補(bǔ)腎化痰復(fù)方對多囊卵巢綜合征大鼠的作用機(jī)制研究

蔡昭煒 何少娟 劉容菊 劉華楨

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌代謝紊亂疾病之一［1］。PCOS 的臨床表現(xiàn)與高雄激素血癥密切相關(guān),同時受多個信號通路及生物機(jī)制的調(diào)控,如PI3K/AKT 等［2,3］。大量研究已經(jīng)證實,PCOS 是與胰島素抵抗(IR)存在密切關(guān)系的臨床綜合征［4］,在機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗時,某些相關(guān)信號通路被抑制,隨后產(chǎn)生一系列生物反應(yīng)致使葡萄糖上升。補(bǔ)腎化痰復(fù)方是由黃茂、仙靈脾、蒼術(shù)、茯苓、丹參、黃連由組成,可用來補(bǔ)腎陰陽、化痰軟堅,主治下丘腦-垂體功能失調(diào)而卵巢略大的閉經(jīng)［5］。目前的研究已顯示該方不僅具備補(bǔ)腎化痰等功能,還具備降血糖、改善卵巢異常癥狀等功能［6］,盡管這樣,其中通路和機(jī)理具體的聯(lián)系和效果作用仍需要科研的繼續(xù)探索證實。卵巢顆粒細(xì)胞的增殖是多囊卵巢綜合征內(nèi)分泌代謝紊亂的首要特征［7］,卵巢顆粒細(xì)胞的活躍狀態(tài)直接表現(xiàn)了其病癥的嚴(yán)重程度,經(jīng)文獻(xiàn)和前期研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎化痰復(fù)方中藥單體能通過抑制相關(guān)通路誘導(dǎo)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡［8,9］,這也就說明了該方或許能夠影響大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的增殖情況,通過調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的增殖減緩PCOS,其具體的作用效果和生物機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。本實驗通過補(bǔ)腎化痰復(fù)方干預(yù)PCOS 大鼠模型,觀察補(bǔ)腎化痰復(fù)方對大鼠內(nèi)分泌相關(guān)生化指標(biāo)水平變化、胰島素抵抗以及大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響,探究補(bǔ)腎化痰復(fù)方是否能夠通過調(diào)控胰島素分泌以及抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖對PCOS 大鼠產(chǎn)生積極的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 采用陰道涂片篩選出80 只動情周期正常的雌性大鼠,均為SPF 級SD 大鼠,7～8 周齡,體重180～200 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,該實驗所有處理方法均經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為Ctrl組、PCOS組、低劑量組、高劑量組,每組20 只。

1.2 方法 ①模型構(gòu)建：所有動物均喂飼普通飼料,正常飲水。每天早上9 點灌胃1 次,PCOS組、低劑量組、高劑量組建立PCOS 大鼠模型,采用來曲唑聯(lián)合高脂乳劑灌服,造模連續(xù)28 d；Ctrl組采用同種方式加入等體積蒸餾水。②干預(yù)方式：造模成功后,低劑量組、高劑量組分別給藥補(bǔ)腎化痰復(fù)方60、120 mg/kg,PCOS組、Ctrl組采用同種方式加入等體積蒸餾水。③檢測方法：實時監(jiān)測各組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平；通過監(jiān)測各組大鼠禁食180 min 血糖變化檢測其胰島素耐量；利用CCK-8 測定各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況。

CCK-8 測定各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況具體操作：卵泡液的收集和顆粒細(xì)胞的純化方法以密度梯度離心法為基礎(chǔ),具體步驟如下：①嚴(yán)格遵照正確取卵方式,通過穿刺方式得到卵母細(xì)胞-放射冠細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體,接著整理保存依附著卵巢顆粒細(xì)胞的卵泡液；②卵泡液分離：2000 r/min,10 min,半徑11.6 cm,去除上部分液體；③余下液渣和絮亂物則是1 ml 濃度為0.2%的透明質(zhì)酸酶重懸,37℃水浴溫?zé)?0 min；④沉淀物捏聚,并小心穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到已備好的15 ml 無菌離心管,離心管已做好預(yù)備工作(加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液),2000 r/min,10 min,半徑11.6 cm；⑤中央白灰色固態(tài)懸浮物細(xì)胞團(tuán)便是顆粒細(xì)胞,用針管抽取到1.5 ml 離心管中,再用1×PBS 溶液清洗1 遍,-80℃永久保存。收集上述細(xì)胞后,進(jìn)行試驗的分組：正常組、補(bǔ)腎化痰復(fù)方低、中、高組。正常組給予含0%含藥血清RPMI-1640 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,補(bǔ)腎化痰復(fù)方低、中、高組分別給予濃度為含20%、40%、80%含藥血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞(104個細(xì)胞/孔)接種到96 孔板中,然后用不同濃度的PB2 (0、10、20、50、100 μM)處理48 h。接下來,依照CCK-8 法來進(jìn)行細(xì)胞增值活性程度計算。將10 μl CCK-8 溶液轉(zhuǎn)移至96 孔板的所有板孔。溫育3 h,經(jīng)酶標(biāo)儀450 nm 檢測細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度。

1.3 觀察指標(biāo) 比較四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平；禁食不同時間后ITT值；不同劑量補(bǔ)腎化痰復(fù)方組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素方差分析或秩和檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C和HDL-C 水平比較 PCOS組大鼠黃體酮、HDL-C 水平顯著低于Ctrl組,游離脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平高于Ctrl組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組黃體酮高于PCOS組,游離脂肪酸、LDL-C 低于PCOS組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；低劑量組TC、HDL-C 和TG 水平與PCOS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。高劑量組黃體酮、HDL-C 水平高于PCOS組,游離脂肪酸、LDL-C、TC、TG 水平低于PCOS組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1,圖1～4。

