時序釋放血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β1的功能化生物補片在修復(fù)大鼠腹壁部分缺損中的應(yīng)用

劉正尼 郭彥平 湯 睿

應(yīng)用補片材料修復(fù)腹壁缺損是腹壁疝的標準治療方式[1]。隨著生物補片豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)在臨床應(yīng)用的增加，專科醫(yī)師發(fā)現(xiàn)其植入后多數(shù)新生血管及膠原僅停留在補片表面，故組織重塑不充分造成修復(fù)部位力學(xué)支撐減弱，導(dǎo)致術(shù)后疝復(fù)發(fā)率較高[2]。有學(xué)者認為，在補片制備中引入生長因子，并在補片植入后對其進行活性釋放或可改善相關(guān)組織內(nèi)源性再生。補片植入后的初期為急性炎癥期，局部持續(xù)釋放的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進早期新生血管生成，但對遠期力學(xué)的促進作用有限。組織進入增殖階段后，TGF-β1可以誘導(dǎo)成纖維細胞為主的宿主細胞大量長入組織與補片的結(jié)合處，增殖、分泌膠原并沉積于交界處，加強該區(qū)域的力學(xué)強度[3]。進入腹壁重塑階段后，SIS構(gòu)成的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)逐漸被新生膠原替代，這是一個由邊緣修復(fù)逐漸向中央?yún)^(qū)域過渡的重塑過程，若中央?yún)^(qū)域缺乏有效融合，則ECM 的迅速降解可導(dǎo)致修復(fù)失??；而此過程能否順利完成與 TGF-β1水平密切相關(guān)[4]。研究[5]顯示，低水平TGF-β1可協(xié)同VEGF誘導(dǎo)，加速血管的生成與成熟化。此外，TGF-β1亦是異物植入后重要的免疫調(diào)節(jié)因子[6]。據(jù)此，本課題組將攜帶 TGF-β1納米球與 VEGF通過同軸靜電紡絲技術(shù)紡入絲素(silk fibroin, SF)纖維中形成可時序釋放2種因子的SF膜，模擬組織再生過程中的信號有序表達；通過將SF膜嵌入兩層SIS中，形成功能化生物補片，以減少SIS植入后的排異反應(yīng)；并實驗性橋接、修補Sprague-Dawley(SD)大鼠的腹壁缺損，加速其成熟血管網(wǎng)絡(luò)形成和膠原結(jié)構(gòu)重塑；在補片植入28 d后，對模型大鼠進行組織重塑評估；探索VEGF 和TGF-β1在血管成熟化及膠原沉積過程中的表達情況，闡明兩者在組織修復(fù)過程中的生物學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 SIS由本團隊制備而成[7]。SF蛋白由浙江省桐鄉(xiāng)第二紡絲公司合成。人重組VEGF、TGF-β1、TNF-α和IL-6細胞因子及其ELISA試劑盒均購自美國R&D公司。小鼠單克隆抗體抗血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、膠原(collagen)Ⅰ和Ⅲ、纖連蛋白(fibronectin)、TGF-β1 抗體均購自美國Abcam公司。小鼠抗CD68+和CD15+抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 SF膜制備及生長因子釋放檢測 SF膜制備溫度為25～28 ℃，濕度≥60%。將10 μg VEGF溶解于2 mL SF水溶液(質(zhì)量分數(shù)為35%)中作為殼相溶液，含有TGF-β1質(zhì)量分數(shù)為2%的SF納米球作為核相溶液，分別裝載于獨立針筒內(nèi)用于同軸靜電紡絲。紡絲針頭內(nèi)徑0.8 mm, 外徑 2.0 mm，核、殼相推注速度分別為0.4和1.2 mL/h，針尖距離接收裝置12 cm，電壓維持于18～20 kV。將制備好的SF膜置于真空條件、35 ℃的乙醇蒸汽中處理60 min后在空氣中干燥。應(yīng)用上述方法制備3種攜帶生長因子的SF膜：攜帶VEGF的SF膜(VSF膜)，攜帶TGF-β1的SF膜(TSF膜)，攜帶VEGF和TGF-β1的SF膜(VTSF膜)以檢測2種因子的釋放模式。將200 mg SF膜浸泡于10 mL PBS中勻速震蕩(37 ℃, 100 次/min)。每天提取1 mL上清液用于檢測，并補充1 mL PBS。通過ELISA試劑盒檢測相關(guān)SF膜7 d內(nèi)VEGF及14 d內(nèi)TGF-β1的釋放量，計算2種蛋白質(zhì)的裝載率和累計釋放率。將制備好的SF膜嵌于兩層SIS間，采用質(zhì)量分數(shù)為5%的SF凝膠粘合各層形成SIS漿膜層朝外的3層結(jié)構(gòu)(即實驗用補片)。并將其置于PBS中于 4 ℃下浸泡 2 h，過夜凍干后采用輻照射線消毒(25 kGy; 60Co)，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 補片植入及術(shù)后處理 根據(jù)補片攜帶生長因子不同，分為VEGF(V組),TGF-β1(T組),VEGF和TGF-β1(VT組)及對照組(不含生長因子)。本研究經(jīng)同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員審查、批準(SYXK2020-0002)。實驗流程嚴格按照實驗室動物使用和管理健康指南及術(shù)后管理標準(NIH N01-OD-4-2139, Rev.2)進行操作。48只雄性、8周齡SD大鼠，每只250～300 g，購于上海斯萊克國家實驗動物種子中心。大鼠術(shù)前禁食、禁水6 h，對應(yīng)相應(yīng)補片，隨機分為4組，每組12只。操作流程：以0.1 mg/g的1%戊巴比妥溶液予大鼠腹腔內(nèi)注射，術(shù)中根據(jù)麻醉效果適當(dāng)增加劑量至0.2 mg/g。取腹壁正中切口，切開皮膚及皮下組織，向兩側(cè)鈍性分離,顯露肌層。在腹直肌外側(cè)切除包含腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌和腹橫肌的腹壁肌群，單側(cè)建立3 cm×1 cm的腹壁部分缺損模型，保留腹橫筋膜和腹膜完整性。將5 cm×4 cm的4種補片隨機植入實驗大鼠兩側(cè)缺損處，短軸平行于腹白線，補片覆蓋缺損邊緣1 cm。以3-0普理林線間斷縫合、固定補片與缺損邊緣肌肉組織，5-0 薇喬線間斷縫合皮膚及皮下組織，無菌紗布覆蓋傷口。術(shù)后將大鼠分籠飼養(yǎng)，觀察其活動及進食情況。

