趨化素樣因子超家族成員6與老年冠心病發(fā)生風險的相關(guān)性

張艷杰 侯樹慧 王彩霞 劉鵬妹

(1包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2包頭市第四醫(yī)院)

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國冠心病患者達1 100萬例，其中以老年患者為主，且患病率和死亡率呈上升趨勢〔1〕。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程〔2〕。單核細胞聚集、浸潤是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟，單核細胞在血管內(nèi)膜表面黏附，之后向主動脈內(nèi)皮細胞遷移，分化成巨噬細胞，最終形成泡沫細胞〔3〕。相關(guān)研究顯示，趨化因子調(diào)控單核細胞的聚集活性，趨化素樣因子超家族成員(CKLFSF)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4〕，CKLFSF6基因是成員之一，目前關(guān)于其表達水平與老年冠心病發(fā)生風險關(guān)系的研究仍未見系統(tǒng)研究報道。本研究擬分析CKLFSF6與老年冠心病發(fā)生風險的相關(guān)性，并使用人主動脈內(nèi)皮細胞(HAEcs)和人單核細胞(THP-1)在體外進行細胞學研究，探討CKLFSF6在冠心病發(fā)生中的相關(guān)機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2019年3月至2020年5月在包頭市第四醫(yī)院行冠狀動脈造影檢查的老年患者158例。其中右冠脈、左前降支、左回旋支及主要分支中1支及以上狹窄程度>50% 88例為研究組，未達到上述標準的非冠心病患者70例為對照組。排除標準：合并感染性疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、甲狀腺疾病者。納入受試者均自愿參與本研究，簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 HAEcs和THP-1均購于北京諾為生物有限公司。胎牛血清、RPMI1640細胞培養(yǎng)基購于北京沃卡威生物有限公司；Transwells小室購于上海玉博生物有限公司；Trizol總RNA抽提試劑盒購于上海百研生物有限公司；鼠抗人血管細胞黏附因子單克隆抗體、鼠抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及相應的二抗購于北京沃卡威生物有限公司。

1.3資料收集和實驗室指標檢測 收集患者的人口學特征及吸煙史、合并糖尿病、合并高血壓情況。采集兩組清晨空腹外周靜脈血5 ml，取3 ml在室溫條件下3 000 r/min離心10 min，分裝血清和血漿，-80℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平及血漿CKLFSF6 蛋白表達水平。取剩余的2 ml空腹外周靜脈血，Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行熒光定量PCR反應，CKLFSF6引物序列由北京中科瑞泰生物有限公司設(shè)計、合成，CKLFSF6上游引物：5′-GAGTTGACTTAACGCTGAGTGCTGTCTCAAC-3′，下游引物：5′-TGCGTTTAAGCACTTCGAAACGACTGCTTTG-3′。β-actin上游引物：5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCTATCGTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGCATAGGTGCAC-3′。反應條件：94℃ 40 s，60℃ 30 s，95℃ 40 s，60℃ 10 s。取4 μl擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測CKLFSF6 mRNA表達水平。

1.4細胞培養(yǎng) HAEcs和THP-1均接種于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞密度為1×105個/瓶，使用含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入離心管中，4℃恒溫2 000 r/min離心10 min，去上清后將細胞懸液混勻，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.5細胞轉(zhuǎn)染 過表達和低表達CKLFSF6腺病毒由武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司包裝。按1×105個/孔的密度將HAEcs接種至6孔板中，37℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞80%以上融合時轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率>90%時用于后續(xù)實驗。分為正常對照組(不轉(zhuǎn)染，僅常規(guī)培養(yǎng))、過表達CKLFSF6組(腺病毒轉(zhuǎn)染過表達CKLFSF6質(zhì)粒)及低表達CKLFSF6組(腺病毒轉(zhuǎn)染低表達CKLFSF6質(zhì)粒)。

1.6細胞遷移實驗 將3組HAEcs細胞分別接種于Transwell下室，細胞數(shù)為5×104個，加入RPMI1640細胞培養(yǎng)液至600 μl，培養(yǎng)至細胞完全貼壁生長。將THP-1接種于Transwell上室，細胞數(shù)為5×104個，加入RPMI1640細胞培養(yǎng)液至200 μl，37℃ 5%CO2培養(yǎng)12 h，取出Transwell上室，10%多聚甲醛溶液固定后染色，光學顯微鏡下觀察細胞個數(shù)。

1.7細胞黏附實驗 將3組HAEcs接種至6孔板中，細胞密度為2×105個/孔，4℃ 5%CO2培養(yǎng)12 h，棄去細胞培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆谩ＨHP-1適量，加入離心管中，4℃恒溫2 000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)液和10 mmol/L鈣黃綠素，避光靜置30 min，洗滌后行細胞計數(shù)。將THP-1鋪于含HAEcs的6孔板中，細胞密度為2×105個/孔，避光靜置2 h，棄去細胞培養(yǎng)液，洗滌后加入適量RPMI1640細胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細胞個數(shù)。

