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    miR-199a靶向調(diào)控TAB2調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞抑制深靜脈血栓形成

    2022-07-30 03:35:30牛帥裴月穎唐雷丁殿柱
    中國老年學(xué)雜志 2022年14期
    關(guān)鍵詞:祖細(xì)胞內(nèi)皮試劑盒

    牛帥 裴月穎 唐雷 丁殿柱

    (河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050000)

    下肢深靜脈血栓(DVT)是指由于深靜脈內(nèi)血液發(fā)生非正常凝集而引起的靜脈管腔阻塞,導(dǎo)致血液回流障礙而形成的一種血栓,多發(fā)于下肢〔1〕。DVT發(fā)病范圍廣,且發(fā)病原因復(fù)雜,慢性期DVT由于靜脈瓣膜功能損傷易導(dǎo)致血栓形成后綜合征(PTS),而急性期DVT易并發(fā)致死性肺栓塞(PTE),嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至生命健康〔2,3〕。目前,溶栓治療仍是臨床上用于治療DVT的主要方法〔4〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞,在病理因素刺激下,可從骨髓動員到外周參與損傷血管的修復(fù),促進(jìn)EPCs發(fā)揮功能有利于治療DVT〔5〕。miRNAs是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一種高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等多個生理過程〔6〕。且有研究表明相關(guān)miRNA可參與DVT的血栓溶解再通過程〔7,8〕。本研究發(fā)現(xiàn)DVT大鼠EPCs中miR-199a表達(dá)量異常,提示miR-199a在DVT病理過程中可能發(fā)揮重要作用,因此對miR-199a在DVT內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)和功能及其可能作用機(jī)制進(jìn)行探究。

    1 材料方法

    1.1主要試劑 6~8周齡雄性SD大鼠及血栓模型大鼠均購自北京維通利華有限公司;DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清及雙抗購自Gibco公司;SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、RNAiso試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自Takara公司;熒光標(biāo)記的乙?;兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)試劑購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、大鼠臟器組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒購自Solarbio公司;Transwell小室購自Corning公司;基質(zhì)膠購自上海浩然生物技術(shù)有限公司;紅蛋白標(biāo)記蛋白ACD133抗體(CD133-PE-A)、熒光素APC標(biāo)記重組純化蛋白A血管內(nèi)皮生長因子受體2抗體(VEGFR-2-APC-A)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長因子受體2抗體(VEGFR-2-FITC)、接頭蛋白(TAB2)抗體購自Abcam公司;RIPA裂解液、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記熒光二抗、乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶購自Sigma公司;熒光素酶報告基因檢測試劑盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)工作液購自碧云天公司;si-NC質(zhì)粒、si-TAB2質(zhì)粒由上海生工生物工程有限公司合成;miR-199a模擬物(mimics)、miR-199a抑制劑(inhibitor)及miR-199a激動劑(agomir)均由吉瑪基因設(shè)計合成。

    1.2EPCs分離培養(yǎng) 參照Brice等〔9〕的分離培養(yǎng)方法及大鼠臟器組織淋巴細(xì)胞分離液試劑盒說明書進(jìn)行EPCs的分離和培養(yǎng),頸椎脫臼法處死SD大鼠后,分離雙側(cè)股骨和脛骨,用含有10%胎牛血清(FBS)的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,剪除骨骺端以暴露骨髓腔,勻漿沖洗液沖洗骨髓腔,收集含骨髓細(xì)胞的沖洗液,過濾后離心棄上清,樣本稀釋液重懸細(xì)胞備用。取6 ml組織淋巴細(xì)胞分離液于15 ml離心管中,緩慢加入細(xì)胞懸液,2 000 r/min離心30 min,離心后細(xì)胞分為三層,吸取中層細(xì)胞接種于6孔板中置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h后更換為含有20% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3EPCs鑒定 取培養(yǎng)至第7天的EPCs細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2次,胰酶消化后收集至15 ml離心管中,800 r/min離心10 min,棄上清,PBS沖洗3次后用100 μl重懸。將制得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入流式細(xì)胞儀的上樣管中,分別加入10 μl熒光標(biāo)記的CD133-PE-A抗體和VEGFR-2-APC-A抗體,4℃避光孵育90 min加入500 μl PBS,1 500 r/min離心10 min,棄上清,300 μl標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶牛血清白蛋白(BSA)重懸細(xì)胞,置于流式細(xì)胞儀檢測表面抗原CD133和VEGFR-2的表達(dá)。

