血清miR-671-3p、miR-135b水平與老年乳腺癌患者化療耐藥性的相關(guān)性*

余喜梅，張?chǎng)┚?，?燁△

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院:1.乳腺甲狀腺科;2.眼科,新疆烏魯木齊 830001

現(xiàn)階段，化療作為乳腺癌的主要治療手段之一，可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)，延緩病情進(jìn)展，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，改善預(yù)后[1]。但部分乳腺癌患者接受化療后存在化療耐藥情況，降低化療效果，甚至造成化療失敗，增加患者病死風(fēng)險(xiǎn)；特別是老年腫瘤患者，老年患者因機(jī)體多系統(tǒng)功能減弱，抵抗能力和耐受能力降低，一旦發(fā)生化療耐藥性，病死風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步提高[2]。因此，早期預(yù)測(cè)老年乳腺癌化療患者是否發(fā)生耐藥對(duì)提高化療效果，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間具有重要意義。微小核糖核酸(MicroRNA，miR)主要由18～24個(gè)核苷酸組成，可通過下調(diào)靶基因的表達(dá)或翻譯參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、增殖等過程中[3]。研究指出，miR與多種癌癥疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也與癌癥疾病化療耐藥性的產(chǎn)生存在密切關(guān)聯(lián)[4]。miR-671-3p是miR-671家族的成員之一，已有研究證實(shí)，miR-671-3p過表達(dá)可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移能力[5]。miR-135b也是miR的常見類型之一，研究指出，miR-135b在三陰性乳腺癌、胃癌等多種癌性疾病中呈高表達(dá)現(xiàn)象，可發(fā)揮促癌基因的作用[6]。由上述miR-671-3p、miR-135b在腫瘤疾病中的作用特點(diǎn)，推測(cè)血清miR-671-3p、miR-135b水平可能與老年乳腺癌患者化療耐藥性有關(guān)?；诖耍狙芯繉⒅攸c(diǎn)分析血清miR-671-3p、miR-135b水平與老年乳腺癌患者化療耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2020年2月在本院接受化療且化療結(jié)束后產(chǎn)生耐藥性的52例老年乳腺癌患者作為耐藥組，另同期選取在本院接受化療且化療結(jié)束后未產(chǎn)生耐藥性的52例老年乳腺癌患者作為敏感組，收集兩組病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乳腺癌符合《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2017年版)》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)乳腺超聲、乳腺鉬靶、穿刺活檢等檢查確診；(2)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>6個(gè)月；(3)惡性腫瘤國際臨床病期分期(TNM)[8]為ⅡB期、Ⅲ期；(4)全部患者均接受同一種新輔助化療方案，且化療周期一致；(5)患者病歷資料、影像學(xué)檢查結(jié)果等資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)既往接受手術(shù)治療；(3)既往接受放化療；(4)原位癌成分太多難以確認(rèn)浸潤性癌大小或無法臨床評(píng)估療效；(5)化療前白細(xì)胞<3×109/L；(6)化療前血小板<80×109/L；(7)伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2方法

1.2.1新輔助化療方法 參照《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2017年版)》中相關(guān)內(nèi)容，為老年乳腺癌患者實(shí)施新輔助化療，具體內(nèi)容如下：采用FAC新輔助化療方案，環(huán)磷酰胺+多柔比星+氟尿嘧啶。環(huán)磷酰胺(通化茂祥，生產(chǎn)批號(hào)20181120，規(guī)格：50 mg×24 s)：第1天，靜脈沖入，500 mg/m2；多柔比星(海正輝瑞制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20180623，規(guī)格為50 mg)：第1天，靜脈沖入，50 mg/m2；氟尿嘧啶(通化茂祥，國藥準(zhǔn)字H22023469，規(guī)格為10 mL：0.25 g)：第1、8天，靜脈滴注，600 mg/m2。21 d為1個(gè)周期，共化療6個(gè)周期。

1.2.2化療耐藥性檢測(cè)方法 化療結(jié)束1 d時(shí)，在超聲引導(dǎo)下，患者接受穿刺活檢，取0.5～1.0 mm的新鮮腫瘤組織，使用組織消化酶進(jìn)行消化，消化后使用篩網(wǎng)過濾，最后使用湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司的KC-42B低速離心機(jī)進(jìn)行離心處理，以3 000 r/min的離心速度離心10 min，離心完畢后取細(xì)胞懸液，并將其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中，制備細(xì)胞混懸液。在冰浴環(huán)境下，制備細(xì)胞-膠原蛋白混合液，接種在24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。24 h后，加入血漿藥物濃度的環(huán)磷酰胺，靜置24 h。試驗(yàn)過程中涉及無藥藥物的空白組。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：采用含藥組的細(xì)胞數(shù)量/空白組數(shù)目的百分比評(píng)估藥物敏感性，若<50%則判定為化療敏感，≥50%則為化療耐藥，分別納入耐藥組和敏感組。

