朱璉緩慢捻進(jìn)法對(duì)衰老大鼠超氧化物歧化酶表達(dá)的影響

毛佳楠 羅偉 王莉靈 趙彩嬌

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，廣西 南寧 530001)

衰老的機(jī)制眾多，有自由基學(xué)說〔1,2〕、端粒學(xué)說〔3〕、細(xì)胞凋亡學(xué)說〔4,5〕等。其中，自由基學(xué)說是世界范圍內(nèi)被認(rèn)可的主流學(xué)說。超氧化物歧化酶(SOD)是抗氧化酶的重要組成部分之一，它協(xié)同過氧化氫酶清除自由基。有研究發(fā)現(xiàn)針刺對(duì)衰老模型大鼠具有顯著療效，其延緩衰老機(jī)制與調(diào)節(jié)自由基代謝有著密切的關(guān)系〔6～9〕。朱璉緩慢捻進(jìn)法是在針尖輕觸皮膚后，進(jìn)行捻轉(zhuǎn)，同時(shí)稍加向下的壓力，時(shí)而停時(shí)而捻，如此反復(fù)，將針捻入皮膚之后，繼續(xù)緩慢捻轉(zhuǎn)尋找針感，直到預(yù)定深度的一種進(jìn)針法〔10〕。研究〔11～13〕表明普通針刺能夠改善衰老相關(guān)指標(biāo)水平的表達(dá)。對(duì)比普通針刺和朱璉緩慢捻進(jìn)法，其差異主要在于進(jìn)針的過程，而朱璉緩慢捻進(jìn)法在衰老相關(guān)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)研究較少，目前尚不清楚進(jìn)針過程的差異對(duì)延緩衰老效果的影響。本研究以亞急性衰老模型大鼠為研究對(duì)象，探討朱璉緩慢捻進(jìn)法延緩衰老的機(jī)制，從預(yù)防和治療兩方面觀察朱璉緩慢捻進(jìn)法對(duì)衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝組織中 SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供的健康SD大鼠60只，雄性，體重240～280 g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于溫度23～25℃的實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)開始前先適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d，整個(gè)飼養(yǎng)過程中大鼠自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后將所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組、普通針刺預(yù)防組、朱璉緩慢捻進(jìn)法治療組、普通針刺治療組，每組10只。飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)全程對(duì)動(dòng)物的處置符合國家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2主要儀器及試劑 華佗牌“承臻”一次性使用無菌針灸針(規(guī)格0.25 mm×25 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，BCD-216SDM冰箱(青島海爾股份有限公司)，MT70-2微孔板恒溫孵育器(杭州米歐儀器有限公司)，Epoch全波長酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)，CBFSTPRP-24全自動(dòng)研磨器(上海測博生物科技發(fā)展中心)，QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈的反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)，HI650離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf公司)，玻璃毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，D-半乳糖(美國Sigma公司)，0.9%氯化鈉溶液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)，SOD試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，15596-026總RNA抽提試劑(美國Ambion公司)，R101-01/02反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，AI101核糖核酸酶抑制劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.3大鼠亞急性衰老模型的建立 參考崔美芝等〔14〕造模方法，用0.9%氯化鈉溶液將D-半乳糖配制成10%的D-半乳糖溶液，以腹腔注射的方式給藥(500 mg/kg)，現(xiàn)配現(xiàn)用。大鼠每日空腹稱體重，除空白對(duì)照組外，所有大鼠每天于9時(shí)腹腔注射D-半乳糖溶液。連續(xù)造模42 d出現(xiàn)豎毛拱背、毛色枯黃無光澤、畏寒肢冷、進(jìn)食量減少、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等衰老征象，提示造模成功。