    免疫熒光鑒定:將EPCs細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中(孔內(nèi)提前放入爬片),待細(xì)胞長滿單層的80%后進(jìn)行試驗。棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,每次間隔5 min。每孔加入400 μl 4%多聚甲醛,室溫固定15 min。棄掉多聚甲醛,立即加入1 ml預(yù)冷的甲醇,室溫透化10 min。PBS洗滌3次,加入300 μl 5%BSA溶液,4℃過夜封閉。棄掉封閉液,加入300 μl按1∶300稀釋的VEGFR-2-FITC抗體,避光溫育1 h。棄掉抗體,每孔加入400 μl按1∶10稀釋的DAPI染料,避光作用15 min。棄掉DAPI,PBS洗滌3次,將爬片轉(zhuǎn)移至載玻片上,置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

    1.4qRT-PCR 參照RNAiso試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后以其作為模板并按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),同時選擇U6作為內(nèi)參,每個樣本均進(jìn)行3次獨立重復(fù)檢測,取平均值利用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計分析。miR-199a所用引物序列〔10〕為:正義鏈:5′-TCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′;反義鏈:5′-TCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′。U6引物序列為:正義鏈:5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′;反義鏈:5′-TACCTYGCGAAGTGCTAAAC-3′。

    1.5電穿孔轉(zhuǎn)染法 收集生長至對數(shù)期細(xì)胞,PBS清洗2次,胰酶消化細(xì)胞,完全培養(yǎng)基終止消化后收集至15 ml離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,用轉(zhuǎn)染試劑減血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)重懸細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液并計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為4×108/L,隨機(jī)分為4組,分別為轉(zhuǎn)染miR-199a mimics組和轉(zhuǎn)染miR-199a inhibitor組及NC-mimics組和NC-inhibitor組。

    miR-199a mimics組和NC-mimics組轉(zhuǎn)染:取50 μl細(xì)胞懸液,分別與10 μl miR-199a mimics和10 μl NC-mimics充分混勻,按照脈沖20 ms,電阻90 Ω,電壓150 V的條件電擊細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后,通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

    miR-199a inhibitor組和NC-inhibitor組轉(zhuǎn)染:方法同上,將miR-199a mimics和NC-mimics替換為miR-199a inhibitor和NC-inhibitor。

    1.6Transwell試驗測定遷移能力 將Transwell小室置于24孔板上,37℃溫育。向下室中加入600 μl完全培養(yǎng)基,上室中分別加入100 μl無血清培養(yǎng)基懸浮的各組細(xì)胞,細(xì)胞密度以2×105/ml為宜。培養(yǎng)24 h后,取出小室,棄掉上室液體,甲醇固定30 min后吉姆薩(Giemsa)室溫染色15~30 min,PBS洗滌3次,顯微鏡下觀察拍照,測定細(xì)胞遷移能力。

    1.7基質(zhì)膠成管試驗 試驗前24 h將基質(zhì)膠置于4℃冰箱過夜,使基質(zhì)膠緩慢融化。轉(zhuǎn)染的各組EPCs細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后制備密度為2×105/ml的細(xì)胞懸液,取50 μl細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的24孔板中,培養(yǎng)8 h后置于顯微鏡下采集圖像,觀察血管形成情況。

    1.8Western印跡 收集各組EPCs細(xì)胞,加入現(xiàn)配的裂解液,冰浴30 min。超聲破碎,4℃ 12 000 r/min離心10 min,收集上清測定蛋白濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),65 V恒壓電泳30 min后更換為120 V至電泳結(jié)束,恒流250 mA轉(zhuǎn)印2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉2 h。加入1∶1 000稀釋的TAB2抗體,室溫孵育4~6 h,TBST洗膜3次,每次10 min。加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記熒光二抗孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min。在Bio-Rad膜成像系統(tǒng)下顯色并分析結(jié)果。