1.8Western印跡檢測HAEcs中血管細胞黏附因子和E-選擇素蛋白表達水平 RIPA裂解液提取3組HAEcs總蛋白，定量后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目標蛋白，帶電濕法轉(zhuǎn)膜后封閉，滴加稀釋倍數(shù)為1∶300的鼠抗人血管細胞黏附因子單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶500的鼠抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶1 000的鼠抗人β-actin單克隆抗體，4℃過夜，滴加稀釋倍數(shù)為1∶2 000的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫反應2 h，E-Gel Imager凝膠成像分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組人口學特征和血脂指標比較 研究組吸煙史、糖尿病、高血壓比例及總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組男性比例、年齡、體重指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組CKLFSF6 mRNA和血漿蛋白表達比較 研究組CKLFSF6 mRNA表達、CKLFSF6血漿蛋白表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表1 兩組人口學特征和臨床指標比較

表2 兩組CKLFSF6 mRNA和血漿蛋白表達比較

2.3老年冠心病發(fā)生風險的多因素Logistic回歸分析 以老年人群中是否發(fā)生冠心病為因變量，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義的因素為自變量，進行多因素Logistic回歸分析顯示，吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF6基因表達是冠心病發(fā)生的獨立影響因素(P<0.05)，見表3。

2.4各組細胞遷移和黏附能力比較 過表達CKLFSF6組THP-1細胞遷移數(shù)量和黏附數(shù)量明顯高于正常對照組，低表達CKLFSF6組明顯低于正常對照組(P<0.01)。見表4。

表3 老年冠心病發(fā)生風險的多因素Logistic回歸分析

表4 各組THP-1細胞遷移數(shù)量及HAEcs中血管細胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達水平比較

2.5各組HAEcs中血管細胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達比較 過表達CKLFSF6組血管細胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達明顯高于正常對照組，低表達CKLFSF6組明顯低于正常對照組(P<0.01)。見表4，圖1。

1～3：正常對照組、過表達CKLFSF6組、低表達CKLFSF6組圖1 Western印跡檢測各組HAEcs中血管細胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達水平

3 討 論

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，動脈血管管壁的慢性炎癥反應會導致動脈粥樣硬化，早期表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、血管壁單核細胞黏附聚集〔5〕。近年來研究顯示，冠心病的發(fā)生與發(fā)展是遺傳、環(huán)境、基礎(chǔ)疾病等多種因素共同作用的結(jié)果，老年人是冠心病高發(fā)群體〔6〕。隨著分子生物學技術(shù)和基因工程領(lǐng)域的快速發(fā)展，在基因?qū)用嫔详U述冠心病、糖尿病、高血壓、腫瘤等慢性病的發(fā)病機制已成為目前研究熱點〔7,8〕。CKLFSF的研究最早出現(xiàn)在腫瘤領(lǐng)域，已得出其作為抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲等過程的結(jié)論〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，CKLFSF2B基因多態(tài)性與冠心病發(fā)展密切相關(guān)〔10〕；CKLFSF5基因表達與冠心病患者介入治療后心血管事件和血小板高反應性相關(guān)〔11〕。但目前關(guān)于CKLFSF6基因表達對冠心病發(fā)生風險的影響及相關(guān)機制研究仍十分少見。

本研究結(jié)果顯示，吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF6基因表達是冠心病發(fā)生的獨立影響因素。煙草中含有一氧化碳、焦油、尼古丁等多種化學物質(zhì)和致癌成分，對血管的刺激較大，易造成血管損傷，引發(fā)冠心病〔12〕。糖尿病患者體內(nèi)長期高血糖狀態(tài)會危害人體多個臟器的正常功能，其中對心、腦、腎臟的危害最明顯〔13〕。長期高血壓狀態(tài)也會加速心腦血管病變，臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者中冠心病發(fā)生風險較血壓正常者升高約4倍〔14〕。CKLFSF6基因表達是冠心病發(fā)生的獨立影響因素，提示CKLFSF6基因可能參與調(diào)控冠心病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果提示CKLFSF6基因過表達能夠促進動脈粥樣硬化的發(fā)生與進展。

血管細胞黏附因子定位于血管內(nèi)皮細胞膜上，內(nèi)毒素、炎癥反應、細胞因子能夠誘導其表達〔15〕；配體與α4β1整聯(lián)蛋白結(jié)合后可促使白細胞穿過血管壁到達炎癥部位，與B細胞、T細胞發(fā)生相互作用〔16〕。E-選擇素主要表達于活化的內(nèi)皮細胞表面，能夠介導白細胞透過血管壁進入全身炎癥區(qū)域，與動脈粥樣硬化斑塊形成、凝血過程、多發(fā)性硬化等病理過程密切相關(guān)〔17〕。本研究結(jié)果顯示，CKLFSF6基因高表達可通過上調(diào)血管細胞黏附因子和E-選擇素表達，促進THP-1的遷移、黏附，誘導HAEcs增殖，促進冠心病的發(fā)生與發(fā)展。本研究為CKLFSF6基因與老年冠心病發(fā)生風險關(guān)系的研究提供了新的參考依據(jù)。