1.4治療方法 參照趙彩嬌等〔15〕治療時(shí)程安排，預(yù)防組每日造模給藥結(jié)束后進(jìn)行治療，共42 d；治療組待整體實(shí)驗(yàn)造模結(jié)束后再治療，共治療28 d。朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組：給藥完畢后將大鼠以仰臥位固定，進(jìn)行預(yù)防治療。參照《大鼠穴位圖譜的研制》〔16〕，取“關(guān)元”、雙側(cè)“足三里”，采用朱璉緩慢捻進(jìn)法，進(jìn)針全程耗時(shí)2 min，留針30 min，中途用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法行針1次，約1 min，每日1次，共42 d。普通針刺預(yù)防組：給藥后，將大鼠以仰臥位固定，進(jìn)行預(yù)防治療，取“關(guān)元”、雙側(cè)“足三里”，常規(guī)針刺留針30 min，中途用捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法行針1次，約1 min，每日1次，腧穴定位、治療時(shí)間同朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組。朱璉緩慢捻進(jìn)法治療組：造模成功次日開始進(jìn)行治療，取穴、腧穴定位及操作方法同朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組，共治療28 d。普通針刺治療組：造模成功次日開始進(jìn)行治療，取穴、腧穴定位及操作方法同普通針刺預(yù)防組，共治療28 d。

1.5觀察指標(biāo)及方法 血清SOD活性的檢測：各組大鼠于造模后和治療結(jié)束后次日用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行眶底靜脈叢采血1.5 ml，4 ℃過夜后，3 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。于酶標(biāo)包被板上的標(biāo)準(zhǔn)孔中加樣 50 μl，待測樣品孔中先后加入樣品稀釋液和待測樣品各40 μl和10 μl。封板后37℃溫育30 min，棄去液體，甩干后加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl。封板后37℃溫育30 min后棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔先后加入各50 μl顯色劑A、B輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。每孔加終止液 50 μl，使反應(yīng)終止。在添加終止液之后的15 min內(nèi)，空白孔調(diào)零，波長450 nm，測量各孔的吸光度(OD值)。用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，計(jì)算出樣品濃度后再乘以稀釋倍數(shù)，即可得出樣品的實(shí)際濃度。

SOD mRNA的檢測：各組大鼠于治療結(jié)束次日稱重后用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,完成眶底靜脈叢采血后處死，于冰臺(tái)上快速取肝，剪碎100 mg肝組織立即浸泡RNA保存液，放入液氮貯存。使用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR檢測SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量。取新鮮冰凍組織，加入總RNA抽提試劑1 ml，研磨成漿，移至無RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min。加入氯仿200 μl，混勻，室溫放置5 min。離心15 min(12 000 r/min，4℃)，可見分成上中下三相。轉(zhuǎn)移上層水相于另一新1.5 ml EP管中，加入異丙醇400 μl，混勻，室溫靜置10 min后，離心10 min(12 000 r/min，4℃)，于管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 ml，渦旋混勻后，離心5 min(10 000 r/min，4℃)。重復(fù)1次。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于20 μl 的DEPC水中。將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA做5倍稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系組成：各0.4 μl的上游引物和下游引物(委托北京擎科生物科技有限公司合成)，SOD1正義鏈：5′-GAGAGCATTCCATCATTG-3′，反義鏈：5′-GAGACTCAGACCACATAG-3′；SOD2正義鏈：5′-GGAGATGTTACAACTCAG-3′，反義鏈：5′-CTCCTTAAACTTCTCAAAAG-3′；SOD3正義鏈：5′-CTAGGAATCCTTCACACC-3′，反義鏈：5′-GAGCAAACTCAAAGACTG-3′。0.4 μl的50×ROX Reference Dye 2、10 μl的SYBR Green Master Mix、4.8 μl的ddH2O。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性(95℃，10 min)；變性(95℃，30 s)，退火/延伸(60℃，30 s)，40個(gè)循環(huán)，最終延伸(50℃，2 min)。于熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)由電腦自動(dòng)記錄反應(yīng)管中的熒光信號(hào)值，并描繪曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。按照2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺對(duì)衰老模型大鼠血清中SOD活性的影響 造模結(jié)束后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組血清中SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，兩個(gè)預(yù)防組血清SOD活性顯著上升(P<0.05)；兩個(gè)治療組血清中SOD活性相對(duì)模型組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；預(yù)防組中使用朱璉緩慢捻進(jìn)法的SOD活性更高(P<0.05)。治療結(jié)束后，模型對(duì)照組血清SOD活性顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。預(yù)防組和治療組血清中SOD活性較模型對(duì)照組均顯著上升(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組相比，普通針刺預(yù)防組的活性更低(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進(jìn)法治療組相比，普通針刺治療組的活性更低(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進(jìn)法治療組相比，朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組活性更高(P<0.05)，和普通針刺治療組相比，普通針刺預(yù)防組的活性更高(P<0.05)。見表1。