    1.9熒光素酶報告試驗 按照試劑盒說明書分別擴(kuò)增TAB2-WT和TAB2-MUT目的基因片段,電泳鑒定后切膠回收,根據(jù)試劑盒說明書中的酶切體系,對目的基因和連接載體進(jìn)行酶切,酶切后對產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。然后根據(jù)連接體系進(jìn)行連接,構(gòu)建含有熒光素酶報告基因標(biāo)記的TAB2-WT 3′非編碼區(qū)(UTR)及TAB2-MUT 3′UTR重組質(zhì)粒,參照1.5中的轉(zhuǎn)染方法將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

    將轉(zhuǎn)染TAB2-WT 3′UTR重組質(zhì)粒組細(xì)胞隨機(jī)分為4組,分別再轉(zhuǎn)染miR-199a mimics、NC-mimics、miR-199a inhibitor及NC-inhibitor質(zhì)粒,再進(jìn)行后續(xù)試驗。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液后直接加入充分混勻的報告基因細(xì)胞裂解液以充分裂解細(xì)胞,33 334 r/min離心5 min,取上清用于測定。按照說明書配制熒光素酶檢測工作液,取100 μl裂解后細(xì)胞樣品,加入100 μl熒光素酶檢測試劑,吹打混勻后置于熒光測定儀下測定各組RLU。轉(zhuǎn)染TAB2-MUT 3′UTR重組質(zhì)粒組試驗方法同上。

    1.10EPCs移植 選取30只大鼠建立DVT模型,飼養(yǎng)至15 d后分為3組:Blank組、EPCs/vector組和EPCs/miR-199a agomir組,每組10只,移植所用的EPCs事先用VEGFR2-FITC熒光抗體對其表面VEGFR2受體進(jìn)行標(biāo)記。移植后14 d,將大鼠麻醉后開腹,分離其下腔靜脈,在血栓上下靜脈段夾閉血管,剖開管腔,取出血栓后置于烘箱中烘干后稱量血栓重量并做好記錄。

    1.11HE染色 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行HE染色。將取下的血栓投入10%甲醛中進(jìn)行固定,固定后置于包埋盒中流水沖洗30 min,置于酒精中脫水處理后再置于二甲苯中透明,之后浸蠟包埋再進(jìn)行切片。將烤干的切片置于二甲苯中脫蠟10 min。依次置于100%、95%、85%、70%酒精中各2 min,移入水中3 min以洗去酒精,再移入蒸餾水中2 min。蘇木素染液染色10~15 min,洗去多余染液,置于1%鹽酸酒精中分化10 s,流水沖洗30 min。伊紅染液浸染5 min,洗去多余染液。而后依次置于70%、85%、95%、100%酒精中脫水各2 min。移入二甲苯中透明2次,時間共約10 min。擦去多余二甲苯,迅速滴加中性樹膠封片,平置晾干后進(jìn)行觀察。

    1.12統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

    2 結(jié) 果

    2.1EPCs的鑒定 培養(yǎng)3 d后,倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(tài),發(fā)現(xiàn)EPCs集落呈圓形,并形成中心簇(圖1A),流式細(xì)胞儀檢測顯示第14天EPCs表達(dá)干細(xì)胞表面抗原VEGFR-2和CD133(圖1B),免疫熒光方法檢測細(xì)胞表面標(biāo)記VEGFR-2,結(jié)果顯示,絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮表面標(biāo)志物VEGFR-2,且VEGFR-2主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(圖1C)。

    A.倒置顯微鏡下觀察EPCs形態(tài)(免疫熒光,×400);B.流式細(xì)胞儀檢測第14天EPCs干細(xì)胞表面抗原VEGFR-2和CD133的表達(dá);C.免疫熒光方法檢測EPCs表面標(biāo)記VEGFR-2(×400)圖1 EPCs的鑒定

    2.2miR-199a在DVT大鼠EPCs中表達(dá) qRT-PCR檢測DVT大鼠和正常組SD大鼠分離的EPCs細(xì)胞中miR-199a表達(dá)(0.24±0.02 vs 0.98±0.05),結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-199a在DVT大鼠中表達(dá)顯著下調(diào)(t=33.660,P<0.05,n=6)。

