中鏈甘油三脂和共軛亞油酸復(fù)配食用油對大鼠脂肪囤積及認(rèn)知功能的影響

許藝飛，洪 銘，周 娜，尹西拳，操紅纓?

（1. 深圳市中醫(yī)院，廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3. 麥和（廣州）實業(yè)有限公司，廣東 廣州 510555）

功能性油脂如中鏈甘油三酯（MCT）、共軛亞油酸（CLA）、ω-3系列不飽和脂肪酸等已經(jīng)廣泛用于肥胖、心腦血管疾病治療中。其中，中鏈甘油三酯具有消化吸收快、快速供能等代謝特點[1-2]，除用于術(shù)后快速補(bǔ)給、為脂肪代謝障礙的患者和早產(chǎn)嬰兒提供能量等臨床應(yīng)用外[3]，近幾年其在健康食品以及養(yǎng)殖業(yè)[4]領(lǐng)域也具有廣泛應(yīng)用。共軛亞油酸是一種具有多生理功能的不飽和脂肪酸，可以通過影響細(xì)胞周期、促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡等來減少脂肪細(xì)胞數(shù)量，亦可通過降低PPARγ基因在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)而減少脂質(zhì)的積累[5]。ω-3系列不飽和脂肪酸如α-亞麻酸[6-7]、二十二碳六烯酸（DHA）[8-10]等在心腦血管健康、代謝健康等方面也具有非常高的應(yīng)用價值。

功能油脂對于肥胖的益處非常明顯，相關(guān)研究報道亦很多，但對于健康個體的研究報道較少。實際上，無論是在食品業(yè)還是養(yǎng)殖業(yè)，中鏈甘油三酯、不飽和脂肪酸等功能油脂用于健康個體的營養(yǎng)干預(yù)以及疾病預(yù)防則更為普遍。2020年Tyler Maher等[11]以MCT和CLA為受試物、以體重正常人群和肥胖人群為研究對象，評估MCT/CLA干預(yù)后兩種人群飽腹感及食欲的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCT介導(dǎo)的胃排空延遲、β-羥丁酸（β-HB）濃度的升高和胃饑餓素（ghrelin）濃度的抑制在健康體重和肥胖個體中作用趨勢類似，并且MCT對于健康體重個體胃排空延遲以及β-HB濃度的升高優(yōu)于其對肥胖個體的作用，該結(jié)果提示健康體重個體對于MCT可能更加敏感。

基于此，本試驗以健康體重大鼠為研究對象，在基礎(chǔ)飼喂條件下灌胃功能油脂，綜合考察功能油脂對健康體重大鼠脂肪囤積以及認(rèn)知功能的影響，并評估其對大鼠脂肪代謝以及部分器官功能的影響。本試驗選取中鏈甘油三酯、共軛亞油酸、富含α-亞麻酸的紫蘇籽油、富含DHA的藻油為試驗樣品，其中復(fù)合物MCT含量在47%～73%之間波動，以重點觀察MCT含量變化對于健康體重個體的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

70%中鏈甘油三酯粉末、60%共軛亞油酸酯粉末、50%紫蘇籽油粉末、10% DHA藻油粉、純豬油：麥和（廣州）實業(yè)有限公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒：北京四正柏生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HE染液、AB-PAS染色液：永津生物；中性樹膠：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司實驗所用水均為蒸餾水。

1.1.2 試驗動物

60只SD雄性大鼠，110～130 g，動物合格證號44822700002441，許可證SCXK（粵）2020-0051：珠海百試通生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海移數(shù)科技有限公司；脫水機(jī)JJ-12J、包埋機(jī)JB-P5：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)RM2016：上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機(jī)KD-P：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；烤箱GFL-230：天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司；全自動生化分析儀7080：日立；全波長酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗材料

中鏈甘油三酯粉末（純度70%）、共軛亞油酸酯粉末（60%）、紫蘇籽油粉末（50%）、DHA藻油粉（10%）、純豬油，為提高功能油脂的穩(wěn)定性、生物利用度以及更有利于動物給藥，本試驗以酪蛋白酸鈉、抗性糊精為主要輔料，將中鏈甘油三酯、共軛亞油酸、紫蘇籽油、DHA藻油進(jìn)行微囊化包裹處理，根據(jù)每種油脂特性及包裹率的差異分別制成不同含量的粉末，制備而成的粉末微囊粉具有水溶性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、生物利用度高等優(yōu)點。

1.3.2 試驗劑量

在食品行業(yè)為防止油脂攝入過多帶來的脂肪囤積風(fēng)險，相關(guān)法規(guī)規(guī)定了部分油脂的使用量，共軛亞油酸及其酯化物每日最大攝入量不超過6 g（國家衛(wèi)健委2021年第7號公告），DHA每日最大攝入量≤300 mg（原衛(wèi)生部2010年第3號公告），中鏈甘油三酯和紫蘇籽油無攝入量限制。本研究所用DHA藻油粉含10%DHA，也就是相當(dāng)于DHA藻油粉每日最大攝入量≤3 g，所以在本試驗“健康油脂組”中DHA藻油粉最大添加比例為30%。