2.2朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺對(duì)衰老模型大鼠肝組織中SOD基因表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型對(duì)照組肝組織中SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；預(yù)防組和治療組的肝組織SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于模型對(duì)照組(P<0.05)；預(yù)防組和治療組中，采用朱璉緩慢捻進(jìn)法肝臟SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于采用普通針刺法(P<0.05)；和朱璉緩慢捻進(jìn)法治療組相比，朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防組SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(P<0.05)；和普通針刺治療組相比，普通針刺預(yù)防組的SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量更高(P<0.05)。見表1。

表1 造模后、治療后各組血清SOD活性及治療后肝組織SOD mRNA表達(dá)比較

3 討 論

本研究結(jié)果說明，朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺均可起到良好的防止血清SOD活性降低的作用；朱璉緩慢捻進(jìn)法預(yù)防血清SOD活性降低的效果較普通針刺更明顯；朱璉緩慢捻進(jìn)法比普通針刺提高SOD活性的效果持久；朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD的活性；朱璉緩慢捻進(jìn)法提高SOD活性的效果優(yōu)于普通針刺；使用朱璉緩慢捻進(jìn)法對(duì)衰老進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)的效果優(yōu)于治療性干預(yù)；使用普通針刺對(duì)衰老進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)的效果優(yōu)于治療性干預(yù)，朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD基因的表達(dá)；朱璉緩慢捻進(jìn)法提高SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量的效果優(yōu)于普通針刺；使用朱璉緩慢捻進(jìn)法對(duì)衰老進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)的效果優(yōu)于治療性干預(yù)；使用普通針刺對(duì)衰老進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)的效果優(yōu)于治療性干預(yù)。

自由基能與核酸反應(yīng)，降解堿基，破壞氫鍵，使基因發(fā)生突變；自由基除了能氧化蛋白質(zhì)，使多肽鏈斷裂，還能抑制蛋白質(zhì)合成；自由基還極易與胞膜內(nèi)的不飽和脂肪酸反應(yīng)，生成脂質(zhì)自由基，對(duì)細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大的破壞〔2〕。以上種種共同導(dǎo)致了細(xì)胞組織的老化，從而產(chǎn)生了衰老。雖然機(jī)體的正常代謝能有效清除自由基，但抗氧化劑和自由基清除劑隨著年齡的增長而減少，導(dǎo)致自由基水平升高，細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)功能受到不可逆的損傷，從而引起衰老。

SOD是一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的抗氧化酶，能夠催化代謝產(chǎn)生的超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫和氧，過氧化氫則可在過氧化氫酶的作用下被分解成水和氧，從而清除體內(nèi)的自由基，維持動(dòng)態(tài)平衡。在動(dòng)物體內(nèi)，SOD主要分為存在于胞質(zhì)和胞核中的Cu/Zn SOD(SOD1)、存在于線粒體中的Mn SOD(SOD2)和存在于細(xì)胞外的EcSOD(SOD3)。SOD從牛紅細(xì)胞中分離提純獲得〔17〕，研究發(fā)現(xiàn)了SOD催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的特性〔18〕。研究表明SOD具有通過清除自由基來延緩衰老的作用〔19〕，亦有研究表明針刺能夠通過改善SOD的表達(dá)，來延緩衰老〔20～24〕。本研究發(fā)現(xiàn)，朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺均能有效提高亞急性衰老模型大鼠SOD活性和SOD基因表達(dá)，是對(duì)以往研究的印證。

