LncRNA GAS5和miR-142-5p在慢性心力衰竭患者血清中表達(dá)及臨床意義

王建軍，郭瑩，張淑芳

慢性心力衰竭（慢性心衰）是各種心血管疾病的終末期表現(xiàn)和最主要死因[1]。隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及生活水平的提高，慢性心衰的發(fā)病率、死亡率逐年增加，成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的最大挑戰(zhàn)之一[2]。因此，尋找用于慢性心衰早期診斷及預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物十分重要。長鏈非編碼RNA生長停滯特異基因5（LncRNA GAS5）廣泛分布于胚胎及成人機(jī)體中，主要特點(diǎn)為優(yōu)先表達(dá)于生長停滯細(xì)胞中[3]。文獻(xiàn)報(bào)道，微小RNA-142-5p（miR-142-5p）可作為免疫疾病及腫瘤等疾病潛在的生物標(biāo)記物[4]。Du等[5]研究表明，LncRNA GAS5、miR-142-5p可影響缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷程度，但二者在慢性心衰中的作用仍需進(jìn)一步探究。因此，本研究通過檢測83例慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平，探討二者在早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的作用，以期為慢性心衰不良預(yù)后的早期預(yù)測提供參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年2月～2019年2月于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科住院治療的83例慢性心衰患者為慢性心衰組，年齡50～74歲，平均（62.83±9.46）歲，男性44例，女性39例；同期選取健康體檢者86例作為健康對(duì)照組，年齡51～74歲，平均（63.24±9.17）歲，男性46例，女性40例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2018年中國心衰診斷和治療指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②臨床病例資料齊全者；③研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書；④未伴有心臟瓣膜病、高血壓性心臟病、急性心肌梗死者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前1周內(nèi)使用過抗炎藥物、免疫抑制劑者；②伴有嚴(yán)重肝腎功能不全及血液系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)疾病者；③伴有感染性疾病及惡性腫瘤者；④6個(gè)月內(nèi)發(fā)生過腦卒中、急性腦血管意外者。

查閱門診及住院病歷，收集并整理患者一般資料，主要包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病。

1.2 主要試劑與儀器RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R1200-100）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號(hào)：KL266）；miScript SYBR? Green PCR試劑盒（德國QIAGEN公司，貨號(hào)：218073）。qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX384）；彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭飛利浦公司，型號(hào)：IE33）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存采集健康體檢者體檢當(dāng)天及慢性心衰患者入院第2 d晨起空腹靜脈血，經(jīng)3000 r/min離心15 min后收集血清，保存待測。

1.3.2 血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平測定采用試劑盒提取血清總RNA并反轉(zhuǎn)錄得cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀擴(kuò)增miR-142-5p、LncRNA GAS5及其內(nèi)參（U6和GAPDH），引物序列見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系共20 μl：cDNA模板（50 ng/μl）2 μl，miScript SYBR? Green Mix 10 μl，上下游引物（10 μM）各0.8 μl，ddH2O 6.4 μl。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算血清miR-142-5p、LncRNA GAS5相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 心功能指標(biāo)測定采用心臟超聲檢查心功能指標(biāo)左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）及左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.3.4 隨訪慢性心衰患者出院2年內(nèi)以門診、電話等方式隨訪，了解患者心源性死亡情況，隨訪時(shí)間截至2021年2月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；采用Pearson法分析慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平對(duì)慢性心衰的診斷價(jià)值；采用Kaplan-Meier法分析血清LncRNA GAS5、miR-142-5p表達(dá)與慢性心衰患者預(yù)后的關(guān)系，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，用Log-rank進(jìn)行生存曲線顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組與慢性心衰組一般資料比較健康對(duì)照組與慢性心衰組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表2。

表2 健康對(duì)照組與慢性心衰組一般資料比較

2.2 健康對(duì)照組與慢性心衰組血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平及心功能指標(biāo)比較慢性心衰組血清miR-142-5p水平、LVESD、LVEDD高于健康對(duì)照組，血清LncRNA GAS5水平、LVEF低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表3。

表3 健康對(duì)照組與慢性心衰組血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平及心功能指標(biāo)比較

2.3 慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性Pearson法分析結(jié)果顯示，慢性心衰患者血清LncRNA GAS5與miR-142-5p水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.647，P＜0.05），且LncRNA GAS5（miR-142-5p）與LVESD、LVEDD呈負(fù)（正）相關(guān)（P＜0.05），與LVEF呈正（負(fù)）相關(guān)（P＜0.05），圖1和表4。

圖1 慢性心衰患者血清LncRNA GAS5與miR-142-5p水平的相關(guān)性

表4 慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平與心功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平對(duì)慢性心衰的診斷價(jià)值以血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清LncRNA GAS5、miR-142-5p水平診斷慢性心衰的曲線下面積（AUC）分別為0.873（95%CI： 0.819～0.928）、0.896（95%CI：0.850～0.941），截?cái)嘀捣謩e為0.807、1.124，特異性分別為82.6%、72.1%，敏感度分別為84.3%、91.6%；二者聯(lián)合診斷的AUC為0.914（95%CI：0.872～0.955），特異性為79.1%，敏感度為92.8%，圖2。