粉末共軛亞油酸甘油酯含60%CLA，相當(dāng)于粉末共軛亞油酸甘油酯每日最大攝入量不超過10 g。共軛亞油酸每日限量為6 g，而研究[12]表明日攝入低于1 g即可起到抑制脂肪囤積的作用，食品行業(yè)出于安全、經(jīng)濟(jì)考量通?？刂泼咳諗z入量為1～3 g甚至更低，本試驗粉末共軛亞油酸最大添加量為“復(fù)合物高劑量組”3 g，即共軛亞油酸1.8 g。本試驗按照梯度濃度設(shè)計組別，選取日攝入量10 g進(jìn)行動物給藥折算。

60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、豬油組、健康油脂組、復(fù)配油脂低、中、高劑量組，共6組，每組10只，灌胃28 d。

對照組：按照動物體重1 mL/100 g灌胃蒸餾水。

豬油對照組：按照動物體重0.9 g/kg灌胃[13]。

健康油脂組（ω-3脂肪酸組）：取50%粉末紫蘇籽油、10% DHA藻油粉按照質(zhì)量比7∶3進(jìn)行混合，按照動物體重0.9 g/kg給藥。

復(fù)合油脂低劑量（MCT：47%）組：取70%粉末中鏈甘油三酯、60%粉末共軛亞油酸酯、50%粉末紫蘇籽油、10%DHA藻油粉按照質(zhì)量3.5∶1.5∶3.5∶1.5進(jìn)行混合，按照動物體重0.9 g/kg給藥。

復(fù)合油脂中劑量（MCT：60%）組：取70%粉末中鏈甘油三酯、60%粉末共軛亞油酸酯、50%粉末紫蘇籽油、10%DHA藻油粉按照質(zhì)量5∶2∶2∶1進(jìn)行混合，按照動物體重0.9 g/kg給藥。

復(fù)合油脂高劑量（MCT：73%）組：取70%粉末中鏈甘油三酯、60%粉末共軛亞油酸酯按照質(zhì)量比7∶3進(jìn)行混合，按照動物體重0.9 g/kg給藥。

1.4 一般情況

每3天記錄大鼠體重和攝食量，每天記錄飲水量，灌胃油脂每日現(xiàn)稱現(xiàn)用。最后一日，麻醉大鼠測量大鼠體長及體重，計算Lee’s指數(shù)。

1.5 水迷宮試驗

最后4天對各組大鼠進(jìn)行水迷宮測試。定向巡航試驗：連續(xù)進(jìn)行3天，試驗按照第I、III、IV象限的順序?qū)⒋笫竺嫦虺乇诜謩e從3個入水點放入水中，系統(tǒng)記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間（逃避潛伏期，Escape Latency，EL）。如大鼠在2 min內(nèi)未能找到平臺，則由試驗人員使用木棒將其引導(dǎo)至平臺水囊，讓大鼠停留10 s，在放回籠中。全部大鼠完成1個象限的測試后再進(jìn)行下一個象限的測試，直至完成所有測試。

空間探索試驗：于試驗的第4天，將平臺撤去，將大鼠放入水池中，記錄并分析2 min內(nèi)大鼠的游泳軌跡，統(tǒng)計數(shù)據(jù)包括：逃避潛伏期、平臺穿越次數(shù)、小鼠在中央?yún)^(qū)域游泳的路程和時間以及首次路過平臺前的路程。

1.6 脂肪情況

末次水迷宮試驗后，大鼠麻醉后腹主動脈取血，隨后分離并稱重腎周脂肪、腹部脂肪、附睪脂肪和心外膜脂肪。

1.7 血液指標(biāo)情況

末次水迷宮試驗后，大鼠麻醉后腹主動脈取血。采用全自動生化分析儀檢測血液生化指標(biāo)，包括瘦素（leptin）、總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。ELISA法測腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。

1.8 病理情況

大鼠腹主動脈取血后，統(tǒng)一取出肝小葉及小腸，用生理鹽水沖洗，除去淤血及內(nèi)容物，濾紙吸干后及時置于4%多聚甲醛液中固定，HE染色后在顯微鏡下觀察。

1.9 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況

大鼠按分組灌胃4周后，各組大鼠體重及Lee’s指數(shù)無差異。與對照組相比，豬油組空腹血糖值無顯著差異。與豬油組相比，健康油脂組和復(fù)配不同劑量組空腹血糖值顯著降低。說明4周油脂灌胃不會對大鼠的生長造成明顯的影響，但復(fù)配油脂和健康油脂顯然在控制血糖上有一定的優(yōu)勢。見圖1。