1.4 大體觀察和組織學(xué)分析 術(shù)后7、14、28 d分批對大鼠腹腔內(nèi)注射硫噴妥鈉溶液(40 mg/kg)，取材樣本為植入的補片及其周圍0.5 cm的正常組織，以進行大體觀察和組織學(xué)分析。①記錄大鼠手術(shù)區(qū)域的感染、血腫、血清腫、腹壁膨出和疝的復(fù)發(fā)情況。②術(shù)后第7天，收集各組大鼠腹腔內(nèi)滲液，離心后檢測TNF-α和IL-6水平。③分別采用抗CD15(1∶200)和抗CD68(1∶200)抗體進行免疫組織化學(xué)染色，檢測中性粒細胞和巨噬細胞水平。④行免疫熒光CD31(1∶100)染色評價植入補片區(qū)域的新生血管生成情況，即陽性染色血管數(shù)(個)/組織觀察區(qū)域面積(mm2)；抗CD31(1∶100)和抗α-SMA(1∶100)雙抗體免疫熒光染色評價成熟血管生成情況，即CD31和α-SMA雙抗體染色陽性血管數(shù)/CD31染色陽性血管數(shù)；每個樣本均隨機取10個高倍鏡視野進行計算；根據(jù)文獻[8]方法計算血管直徑和分類。⑤采用抗膠原Ⅰ(1∶100)、膠原 Ⅲ(1∶100)及抗纖連蛋白(1∶100)抗體行免疫熒光染色，評價補片植入后修復(fù)區(qū)域的ECM重塑情況；以膠原Ⅰ與膠原Ⅲ的比值評價膠原成熟度。⑥取材補片植入的中央?yún)^(qū)域行膠原Ⅰ免疫熒光染色，通過雙光子激光掃描顯微鏡進行三維成像分析。數(shù)據(jù)分析由兩位研究員獨立應(yīng)用ImageJ軟件進行計算。

1.5 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達檢測 將植入28 d后的組織勻漿處理并提取蛋白質(zhì)。采用免疫印跡實驗檢測組織中VEGF、TGF-β1、CD31、膠原Ⅰ(一抗稀釋比例分別為1∶500、1∶200、1∶500、1∶1 000)蛋白質(zhì)水平，以GAPDH(1∶1 000)作為對照計算上述指標的灰度值，定量再生區(qū)域相關(guān)蛋白質(zhì)的表達。