圖2 血清LncRNA GAS5、miR-142-5p診斷慢性心衰的ROC曲線

2.5 血清LncRNA GAS5、miR-142-5p表達(dá)與慢性心衰患者預(yù)后的關(guān)系以LncRNA GAS5、miR-142-5p表達(dá)水平平均值（0.66、1.41）為界，將83例慢性心衰患者分為LncRNA GAS5高表達(dá)41例及LncRNA GAS5低表達(dá)42例；miR-142-5p高表達(dá)43例及miR-142-5p低表達(dá)40例。采用Kaplan-Meier法分析慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p表達(dá)與患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示LncRNA GAS5低表達(dá)患者2年生存率（57.14%）低于LncRNA GAS5高表達(dá)患者2年生存率（85.37%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；miR-142-5p高表達(dá)患者2年生存率（58.14%）低于miR-142-5p低表達(dá)患者2年生存率（85.00%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖3～4。

圖3 血清LncRNA GAS5表達(dá)與慢性心衰患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

慢性心衰主要臨床表現(xiàn)為器官組織血液灌注不足、體循環(huán)或肺循環(huán)淤血，它是一種各類心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的綜合征[7]。慢性心衰的發(fā)生發(fā)展伴隨著心肌細(xì)胞凋亡、損傷以及細(xì)胞間質(zhì)纖維化等過程，此類變化一般在血清學(xué)中表現(xiàn)出來[8]。慢性心衰在心血管疾病中占比不高，但其復(fù)發(fā)、心律失常、心源性死亡等不良預(yù)后發(fā)生率較高，給家庭及社會(huì)增加經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[9]。探究與慢性心衰相關(guān)的血清學(xué)標(biāo)志物，可能對(duì)個(gè)體化治療方案的選取有重要意義。

LncRNA參與機(jī)體生長、發(fā)育生命過程，在心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥厚中均有重要的調(diào)控作用[10]。LncRNA GAS5可通過影響心肌成纖維細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。尹魯平等[12]研究結(jié)果顯示，血清LncRNA GAS5表達(dá)水平與老年冠心病經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后發(fā)生支架內(nèi)再狹窄有關(guān)。miRNA可調(diào)控血管生成相關(guān)因子，影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管新生，參與冠心病、腦梗死等心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展[13]。miR-142-5p作為miR-142家族的一員，參與食管鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等人類多種疾病的發(fā)病過程[14,15]。徐瑞金等[16]研究結(jié)果表明，miR-142-5p有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。本研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，慢性心衰患者血清LncRNA GAS5表達(dá)水平降低、miR-142-5p表達(dá)水平升高，且二者呈負(fù)相關(guān)，本研究miR-142-5p表達(dá)趨勢與劉靜等[17]結(jié)果一致。提示LncRNA GAS5低表達(dá)、miR-142-5p高表達(dá)可能與慢性心衰的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Du等[5]研究中LncRNA GAS5可負(fù)調(diào)控miR-142-5p表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控心肌細(xì)胞損傷。推測本研究中LncRNA GAS5作為miR-142-5p的負(fù)性調(diào)節(jié)因素，其水平降低后miR-142-5p表達(dá)上調(diào)，從而對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活化增殖產(chǎn)生影響，加速心肌纖維化的進(jìn)展，進(jìn)而影響慢性心衰的發(fā)生發(fā)展。本研究中慢性心衰患者血清LncRNA GAS5、miR-142-5p與心功能指標(biāo)LVESD、LVEDD、LVEF呈一定的相關(guān)性，進(jìn)一步表明二者在心功能損傷中的作用。此外，LncRNA GAS5、miR-142-5p對(duì)慢性心衰的早期診斷及預(yù)后評(píng)估均有一定的價(jià)值，且LncRNA GAS5低表達(dá)、miR-142-5p高表達(dá)患者預(yù)后較差。當(dāng)LncRNA GAS5、miR-142-5p異常表達(dá)時(shí)，警示臨床工作中需及時(shí)采取針對(duì)性措施，避免患者發(fā)生心源性死亡。

圖4 血清miR-142-5p表達(dá)與慢性心衰患者預(yù)后的關(guān)系

綜上所述，血清LncRNA GAS5低表達(dá)、miR-142-5p高表達(dá)可能與慢性心衰疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。LncRNA GAS5、miR-142-5p不僅在慢性心衰早期診斷中有重要作用，還對(duì)其預(yù)后評(píng)估有重要價(jià)值，可能會(huì)成為慢性心衰潛在的治療靶點(diǎn)。但影響慢性心衰預(yù)后及LncRNA GAS5、miR-142-5p表達(dá)水平的因素較多，尚需進(jìn)行多中心、大樣本量的前瞻性研究進(jìn)行驗(yàn)證。