辛?，施加力的大小受淚膜厚度、成分、粘度和眨眼導(dǎo)致的淚液流動方式調(diào)節(jié)。體外模擬淚液的流動，研究其對體外細胞的影響，使得我們進一步了解了流體剪切力影響角膜上皮細胞的精確機制。Molladavoodi等[22]研究了流體對黏附在基質(zhì)上的細胞的影響，發(fā)現(xiàn)以4 dyn/cm2的流速施加24 h產(chǎn)生的剪切應(yīng)力上調(diào)了整聯(lián)蛋白β1 的表達。Hampel等[23]使用IBIDI泵系統(tǒng)復(fù)制了在永生化角膜上皮細胞系（Human telomeraseimmortalized corneal epithelial cells，hTCEpi）眨眼期間施加的應(yīng)力，研究表明施加剪切應(yīng)力導(dǎo)致更少的細胞間隙，并增加了E-鈣粘蛋白、閉合蛋白、橋粒蛋白和緊密連接蛋白的mRNA表達。

3.2 揉眼

揉眼作為一種動態(tài)壓力外載荷，使角膜法線的方向受壓、縱向受拉、表面受剪切力作用，還會引起角膜基質(zhì)板層之間產(chǎn)生相對滑動，對角膜基質(zhì)細胞產(chǎn)生剪切作用。高頻的揉眼刺激還容易使角膜組織產(chǎn)生動態(tài)疲勞，在眼內(nèi)壓作用下由于屈服產(chǎn)生彎曲變形[24]。在揉眼時，會將眼瞼推向角膜上皮，從而減少了受壓區(qū)域下方的淚膜厚度。除壓縮外，摩擦過程中的運動還可能導(dǎo)致剪切力作用于角膜上皮。這些力量的結(jié)合會對角膜的健康產(chǎn)生負面影響[25]?，F(xiàn)有的研究表明揉眼可能是圓錐角膜的重要預(yù)測因子，長期非正常揉眼給角膜基質(zhì)細胞帶來力刺激，接受到力信號的細胞可能發(fā)生某些生物學(xué)行為改變，如細胞形態(tài)、增殖凋亡狀態(tài)、基質(zhì)合成和降解分子表達情況發(fā)生變化，進而促進了圓錐角膜的發(fā)病和進展。揉眼會對上皮細胞產(chǎn)生機械刺激，并在揉眼后的1 min內(nèi)就會引起蛋白酶和炎癥標記物（如MMP-13、IL-6和TNF）表達增加進入淚液中[26]。

3.3 擴張性角膜疾病

在擴張性角膜疾病的發(fā)生中，力學(xué)刺激和炎性因子通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的代謝，對角膜成纖維細胞的增殖起到了非常重要的作用。Feng等[27]對體外兔眼角膜成纖維細胞施加不同幅度的力學(xué)牽拉，研究力學(xué)刺激對角膜成纖維細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)力學(xué)牽拉使角膜成纖維細胞的F-actin發(fā)生收縮，且牽拉幅度越大，F(xiàn)-actin收縮程度越大，使角膜成纖維細胞的遷移受到抑制。短時間、低幅度的力學(xué)牽拉能促進 Lumican的表達，高幅度卻抑制其表達；低幅度力學(xué)牽拉使角膜成纖維細胞 MMP2的表達降低，高幅度力學(xué)牽拉使其表達升高；力學(xué)牽拉能進一步促進IL-1β引起的MMP2表達的升高[27]。

3.4 角膜屈光手術(shù)

角膜屈光手術(shù)后角膜基質(zhì)明顯變薄，在相同的眼內(nèi)壓作用下，角膜所受的應(yīng)力顯著增大，角膜基質(zhì)細胞的力學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，從而影響其生長、增殖、凋亡及其分泌的膠原等細胞外基質(zhì)成分。Feng等[27]的研究表明角膜屈光手術(shù)后角膜基質(zhì)層切削較薄時，角膜成纖維細胞受到的力學(xué)牽拉較小，角膜成纖維細胞可通過增加膠原合成、增加lumican的表達、降低MMP2的分泌來進行角膜損傷修復(fù)。

3.5 角膜接觸鏡

有研究發(fā)現(xiàn)，配戴角膜接觸鏡可以減少角膜上皮細胞死亡，這可能是由于角膜接觸鏡限制了瞬目產(chǎn)生的剪切力作用，瞬目會增加角膜上皮細胞脫落速度和細胞死亡數(shù)量[28]。角膜接觸鏡可以通過限制淚膜在角膜表面的流動來對上皮施加機械作用[29-30]。淚膜的運動引起施加于角膜上皮的剪切力。通過限制角膜接觸鏡下方的淚液流動，可以抑制這些細胞正常受到的機械刺激。此外，有研究表明配戴角膜接觸鏡后淚膜的厚度會發(fā)生改變，這可能會導(dǎo)致作用于細胞的剪切力大小發(fā)生變化[31]。

3.6 眼壓變化和青光眼

眼內(nèi)壓的波動可能導(dǎo)致角膜上皮發(fā)生變化。隨著眼內(nèi)壓的增加，盡管角膜的整體剛度（抵抗變形的能力）不會顯著變化，但角膜的形狀可能會發(fā)生變化，從而會對角膜上皮細胞施加機械應(yīng)變[25]。Gatzioufas等[32]的研究顯示原發(fā)性先天性青光眼可以觀察到角膜基質(zhì)細胞密度的降低，但對角膜生物力學(xué)例如角膜滯后量（Corneal hysteresis，CH）和角膜阻力因子（Corneal resistance factor，CRF）等沒有特定影響。Rossi等[33]的研究顯示采用他氟前列素治療3年的青光眼患者，其角膜基質(zhì)細胞密度和基質(zhì)反射率顯著降低。

