siRNA沉默ECT2對(duì)人SW1990胰腺癌細(xì)胞中時(shí)鐘基因PER表達(dá)的影響

彭宇環(huán) 洪明昭 王洪 劉峰

(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院 1藥學(xué)部，廣東 深圳；2內(nèi)分泌科)

目前，糖尿病合并胰腺癌的患者增長(zhǎng)顯著，其中以輕、中度中老年2型糖尿病患者為主，且男性多于女性〔1〕，糖尿病患者的胰腺癌發(fā)病率相比于正常人高出1.5～7.0倍。研究證實(shí)一些糖尿病患者的胰腺功能處于長(zhǎng)期紊亂、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，慢性高血糖對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞造成慢性刺激，最終導(dǎo)致胰腺癌〔2,3〕。除此以外，某些胰腺癌患者發(fā)現(xiàn)前就以糖尿病面孔出現(xiàn)，這是因?yàn)橐认侔┲苯悠茐囊葝u細(xì)胞，造成胰島素分泌減少，同時(shí)患者體內(nèi)也容易產(chǎn)生胰島素抗體，最終引起血糖升高〔2,3〕。目前認(rèn)為胰腺癌和糖尿病互為因果關(guān)系。但由于目前對(duì)其研究并不深入。因此，進(jìn)一步探索其相關(guān)機(jī)制，探索其早期篩查標(biāo)志物及相應(yīng)的診療手段，有重要的理論價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。有報(bào)道顯示上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因(ECT2) mRNA及蛋白在胰腺癌組織中高表達(dá)，與患者生存相關(guān)〔4,5〕。本研究擬采用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人SW1990胰腺癌細(xì)胞并采用siRNA-ECT2沉默ECT2表達(dá)，觀察其增殖能力和凋亡水平的改變，并采用熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)鐘基因PER1和PER2表達(dá)水平，初步探討ECT2對(duì)人SW1990胰腺癌細(xì)胞中時(shí)鐘基因PER1和PER2的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人SW1990胰腺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。主要試劑與儀器：化學(xué)合成siRNA-ECT2購(gòu)自上海吉瑪生物公司；人SW1990胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)ScienCell公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒及AV-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本東洋紡公司。ST-360型酶標(biāo)儀購(gòu)自山東博科生物公司；FACSAria Ⅱ型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；9600型熒光定量PCR購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2CCK-8法檢測(cè)SW1990細(xì)胞增殖能力 人SW1990胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)后，用培養(yǎng)基將其制成細(xì)胞懸液，然后采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μl細(xì)胞懸液，即每孔1 000個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組，再分別加入siRNA-ECT2,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔加入CCK-8 10 μl，然后繼續(xù)培養(yǎng)1 h后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處讀取各孔吸光度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞相對(duì)活力，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SW1990細(xì)胞的凋亡水平 將SW1990細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置對(duì)照組，每組3個(gè)平行孔，參照說(shuō)明書操作分別收集各組細(xì)胞，每管5×105個(gè)，1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，用100 μl標(biāo)記液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育15 min，每管樣本加入10 μl碘化丙啶(PI)，再加入預(yù)冷的1倍結(jié)合緩沖液后上機(jī)檢測(cè)。

1.4免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 分別收集對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組藥物作用48 h后的細(xì)胞提取總RNA，總RNA提取參照Trizol使用說(shuō)明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熒光定量PCR參照TaKaRa公司說(shuō)明書進(jìn)行。PER1上游引物：TGCGCCCGCACTGCGATTTA，下游引物：TGGGATTTATTACTGCAGGGGGACA，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度75 bp；PER2上游引物：TGCGCCCGCACTGCGATTTA，下游引物：TGGGATTTATTACTGCAGGGGGACA，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度106 bp；β-actin上游引物：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT，下游引物：GCTGTCACCTTCACCGTTCC，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度268 bp。采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1siRNA-ECT2對(duì)SW1990胰腺癌細(xì)胞活力的影響 24、48、72、96 h檢測(cè)OD值，各濃度作用組的細(xì)胞OD顯著下降，與對(duì)照組相比較有顯著差異(P<0.05)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明siRNA-ECT2可以抑制人SW1990胰腺癌細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)一定劑量性和時(shí)效性。見(jiàn)表1。