    2.3miR-199a促進(jìn)EPCs細(xì)胞遷移和血管形成 miR-199a mimics組miR-199a表達(dá)顯著高于NC-mimics組,miR-199a inhibitor組miR-199a表達(dá)顯著低于NC-inhibitor組(P<0.05)。miR-199a mimics組遷移能力和血管形成能力顯著高于NC-mimics組,miR-199a inhibitor組遷移能力和血管形成能力顯著低于NC-inhibitor組(P<0.05)。見表1、圖2、圖3。

    表1 miR-199a 促進(jìn) EPCs 細(xì)胞遷移、血管形成及TAB2蛋白表達(dá)比較

    圖2 Transwell實驗檢測各組EPCs遷移能力(結(jié)晶紫染色,×200)

    圖3 基質(zhì)膠成管實驗檢測血管形成能力(×400)

    2.4TAB2是miR-199a的靶基因 生信網(wǎng)站targetscan預(yù)測TAB2 3′UTR存在與miR-199a結(jié)合的位點(圖4),熒光素酶報告實驗顯示,miR-199a可以與TAB2 3′UTR WT結(jié)合,顯著抑制熒光素酶活性(P<0.05);miR-199a mimics組TAB2蛋白表達(dá)明顯低于NC-mimics組,miR-199a inhibitor組TAB2蛋白表達(dá)明顯高于NC-inhibitor組(P<0.05)。見表1、圖5。

    圖4 TAB2 3′UTR存在與miR-199a結(jié)合的位點

    1~4:NC-mimics組、miR-199a mimics組、NC-inhibitor組、miR-199a inhibitor組圖5 敲減或過表達(dá)miR-199a后TAB2蛋白表達(dá)

    2.5miR-199a通過調(diào)控TAB2促進(jìn)EPCs細(xì)胞遷移和血管形成 miR-199a in+si-TAB2組TAB2表達(dá)顯著低于miR-199a in+si-NC組(P<0.05),遷移和血管形成能力比較,miR-199a in+si-TAB2組均顯著高于miR-199a in+si-NC組(P<0.05)。見圖6、表2、圖7、圖8。

    1~3:NC組、miR-199a in+si-NC組、miR-199a in+si-TAB2組圖6 TAB2蛋白表達(dá)

    表2 miR-199a 通過調(diào)控 TAB2 促進(jìn) EPCs 細(xì)胞遷移和血管形成

    圖7 Transwell實驗檢測各組EPCs遷移能力(結(jié)晶紫染色,×400)

    圖8 基質(zhì)膠成管實驗檢測血管形成能力(×400)

    2.6miR-199a調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞抑制深靜脈血栓形成 EPCs移植后第7天,EPCs示蹤結(jié)果顯示,EPCs/miR-199a agomir組大鼠的EPC歸巢明顯高于EPCs/vector組(P<0.05)。HE染色結(jié)果可見,與Blank組比較,EPCs/miR-199a agomir組和EPCs/vector組進(jìn)入血栓的有核細(xì)胞明顯增多,血栓外周區(qū)見少量紅細(xì)胞,逐漸形成官腔樣結(jié)構(gòu),機(jī)化程度較高,而與EPCs/vector組比較,EPCs/miR-199a agomir機(jī)化程度更高。與Blank組比較,EPCs/miR-199a agomir組和EPCs/vector組重量顯著減輕,而miR-199a agomir組重量顯著小于EPCs/vector組(P<0.05)。見圖9、圖10、表3。

    圖9 EPCs示蹤,熒光顯微鏡觀察各組熒光強(qiáng)度(×400)

    圖10 HE染色觀察各組血栓機(jī)化(×400)