1.6 力學(xué)性能檢測 對植入28 d后的組織取材，剪裁成30 mm × 10 mm條帶狀用于縱向力學(xué)測試。測試指標包含應(yīng)力-應(yīng)變曲線、拉伸強度、楊氏模量及斷裂伸長。未植入的補片浸入PBS 2 h以維持材料濕態(tài)，作為對照組進行上述力學(xué)測試。在濕態(tài)條件下將樣本置于model 5542電子織物強力儀(東華大學(xué))，兩端夾持長度為10 mm，拉伸速率為10 mm/min直至斷裂，計算和記錄拉伸過程中相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF和TGF-β1裝載率及累計釋放率 VSF膜和VTSF膜對VEGF的裝載率分別為(33.0±2.2)% 和(35.3±3.8)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.04,P>0.05)，7 d內(nèi)兩種膜的累計釋放率為(80.0±4.8)%。TSF膜和VTSF膜對TGF-β1的裝載率分別為(51.0±7.5)%和(45.3±5.8)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.20,P>0.05)，14 d內(nèi)兩種膜的TGF-β1累計釋放率分別為(39.5±2.6)% 和(32.5±2.3)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.03，P>0.05)。

2.2 補片植入后大體觀察及組織表面纖維化情況 各組補片被植入缺損位置進行橋接修補。觀察期間無大鼠死亡及切口感染發(fā)生。術(shù)后14 d，對照組大鼠出現(xiàn)1例腹壁疝，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)在補片-組織結(jié)合處發(fā)生破裂。大體觀察顯示：術(shù)后7 d各組大鼠修復(fù)區(qū)域組織變薄，呈半透明狀(白色虛線標記，圖1A～1D)；植入V組補片的大鼠在修復(fù)區(qū)域形成小膿腫(白色箭頭所示，圖1B),其余補片組未見膿腫形成。術(shù)后14 d，與V、T及VT組相比，對照組大鼠的腹壁組織修復(fù)程度最小(白色虛線標記，圖1E-1H)。術(shù)后28 d，對照組大鼠中央?yún)^(qū)域部分纖維化(黃色箭頭所示，圖1I-1L)。

2.3 補片植入后宿主組織炎癥反應(yīng)情況 術(shù)后7 d，V組的CD15+水平顯著高于T組(t=2.82,P<0.05)和對照組(t=2.12,P<0.05)，但在術(shù)后14、28 d，3組CD15+水平均降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.00，P>0.05),見圖2A。術(shù)后7 d，含因子補片(V、T、VT組)的CD68+表達水平顯著高于對照組(F=17.60,P<0.05, 圖2B)；同時間點的TNF-α和IL-6的表達水平均顯著高于對照組(F=20.39,P<0.05,圖2C;F=87.52,P<0.05, 圖2D)。術(shù)后28 d，T組和VT組CD68+表達水平均顯著低于V組及對照組(F=27.60,P值均<0.05, 圖2B)，排異反應(yīng)顯著減輕。

2.4 補片植入后組織血管化情況 CD31免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖3A)，術(shù)后28 d，VT組新生血管數(shù)量(5.5±0.4)顯著多于T組(3.6±0.5,t=4.21，P<0.05)、V組(3.0±0.5,t=4.23，P<0.05)及對照組(2.9±0.4,t=5.93，P<0.05)，后3組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.85，P>0.05)。CD31與α-SMA雙熒光染色合并結(jié)果顯示(圖3B)，VT組在術(shù)后28 d形成的成熟血管數(shù)量較V組[(41.6±5.8)比(27.6±5.2)，t=5.83，P<0.05]和T組顯著增加[(41.6±5.8)比(24.7±5.00),t=7.26，P<0.05]，主要由毛細血管、小靜脈和小動脈組成。各組毛細血管數(shù)量在成熟血管中占比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.09，P>0.05)。VT組的小動、靜脈數(shù)量占成熟血管的比例為0.457，均顯著高于V組(0.385，t=5.09，P<0.05)和T組(0.326,t=5.09，P<0.05)。VT組的血管成熟度比例最高，為0.65。

A 補片植入術(shù)后7、14和28 d取材中央?yún)^(qū)域新生血管(即CD31陽性染色的血管)數(shù)量(n=4, ①P<0.05) B 補片植入術(shù)后28 d后取材中央?yún)^(qū)域成熟血管(即α-SMA/CD31雙熒光染色陽性)數(shù)量及其血管類型組成統(tǒng)計(n=4, ①P<0.05)