表1 siRNA-ECT2對(duì)SW1990胰腺癌細(xì)胞活力的影響

2.2siRNA-ECT2促進(jìn)SW1990胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡 siRNA-ECT2干預(yù)高糖培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞后，SW1990細(xì)胞的凋亡率上調(diào)，對(duì)照組(2.57%±0.21%)與siRNA-ECT2組相比(21.44%±0.78%)差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3siRNA-ECT2上調(diào)SW1990細(xì)胞中PER1和PER2基因表達(dá) siRNA-ECT2組PER1和PER2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(3.899 8±0.139 0、4.340 2±0.294 1)，明顯高于對(duì)照組(1.031 5±0.030 2、1.212 1±0.107 8，均P<0.05)。

圖1 siRNA-ECT2對(duì)SW1990胰腺癌細(xì)胞的促凋亡作用

3 討 論

胰腺癌因?yàn)閻盒猿潭雀?、預(yù)后差，被稱為癌癥之王〔6〕。胰腺癌常見(jiàn)的分為兩種病理類型，包括胰腺導(dǎo)管腺癌(約占90%)和胰腺內(nèi)分泌腫瘤(少于5%)〔7〕。目前針對(duì)胰腺癌的治療方案主要包括手術(shù)治療、傳統(tǒng)放化療、新輔助治療及免疫療法，但仍未能顯著提高患者的生存率，且5年生存率極低，迫切需要有效的新治療方式〔8～10〕。糖尿病患者由于糖代謝異常，高糖長(zhǎng)期對(duì)于胰島細(xì)胞的損傷，誘發(fā)胰腺癌的概率大大升高，糖尿病合并胰腺癌并不罕見(jiàn)，出現(xiàn)這種合并癥狀患者在治療方案也與單純胰腺癌患者方案有所調(diào)整〔2,3,11,12〕。代謝調(diào)控是生物信號(hào)輸出的重要途徑，如糖代謝紊亂容易誘發(fā)肥胖或糖尿病，而時(shí)鐘基因在這其中發(fā)揮重要作用。外周生物鐘在人體大部分組織中廣泛存在，外周生物鐘并不能自主產(chǎn)生生理節(jié)律，而是由位于大腦中的視交叉上核控制下的神經(jīng)、體液等其他信號(hào)分子進(jìn)行調(diào)控〔13～15〕。目前已明確有一些不良的生活習(xí)慣可以影響生物鐘基因的震蕩表達(dá)模式，從而進(jìn)一步影響生物鐘的變化，包括糖尿病在內(nèi)的各種疾病〔16,17〕。有報(bào)道顯示在糖尿病患者外周血白細(xì)胞中PER1及PER3的表達(dá)顯著降低，提示糖尿病患者生理節(jié)律的紊亂〔18,19〕。我國(guó)是全球糖尿病患者最多的國(guó)家。糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是胰島β細(xì)胞的功能受到損害及胰島素抵抗。通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠胰島β細(xì)胞中的生物鐘基因發(fā)生異常變化時(shí)，胰島素的分泌會(huì)發(fā)生障礙，同時(shí)葡萄糖代謝發(fā)生紊亂，并進(jìn)一步促進(jìn)糖尿病的發(fā)生〔20,21〕。因此從生物鐘的角度為切入點(diǎn)，尋找預(yù)防與治療糖尿病的新靶點(diǎn)與新方法打開(kāi)了新的思路。

ECT2位于人類腫瘤較易發(fā)生突變的染色體3Q26區(qū)域，在多種腫瘤組織中表達(dá)，屬于Rho家族特異性交換因子，在DNA損傷應(yīng)答和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)Rho調(diào)控胞質(zhì)分裂過(guò)程。此外ECT2可引起RAS同源(RHO)家族小GTP酶的異常激活，與腫瘤及多種疾病密切相關(guān)。ECT2在非小細(xì)胞肺癌、惡性結(jié)腸癌、胰腺癌等組織中高表達(dá)，且可以促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移〔22〕。

本研究結(jié)果顯示采用siRNA沉默ECT2的表達(dá)能夠抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，且能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，另外，提示ECT2有可能參與調(diào)控相應(yīng)基因從而改變PER1和PER2的表達(dá)，有可能對(duì)于生理節(jié)律相關(guān)基因有一定調(diào)控，對(duì)于糖尿病合并胰腺癌患者臨床上調(diào)節(jié)生理節(jié)律，有助于其治療和生存狀態(tài)的改善。