3.7 角膜基質(zhì)（細胞外基質(zhì)）的力學(xué)特性

細胞與ECM之間的力相互作用會深刻影響基質(zhì)中角膜基質(zhì)細胞的行為，尤其是在受傷之后，因為伴隨著角膜傷口的修復(fù)，修復(fù)后組織的剛度通常會發(fā)生變化[34]。使用功能化的聚丙烯酰胺（CPdgacrylamide,PA）凝膠已經(jīng)證明基質(zhì)剛度的變化可以調(diào)節(jié)α-SMA在含血清的培養(yǎng)基中的角膜成纖維細胞中的表達[35]。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor,HGF）或紅海海綿素 B（latrunculin B）可以降低這種剛度依賴性的α-SMA表達[35]。Maruri等[14]的研究顯示使用TGF-β1 處理的角膜基質(zhì)細胞ECM剛度的變化可以調(diào)節(jié)形態(tài)、細胞骨架組織和力產(chǎn)生的亞細胞模式，然而，在沒有TGF-β1的情況下培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細胞并沒有顯示剛度依賴性，這表明僅靠硬的微環(huán)境不足以促進角膜基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。通過使用一種膠原蛋白底物可以沿單軸機械加載的新型生物反應(yīng)器，如Zareian等[36]證明了力的各向異性可以誘導(dǎo)遠距離細胞和ECM排列，與各向同性底物相比具有更高的穩(wěn)定性。此外，研究發(fā)現(xiàn)細胞的遷移速率也與基材的硬度有關(guān)，其在中等硬度和高硬度基材上的遷移速率明顯大于柔軟基材。通過對細胞骨架結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，順應(yīng)性好或軟的基材上的細胞缺少應(yīng)力纖維，而在較硬的基材上應(yīng)力纖維則會增加[37]。紫外線交聯(lián)可增加角膜基質(zhì)的硬度，這會引起角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)和應(yīng)力分布的改變，從而調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)細胞反應(yīng)[38]。

3.8 生物材料設(shè)計

研究力學(xué)環(huán)境對角膜的影響，對輔助生物材料或3D微環(huán)境設(shè)計并優(yōu)化細胞所處的化學(xué)環(huán)境具有很重要的作用。許多生物材料結(jié)合了特定的生物成分，例如生長因子和細胞因子，以復(fù)制細胞在體生存環(huán)境或促進基質(zhì)沉積[39]。這些生物成分會影響細胞的行為方式以及它們沉積的基質(zhì)蛋白，進而影響環(huán)境的力學(xué)性能[40]。隨著細胞改變其周圍環(huán)境的力學(xué)性能，新的環(huán)境會影響細胞的行為，從而在細胞與環(huán)境之間產(chǎn)生動態(tài)的相互作用[39]。

3.9 其它

Zhang等[11]通過建立體外細胞機械性壓力刺激模型，對人眼角膜成纖維細胞給予不同壓力梯度、不同加載時長的機械性壓力刺激來觀察其對人眼角膜成纖維細胞的細胞形態(tài)、增殖與凋亡、基質(zhì)合成與降解等生命活動中相關(guān)分子表達水平的影響。結(jié)果顯示，人眼角膜成纖維細胞的增殖與凋亡明顯會受到機械性壓力刺激的影響。機械性壓力短時間加載可促進人眼角膜成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員MMP1、MMP9的表達，長時間加載可抑制角膜結(jié)構(gòu)性蛋白Col1a1、Lumican、Vimentin的表達，進而參與影響人角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑。

劉成星[41]通過對體外培養(yǎng)的兔角膜成纖維細胞進行力學(xué)加載，發(fā)現(xiàn)周期性牽拉能夠促進角膜成纖維細胞增殖，但抑制了細胞遷移行為。EGF和bFGF可以減弱牽拉對細胞遷移的抑制效應(yīng)。不同幅度周期性牽拉對MMPs、TIMPs和Collagen I表達的調(diào)節(jié)具有雙向性：低幅度牽拉抑制MMP-2表達，對MTl-MMP無顯著影響，同時促進TIMPs和Collagen I表達；高幅度牽拉則促進MMP-2和MTl-MMP表達，抑制TIMPs和Collagen I表達[41]。

綜上，角膜組織因其復(fù)雜性，對不同力學(xué)刺激所做出的各種細胞水平、分子等水平響應(yīng)不同，變化也不盡相同，不僅與刺激的強度相關(guān)，也具有時間相關(guān)性。研究如何預(yù)防并減少力學(xué)刺激帶來的反應(yīng)性損傷是需要關(guān)注的重要問題之一。此外，由于人眼角膜的珍貴性，建立更好的動物眼模型，更好的模擬人眼角膜也是未來進行角膜力學(xué)生物學(xué)研究的關(guān)鍵之一。隨著對角膜力學(xué)生物學(xué)研究的不斷認識與逐漸深入，最終希冀能夠進行臨床轉(zhuǎn)化與應(yīng)用，提高角膜疾病的臨床診斷治療水平。

利益沖突申明 本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明 薛超：收集查閱分析文獻，參與選題，進行文章撰寫，根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。王雁：進行選題，修改論文及技術(shù)性指導(dǎo)，文章內(nèi)容審閱及修改，根據(jù)編輯部的修改意見進行修改、審校