圖1 各組大鼠體重、體長、Lee’s指數(shù)及空腹血糖值Fig.1 Bodyweight, body length, Lee’s index and fasting glucose values of rats in each group

2.2 大鼠脂肪情況

大鼠按分組灌胃4周后，各組大鼠腹部脂肪無顯著差異；與對照組相比，豬油組腎周脂肪、附睪脂肪和心外膜脂肪重量顯著升高；與豬油組相比，健康油脂組、復(fù)配低和高劑量組腎周脂肪、附睪脂肪和心外膜脂肪重量顯著降低。長期食用動物油脂造成了大鼠多個部位脂肪的積累，是一種不健康的現(xiàn)象。健康油脂及復(fù)配油脂在控制體脂上優(yōu)勢明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠脂肪囤積情況Fig.2 Fat accumulation in each group of rats

2.3 大鼠記憶力情況

Morris水迷宮測試提示各組大鼠間的逃避潛伏期、穿臺次數(shù)、上臺前路程、上臺前路程與時間比值，這五個指標(biāo)均無顯著性差異。有研究表明，肥胖會造成記憶力障礙[14]，因此本試驗探究了油脂對記憶力的影響，盡管豬油組大鼠出現(xiàn)了明顯的肥胖，但在記憶力上未見明顯的變化，說明短期的油脂高攝入對記憶力影響不大，但長期攝入仍需注意。見表1和2。

表1 各組大鼠定位航行逃避潛伏期Table 1 Latency of localized navigation evasion for each group of rats

2.4 大鼠血脂、肝功及血清炎癥水平

與對照組相比，豬油組血清中TNF-α和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高；與豬油組相比，健康油脂組和復(fù)配中劑量組谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著降低，復(fù)配高劑量組血清TNF-α和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著降低。上述結(jié)果證實4周豬油攝入會使得肝臟受到較大負(fù)荷，引起肝功損傷，而復(fù)配油脂對肝功影響不大亦不會引起炎癥因子水平上升。見圖3和4。

圖3 各組大鼠血清中相關(guān)指標(biāo)Fig.3 Relevant indexes in the serum of each group of rats

圖4 各組大鼠血清中相關(guān)指標(biāo)Fig.4 Relevant indexes in the serum of each group of rats

2.5 大鼠肝臟和小腸的組織病理結(jié)構(gòu)變化

如圖所示，28 d的油脂灌胃后，各組大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰，無明顯組織結(jié)構(gòu)變化。各組大鼠小腸組織完整，杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無明顯組織水腫或上皮脫落，無明顯組織結(jié)構(gòu)變化，說明攝入這幾種油脂28 d尚不會引起器質(zhì)性臟器損傷。見圖5和6。

圖5 肝臟組織HE染色Fig.5 Hematoxylin-eosin staining of liver tissue

表2 各組大鼠空間探索情況Table 2 Spatial exploration of rats in each group

圖6 小腸組織HE染色Fig.6 Hematoxylin-eosin staining of small intestine tissue

3 討論與結(jié)論

合理的膳食結(jié)構(gòu)對維持健康極為重要，與植物油相比，豬油等動物油所含的大多是飽和脂肪酸，這種物質(zhì)能夠促進(jìn)膽固醇合成，為機(jī)體合成膽酸、構(gòu)成細(xì)胞膜、合成激素等活動提供能量。然而過量的動物油攝入會給機(jī)體帶來極大的負(fù)擔(dān)，豬油灌胃大鼠4周盡管對體重、Lee’s指數(shù)等無明顯影響，但外周脂肪比例顯著性增加，外周血清炎癥指標(biāo)上升。過量動物油脂的攝入雖然在短期內(nèi)對肝臟和小腸的病理結(jié)構(gòu)沒有造成顯著性破壞，但肝功已經(jīng)出現(xiàn)了異常，可預(yù)見性的長期攝入會給機(jī)體造成極大負(fù)擔(dān)進(jìn)而引發(fā)損傷。

已有文獻(xiàn)報道，肥胖會導(dǎo)致記憶力的降低[15-16]。而在本研究中，短時間的試驗并未使動物體重出現(xiàn)明顯變化，脂肪的過度積累亦未造成記憶力衰退，證實肥胖引起的記憶力變化是一個慢性的、長期的過程。脂肪堆積是體內(nèi)脂肪，尤其是甘油三酯積聚過多而導(dǎo)致的一種狀態(tài)，合理的復(fù)配油脂在降低甘油三酯方面有著明顯的優(yōu)勢，但無明顯的劑量依賴性則說明配方油脂的合理性對控制油脂攝入導(dǎo)致的甘油三酯水平偏高有著重要意義。