1.2.3基線資料調(diào)查方法 自制基線資料調(diào)查問卷，詳細(xì)詢問患者及其家屬并記錄患者一般情況，內(nèi)容包括：(1)年齡；(2)腫瘤最大徑；(3)TNM分期：劃分為ⅡB期、Ⅲ期；(4)飲酒史：飲酒時(shí)間>5年，每次攝入酒精量>10 g；(5)吸煙史：連續(xù)或累計(jì)吸煙6個(gè)月或以上；(6)體重指數(shù)(BMI)：體重正常(BMI<23.9 kg/m2)、肥胖或超重(BMI≥23.9 kg/m2)；(7)合并高血壓：參照指南進(jìn)行判定[9]；(8)合并糖尿?。簠⒄罩改线M(jìn)行判定[10]。

1.2.4實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)方法 全部患者均于化療前，采集清晨空腹靜脈血10 mL，共分為5支試管。(1)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞：使用長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司的TD4A型低速醫(yī)用離心機(jī)，以1 500 r/min的離心速度共離心5 min，離心半徑10 cm，離心完畢后取上清液待檢。使用日本Sysmxe公司的XE-2100全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞。(2)C-反應(yīng)蛋白(CRP)、血紅蛋白：經(jīng)離心機(jī)分別進(jìn)行離心處理，離心速度均為3 000 r/min，離心時(shí)間均為10 min，離心半徑均為15 cm，離心完畢后均取上清液待檢。使用武漢明德生物科技股份有限公司的試劑盒，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定CRP水平。使用日本希森美康XS-800i血細(xì)胞分析儀測(cè)定血紅蛋白水平。(3)血清糖類抗原(CA)125、CA199：經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行離心處理，以8 000 r/min的離心速度共離心6 min，離心半徑16 cm，離心完畢后取上清液待檢。使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清CA125、CA199水平。(4)血清miR-671-3p、miR-135b：經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行離心處理，以3 000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心半徑15 cm，離心完畢后取上清液待檢。以總RNA 5 μL為模板，使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。總反應(yīng)體系為15 μL，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-671-3p的正向引物序列：5′-TCCGGTTCTCAGGGC-3′；反向引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。內(nèi)參基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCACCATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGC TTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。miR-135b的正向引物序列：5′-GTCTCGAGCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；反向引物序列：5′-TAAAGCTTCTGGATACGACCACATA-3′。內(nèi)參基因U6上游序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；下游序列：5′-CGCTTCACGAATTTGAGTGTCAT-3′。以cRNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量和miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組患者基線資料對(duì)比 耐藥組和敏感組的基線資料對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者基線資料對(duì)比

續(xù)表1 兩組患者基線資料對(duì)比

2.2兩組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比 耐藥組的血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量低于敏感組，miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組間其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比[M(P25，P75)]

2.3老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.359，P<0.001)。相關(guān)性散點(diǎn)圖見圖1。

圖1 老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量與老年乳腺癌患者化療耐藥性關(guān)系的回歸分析 將基線資料與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)分析結(jié)果得到有意義的變量(均為連續(xù)變量)作為自變量，將老年乳腺癌患者化療耐藥性情況作為因變量(1=耐藥，0=敏感)，經(jīng)二元回歸分析后，將P值放寬至<0.2，將符合條件的因素同時(shí)納入作為自變量，經(jīng)多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，老年乳腺癌患者化療前1 d時(shí)的血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量與患者化療耐藥性有關(guān)，血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量高表達(dá)是老年乳腺癌患者化療耐藥性的保護(hù)因素(OR<1，P<0.05)；miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量高表達(dá)是老年乳腺癌患者化療耐藥性的危險(xiǎn)因素(OR>1，P<0.05)。見表3。

表3 血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量與老年乳腺癌患者化療耐藥性關(guān)系的回歸分析

2.5血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)老年乳腺癌患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的效能分析 將患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量作為檢驗(yàn)變量，老年乳腺癌患者化療耐藥情況作為狀態(tài)變量(1=耐藥，0=敏感)，繪制ROC曲線(見圖2)，結(jié)果顯示，老年乳腺癌患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.70，預(yù)測(cè)價(jià)值較理想，且以患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量cut-off值取1.035、2.420時(shí)，聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值最好。相關(guān)參數(shù)見表4。