    表3 miR-199a 調(diào)節(jié)內(nèi)皮組細(xì)胞抑制DVT形成

    3 討 論

    DVT是臨床上常見的外周血管疾病,其發(fā)病率雖然不高,但由于經(jīng)常繼發(fā)PTS而存在潛在死亡風(fēng)險,據(jù)統(tǒng)計,30%~40% DVT患者在治療后1~2年內(nèi)發(fā)生PTS,治療后5年內(nèi)PTS的發(fā)生率則超過50%〔11,12〕。目前,臨床上用于治療DVT采用的方法主要為藥物抗凝或溶栓治療,但對于慢性期DVT治療效果不理想,因此,尋找一種更為有效的治療慢性期DVT的方法是當(dāng)前研究的重點。血栓機(jī)化再通的關(guān)鍵在于使血栓內(nèi)的血管新生,EPCs是一群具有游走性,能進(jìn)一步增殖分化的幼稚內(nèi)皮細(xì)胞,主要參與血管發(fā)生及血管損傷后修復(fù)等過程,研究發(fā)現(xiàn)外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞可歸巢到DVT促進(jìn)血栓內(nèi)血管新生、血栓溶解和再通〔13,14〕,應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞治療DVT不失為一種具有廣闊應(yīng)用前景的新方法。但外周血中EPCs含量很少,在VEGF等外源性細(xì)胞因子或血管損傷等內(nèi)源性因素刺激下骨髓中EPCs動員至外周血循環(huán)中,而如何促進(jìn)外周血中EPCs遷移及增強(qiáng)其歸巢至DVT中的能力是治療DVT的關(guān)鍵。miRNA是一類普遍存在于細(xì)胞中的長度為18~25 nt的非編碼小分子RNA,在基因轉(zhuǎn)錄后水平上與靶mRNA結(jié)合,降解或抑制mRNA的翻譯,發(fā)揮對多種蛋白的表達(dá)調(diào)控作用〔15〕。miR-199a家族廣泛存在于人體組織中,研究表明miR-199a在多種腫瘤組織中異常表達(dá),除參與腫瘤細(xì)胞的生長增殖、凋亡、分化與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程之外,還可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的血管生成過程〔16,17〕。本研究發(fā)現(xiàn),miR-199a在DVT大鼠EPCs中表達(dá)異常,采用過表達(dá)和抑制EPCs中miR-199a表達(dá)的研究策略發(fā)現(xiàn)miR-199a可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、血管形成及歸巢至DVT中,有利于內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)揮功能抑制DVT。

    經(jīng)典Wnt信號通路可通過調(diào)節(jié)β-catenin-LEF1/TCFs轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成而影響下游基因的表達(dá)變化,可參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等進(jìn)而調(diào)控許多疾病過程〔18〕。莫建文等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路可參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能,對Wnt信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行干預(yù),可能減輕血栓的嚴(yán)重程度甚至終止血栓的形成。Li等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路受到多種分子和信號途徑的調(diào)節(jié),其中TAK1-NLK非經(jīng)典MAPK激酶途徑就是通過抑制β-catenin-LEF1/TCFs轉(zhuǎn)錄復(fù)合物來影響Wnt信號通路在細(xì)胞分化及發(fā)育等過程中的功能。然而,盡管TAK1能激活NLK分子的激酶活性,但二者之間并沒有直接的相互作用,表明二者之間的信號傳遞需要依賴其他分子的協(xié)助。該研究還發(fā)現(xiàn)TAK1的一個結(jié)合蛋白TAB2可直接并特異性的結(jié)合NLK,TAB2可作為一種“腳手架蛋白”連接TAK1和NLK形成復(fù)合物,從而引起二者之間的間接相互作用。TAB2通過這種方式促進(jìn)TAK1對NLK的激活,導(dǎo)致NLK底物L(fēng)EF1/TCFs分子的磷酸化而抑制其轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而對Wnt信號通路發(fā)揮抑制作用。本研究通過生信網(wǎng)站targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)TAB2蛋白的3′UTR存在與miR-199a的結(jié)合位點。在轉(zhuǎn)染miR-199a抑制劑的EPCs中利用小干擾RNA技術(shù)敲減TAB2表達(dá)后,EPCs遷移和血管形成能力顯著增高,且過表達(dá)miR-199a后可有效促進(jìn)DVT的機(jī)化再通,進(jìn)一步證實了miR-199a通過靶向TAB2調(diào)節(jié)EPCs發(fā)揮生物學(xué)功能。

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