表1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比較()

表1 四組大鼠游離脂肪酸、黃體酮、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平比較()

注：與Ctrl組比較,aP＜0.05；與PCOS組比較,bP＜0.05

2.2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；禁食30 min,四組大鼠ITT 值均下降,低劑量組、Ctrl組大鼠ITT 值下降到最低值,而PCOS組則是禁食60 min 才達(dá)到最低值,之后開始增高；高劑量組禁食90 min ITT 值達(dá)到最低值,之后開始增高。在相同時間點,PCOS組大鼠ITT 值均高于Ctrl組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；高、低劑量組ITT 值與Ctrl組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；且高劑量組的ITT 值隨時間的變化幅度相較于低劑量組而言更小。見表2,圖5。

表2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較(,mmol/L)

表2 四組大鼠禁食不同時間后ITT 值比較(,mmol/L)

注：與Ctrl組比較,aP＜0.05

2.3 不同劑量補(bǔ)腎化痰復(fù)方組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖情況比較 0 μM組、10 μM組、50 μM組和100 μM組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞相對活性分別為(91.00±11.36)%、(63.33±8.74)%、(53.00±11.79)% 和(41.00±14.11)%,比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；10 μM組、50 μM組和100 μM組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞相對活性明顯低于0 μM組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),并且隨著劑量梯度升高,下降越顯著。見圖6。

3 討論

補(bǔ)腎化痰復(fù)方是結(jié)合中醫(yī)婦科理論所總結(jié)的治療脾腎陽虛痰濕型PCOS 的經(jīng)驗方。前期的研究和大量文獻(xiàn)證明,補(bǔ)腎化痰復(fù)方與PCOS 大鼠的信號通路相關(guān),并且經(jīng)通路調(diào)控胰島素分泌和抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖,對PCOS 有著積極的緩解作用［10-12］,但這些方面目前沒有動物實驗證實。

PCOS 是國內(nèi)研究的重心,近年來國內(nèi)越來越多的研究人員傾向?qū)⒅嗅t(yī)辨證思想融入頑疾的診治中,而國外卻鮮有用中藥治療PCOS 的實驗或研究。本實驗首次證明了PCOS 大鼠在補(bǔ)腎化痰復(fù)方的干預(yù)下,血清中的游離脂肪酸、黃體酮水平、TC、TG、LDL-C 和HDL-C 異常表達(dá)均得到緩解。在PCOS 大鼠中,黃體酮水平、HDL-C 和TG 的表達(dá)水平異常低,而游離脂肪酸水平、LDL-C 和TC 的水平異常高,說明了PCOS影響了大鼠的內(nèi)分泌情況,使大鼠的多項生化指標(biāo)處在一個異常的情況。而在補(bǔ)腎化痰復(fù)方的干預(yù)下,這些生化指標(biāo)均向正常大鼠的標(biāo)準(zhǔn)值靠近,這說明了補(bǔ)腎化痰復(fù)方緩解了PCOS 內(nèi)分泌的異常,使游離脂肪酸、LDL-C、TG 和TC 分泌降低,黃體酮、HDL-C 分泌增加。證實了補(bǔ)腎化痰復(fù)方可能有調(diào)整大鼠內(nèi)分泌穩(wěn)定的效果［13,14］。而在本實驗的胰島素耐量研究中,證實了補(bǔ)腎化痰復(fù)方顯著改善了PCOS 大鼠的胰島素耐量,具體表現(xiàn)為補(bǔ)腎化痰復(fù)方組的ITT 值隨時間的變化趨勢相較于PCOS組更穩(wěn)定。這說明了PCOS 影響了大鼠的胰島素抵抗能力,使胰島素耐量處于不穩(wěn)定的狀態(tài),而補(bǔ)腎化痰復(fù)方能夠改善PCOS 大鼠的胰島素抵抗異常情況。補(bǔ)腎化痰復(fù)方調(diào)控胰島素分泌緩解PCOS 的理論具有極大可能,但確切的證明仍需要進(jìn)一步研究。卵巢顆粒增殖情況與補(bǔ)腎化痰復(fù)方的關(guān)系也在本實驗中被證實,在不同濃度的補(bǔ)腎化痰復(fù)方干預(yù)下,PCOS 大鼠的卵巢顆粒增殖得到明顯抑制。證實了抑制卵巢顆粒細(xì)胞增殖活性極可能是補(bǔ)腎化痰復(fù)方緩解PCOS 的途徑之一,但具體的證明也需要下一步的研究。

綜上所述,大鼠患上PCOS 后體內(nèi)激素分泌異常、生理行為異常、胰島素分泌不足,導(dǎo)致卵巢顆粒增殖行為異?；钴S,而補(bǔ)腎化痰復(fù)方可能通過調(diào)控胰島素分泌改變其胰島素抵抗情況,并通過抑制其卵巢顆粒細(xì)胞增殖來改善生理活動異常。補(bǔ)腎化痰復(fù)方在PCOS中發(fā)揮著很大的作用,作為其特效藥有潛在的可能性和巨大的研究價值,以調(diào)控胰島素和抑制卵巢顆粒細(xì)胞治療PCOS 有一定的可行性,其具體作用機(jī)理有待研究。