2.5 ECM重塑情況 術(shù)后28 d，與對照組及V、T組[(3.0±0.4)]%、(3.3±0.5)%和(4.6±0.6)%]相比，VT組的膠原Ⅰ熒光染色陽性的面積最大為(7.5±0.5)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.30，P<0.05，圖4A)。VT組的膠原Ⅰ/Ⅲ比值為2.1，均顯著高于V組、T組和對照組(1.3、1.6、1.0，F(xiàn)=18.57，P值均<0.05，圖4B),但仍低于人體腹直肌前鞘的生理數(shù)值(7.0)[8]。與對照組相比，V、T、VT組纖連蛋白染色陽性比例均顯著增加(P值均<0.05)；同時，VT組顯著高于V組(t=6.83，P<0.05)，與T組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.67，P>0.05,圖4C)。

A 補片植入術(shù)后7、14和28 d取材中央?yún)^(qū)域膠原Ⅰ陽性染色定量分析(n=4, ①P<0.05) B 補片植入術(shù)后28 d膠原Ⅰ/Ⅲ比值定量分析(n=4, ①P<0.05) C 纖連蛋白陽性染色定量分析(n=4, ①P< 0.05)。

在膠原Ⅰ染色的三維成像中，VT組呈現(xiàn)出大量膠原纖維集中、匯攏成束，相互緊密交織形成有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對照組則表現(xiàn)為松散、稀疏紊亂的結(jié)構(gòu)(圖5A)。VT組的膠原化體積[(46.9±6.3)×104mm3,t=4.10，P<0.05]和面積[(13.9±1.2)×104mm2,t=3.29，P<0.05]均顯著高于對照組[(14.3±4.5)×104mm3和(8.8±0.6)×104mm2](圖5B、5C)。表明VT組形成了更穩(wěn)固的ECM重塑，有利于抵抗動態(tài)腹內(nèi)壓的力學(xué)支撐。

A～C 補片植入術(shù)后28 d取材中央?yún)^(qū)域的膠原Ⅰ染色(綠)三維成像示意圖及比較分析(n=4, ①P<0.05)

2.6 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達水平 術(shù)后28 d，除TGF-β1外，V、T、VT組的蛋白質(zhì)水平均顯著高于對照組(P值均<0.05，圖6)。V組VEGF蛋白質(zhì)水平(0.30±0.03)顯著高于T組(0.13±0.01，t=10.48，P<0.05)，V組CD31蛋白質(zhì)水平(0.22±0.03)與T組(0.15±0.02)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.42，P>0.05)。T組TGF-β1(0.23±0.02)及膠原Ⅰ(0.42±0.05)蛋白質(zhì)水平均顯著高于V組[(0.09±0.01)、(0.24±0.03)，P值均<0.05]?；赩EGF和TGF-β1的協(xié)同作用，VT組的CD31和膠原Ⅰ的蛋白質(zhì)表達水平均顯著高于V、T和對照組(P值均<0.05)。

1 V組 2 VT組 3 T組 4 對照組 A、B 補片植入后28 d不同補片取材組織中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達示意圖及定量分析，其中CD31和膠原Ⅰ以GAPDH為基準計算灰度值(n=4, ①P<0.05)

2.7 力學(xué)性能比較 T組和VT組應(yīng)力-應(yīng)變曲線形態(tài)相似，而VT組的拉伸強度高于V組(t=8.53，P<0.05)和對照組(t=8.26，P<0.05，圖7A、7B)。較V組和對照組，T組和VT組分別具有更高的楊氏模量和更低的斷裂伸長率(P值均<0.05，圖7C、7D)。

A 應(yīng)力-應(yīng)變曲線(n=4) B 拉伸強度(n=4, ①P< 0.05) C 楊氏模量(n=4, ①P< 0.05) D 斷裂伸長率(n=4, ①P< 0.05)

3 討 論

與傳統(tǒng)組織間縫合的修補法相比，應(yīng)用補片修補腹壁疝術(shù)后患者疾病復(fù)發(fā)率顯著降低[8]。補片的作用是恢復(fù)腹壁形態(tài)、提供足夠的力學(xué)支撐以對抗腹內(nèi)壓。SIS是一種無免疫原性、富含膠原的脫細胞基質(zhì)。在植入宿主體內(nèi)后，需要通過誘導(dǎo)組織融合和重塑以替代原修補材料，從而提供力學(xué)支撐[9]。在前期研究[10]中，本團隊發(fā)現(xiàn)，未交聯(lián)的雙層SIS在植入術(shù)后2周因快速降解力學(xué)強度降至最低；因其重塑發(fā)展緩慢，術(shù)后4周力學(xué)強度才逐漸開始回升。在此過程中，一旦原先結(jié)構(gòu)崩塌，組織內(nèi)源性再生不足將導(dǎo)致修復(fù)失敗。