表4 血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)老年乳腺癌患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的效能分析結(jié)果

圖2 血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135bmRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)老年乳腺癌患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線圖

3 討 論

化療已被證實(shí)是乳腺癌的重要治療方法，但部分患者化療后存在耐藥性，化療效果欠佳，腫瘤組織未見縮小，甚至仍有所增長(zhǎng)，病情有所加重，且老年患者機(jī)體衰退，一旦發(fā)生化療耐藥性，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步升高[11]。因此，為預(yù)防老年乳腺癌患者產(chǎn)生化療耐藥性，需早期預(yù)測(cè)患者化療耐藥性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并給出針對(duì)性建議。

研究指出，細(xì)胞凋亡與化療耐藥性密切相關(guān)，凋亡因子的異常表達(dá)可降低化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，從而提高化療耐藥風(fēng)險(xiǎn)[12]。miRNA已被研究證實(shí)可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腫瘤細(xì)胞凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移等過程[13]。作為miRNA的一種，miR-671-3p能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲遷移、增殖等細(xì)胞學(xué)行為[14]。miR-135b基因位于第一號(hào)染色體，在多種癌癥疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究指出，miR-135b可通過激活Hippo通路，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[15]。同時(shí)，miR-135b表達(dá)上調(diào)可刺激雌激素受體α、雄激素受體和缺氧誘導(dǎo)因子1α，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)[16]。結(jié)合上述血清miR-671-3p、miR-135b與腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)的關(guān)系，推測(cè)二者可能參與了老年乳腺癌化療耐藥的發(fā)生及發(fā)展。本研究經(jīng)對(duì)比化療耐藥與敏感的老年乳腺癌患者的血清miR-671-3pmRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135bmRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，耐藥組的血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量低于敏感組，miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量高于敏感組，初步推測(cè)血清miR-671-3p、miR-135b可能與老年乳腺癌患者的化療耐藥性有關(guān)。進(jìn)一步作回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-671-3p、miR-135b與老年乳腺癌患者的化療耐藥性有關(guān)，血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量低、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量高可能是老年乳腺癌患者化療耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)因子，證實(shí)上述猜測(cè)。分析可能的原因如下：血清miR-671-3p的直接靶基因?yàn)镈EPTOR蛋白，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)，可抑制DEPTOR蛋白發(fā)揮作用，從而影響下游基因的表達(dá)，繼而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移等能力，降低化療耐藥性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]。miR-135b可靶向抑制腫瘤抑制基因(APC基因)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移，提高化療耐藥性發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[18]。最后，本研究繪制ROC曲線分析血清miR-671-3p、miR-135b預(yù)測(cè)老年乳腺癌患者化療耐藥性的價(jià)值，結(jié)果顯示，患者化療前1 d時(shí)的血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量預(yù)測(cè)老年乳腺癌患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)的AUC均>0.70，預(yù)測(cè)價(jià)值較理想，且以患者化療前血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量cut-off值取1.035、2.420時(shí)，聯(lián)合預(yù)測(cè)的價(jià)值最好。表明血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量不僅可能是老年乳腺癌患者化療耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)因子，也可作為老年乳腺癌患者化療耐藥性的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。上述結(jié)果也表明，早期可動(dòng)態(tài)檢測(cè)老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量，若發(fā)現(xiàn)二者異常變化，建議可以提前為患者實(shí)施中西醫(yī)結(jié)合治療、免疫治療等干預(yù)，以改善血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量、miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量，可能對(duì)降低老年乳腺癌患者化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)有一定價(jià)值。此外，本研究還對(duì)患者血清miR-671-3p與血清miR-135b進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示老年乳腺癌患者血清miR-671-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與血清miR-135b mRNA相對(duì)表達(dá)量之間可能存在一定聯(lián)系，二者可能相互影響、相互作用，共同參與了老年乳腺癌患者化療耐藥性的發(fā)生，但尚不能根據(jù)此次研究結(jié)果推斷上述指標(biāo)之間在疾病中相互影響，加之目前關(guān)于二者的關(guān)系研究甚少，具體關(guān)系及機(jī)制還需要在未來進(jìn)一步開展更多的研究加以明確。

綜上所述，老年乳腺癌患者化療耐藥性可能與血清miR-671-3p、miR-135b表達(dá)異常有關(guān)，臨床可考慮通過早期監(jiān)測(cè)老年乳腺癌患者的血清miR-671-3p、miR-135b表達(dá)，預(yù)測(cè)化療耐藥性風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)干預(yù)，可能對(duì)降低化療耐藥性、促進(jìn)良性預(yù)后有積極意義。