朱璉緩慢捻進(jìn)法是我國著名針灸學(xué)家朱璉先生提出的一種進(jìn)針法。朱璉認(rèn)為針灸治病的關(guān)鍵在于激發(fā)和調(diào)整機(jī)體內(nèi)部神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能和管制功能〔25〕。根據(jù)調(diào)整神經(jīng)系統(tǒng)的原理及現(xiàn)代神經(jīng)生理學(xué)說的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)針灸對(duì)機(jī)體進(jìn)行刺激，產(chǎn)生的皮膚感覺，可能投射回大腦皮層上相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)，從而達(dá)到治療目的〔25〕。朱璉緩慢捻進(jìn)針法的基本操作步驟如下：①施針者在針尖尚未接觸皮膚時(shí)要捏緊針柄，以防無菌的針掉落；②刺手靠近預(yù)定腧穴后使針尖輕輕接觸皮膚，此時(shí)刺手手指稍微放松，進(jìn)行緩慢地捻轉(zhuǎn)，在停止捻轉(zhuǎn)時(shí)捏緊針柄；③如此捻捻停停，停停捻捻，在捻轉(zhuǎn)的同時(shí)稍稍施加壓力，將針捻入；④捻入皮膚后繼續(xù)捻轉(zhuǎn)以尋找針感，直到預(yù)定的深度。施針者在操作全程中要保持注意力集中，刺手穩(wěn)定，以防止偏離穴位或用力不當(dāng)。朱璉將上述步驟總結(jié)成4句口訣：“指實(shí)心清緊執(zhí)針，針尖刺穴近穩(wěn)輕；肘平腕舉手抬起，虛實(shí)交替捻入深”〔10〕。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為臟腑虛衰、陰陽失調(diào)、氣血虛損等是造成衰老的幾大原因。體表皮膚分布著大量的感覺神經(jīng)末梢，作用于皮膚的刺激通過感受器轉(zhuǎn)換成傳入神經(jīng)上的動(dòng)作電位〔25〕，經(jīng)脊神經(jīng)反射性地調(diào)整大腦皮質(zhì)功能，從而改善機(jī)體狀態(tài)與功能。朱璉緩慢捻進(jìn)法通過上述的操作，皮膚的末梢神經(jīng)獲得持續(xù)性刺激，產(chǎn)生皮膚感覺，通過淺感覺傳導(dǎo)通路〔26〕投射至大腦皮層，維持并改變大腦皮層的興奮狀態(tài)〔25〕，并通過控制神經(jīng)遞質(zhì)和自主神經(jīng)〔25〕，從而激活、調(diào)動(dòng)神經(jīng)功能，使全身的經(jīng)脈和臟腑都能接受到神經(jīng)信號(hào)的刺激，各臟腑、經(jīng)脈的功能慢慢恢復(fù)，繼而氣血充盛、陰陽調(diào)和，從而達(dá)到延緩衰老的作用。

此外，本研究選用了常規(guī)的保健穴“關(guān)元”和“足三里”。兩穴一陰一陽，相輔相成，起到了補(bǔ)益氣血，益腎固元，調(diào)整陰陽的作用。“關(guān)元”和“足三里”合用，能夠抗自由基氧化，延緩衰老已在多項(xiàng)研究中被證實(shí)〔6，8，21,27～30〕。

綜上，朱璉緩慢捻進(jìn)法可以有效調(diào)整亞急性衰老模型大鼠血清中SOD活性及肝組織中 SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量，對(duì)衰老模型大鼠具有顯著的防治作用，提示朱璉緩慢捻進(jìn)法延緩衰老的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SOD代謝相關(guān)；使用朱璉緩慢捻進(jìn)法和普通針刺對(duì)衰老進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)的效果優(yōu)于治療性干預(yù)；朱璉緩慢捻進(jìn)法對(duì)衰老模型大鼠的防治作用優(yōu)于普通針刺。