組織的修復(fù)及再生是一個需要多種細胞因子和生長因子等信號分子時序參與的復(fù)雜、有序過程。釋放外源性生長因子有利于細胞與基質(zhì)間的信息傳遞，加速引導(dǎo)新生膠原沉積和組織結(jié)構(gòu)重塑，從而加強修復(fù)區(qū)域的力學(xué)支撐。對于組織再生而言，時序釋放具有協(xié)同性的兩種生長因子可減少單一因子的用量，縮短修復(fù)和再生過程，避免因不規(guī)律地突釋因子所造成的不良修復(fù)結(jié)局[11]。生長因子的導(dǎo)入和控釋需要相關(guān)載體，采用靜電紡絲技術(shù)可以制備適用于活性蛋白的裝載和釋放的多層結(jié)構(gòu)。核層材料可通過包封的方式保護蛋白活性。殼層材料不僅可以延緩核層蛋白的釋放，同時也可以裝載活性蛋白，從而實現(xiàn)多種活性蛋白的時序釋放，為SIS的功能化改性提供技術(shù)支持[12]。

補片植入后的宿主融合是一個復(fù)雜但有序的過程。突釋VEGF可引起急性炎癥反應(yīng)激發(fā)明顯的中性粒細胞浸潤，其促炎作用是通過增加內(nèi)皮細胞通透性，促進內(nèi)皮細胞黏附分子表達，并作為單核細胞趨化因子募集白細胞而實現(xiàn)[13-14]。但在植入初期，所有含因子補片均可產(chǎn)生明顯的免疫排異反應(yīng)。一方面原因是，VEGF會加重SIS植入后的排異反應(yīng)；另一方面則為，TGF-β1納米球通過胞吞作用被巨噬細胞吞噬，因而募集和激活更多巨噬細胞，并隨多核異物巨細胞形成激發(fā)免疫排異反應(yīng)[15]。在本研究中，補片植入后初期TNF-α和IL-6的高水平狀態(tài)也是由上述因子通過促炎巨噬細胞的極化作用所致。但是，T組和VT組在術(shù)后28 d的排異反應(yīng)均已顯著減輕。表明TGF-β1作為抗炎細胞因子和巨噬細胞調(diào)節(jié)因子，發(fā)揮了有效抑制炎癥與減輕組織排異反應(yīng)的作用。

VEGF可間接促進膠原分泌[16]。而對于TGF-β1在血管形成方面的作用仍存爭議。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性TGF-β信號可增加內(nèi)皮細胞增殖和血管生成，而另一些學(xué)者的結(jié)論則恰恰相反[17-18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，促進或抑制血管形成的信號轉(zhuǎn)換取決于TGF-β水平，以及在內(nèi)皮細胞上的受體及激活的信號通路類型。在完成促血管反應(yīng)時，信號分子的類型和細胞間的交互作用比因子的攜帶量更為重要。在本研究中，VTSF膜的VEGF達到早期、快速釋放，TGF-β1形成持續(xù)、緩慢釋放。每張VTSF膜含VEGF 700 pg/mg, 可促進血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管生成；而VTSF膜含TGF-β1與VEGF量之比被限制在1∶25，以利于形成低濃度持續(xù)表達TGF-β1的協(xié)同作用。兩者的時序釋放相比單一釋放更有利于CD31和膠原Ⅰ的表達，加強了VEGF的促血管作用，并通過調(diào)節(jié)ECM重塑形成更為穩(wěn)定和強韌的結(jié)構(gòu)。但VT組的力學(xué)強度仍低于人體腹直肌前鞘的生理數(shù)值(7.0)[20]。相反，單一突釋VEGF在管生長和成熟方面作用顯著。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，時序釋放VEGF和TGF-β1兩種因子的功能化補片比單獨釋放VEGF或TGF-β1補片具有更多的成熟血管生成及更好的組織結(jié)構(gòu)重塑，相比單獨釋放VEGF補片可提供更強的力學(xué)支撐。在初期釋放VEGF后持續(xù)釋放TGF-β1，將有助于血管生成和血管成熟；而初期釋放VEGF亦有助于TGF-β1促進膠原沉積和成熟。因此，利用活性因子的協(xié)同效應(yīng)或可改善生物補片的修復(fù)效果，更有助于后續(xù)相關(guān)補片內(nèi)在生物化學(xué)機制的探索。