秦巴車前草中總黃酮的超聲提取及DPPH·抗氧化性質(zhì)研究

蘇虹霞，高 靜，姜 敏

（陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000）

車前草為車前科多年生草本植物，具有清熱、利尿、涼血、祛痰、解毒等功效[1]。研究發(fā)現(xiàn)，車前草中富含多糖、黃酮、生物堿等多種成分，其中黃酮類物質(zhì)是車前草的主要藥用成分之一[2]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗凝血等多種藥理作用[3]。常見的黃酮類化合物提取方法有熱水浸提法[4]、高效液相色譜浸提法[5]、響應(yīng)面浸提法[6]、復(fù)合酶浸提法[7]等，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，水提法的使用最為廣泛。

本實(shí)驗(yàn)以秦巴產(chǎn)車前草為原料，采用超聲波輔助水浸提法提取黃酮，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定了影響黃酮物質(zhì)提取率的主次因素及最佳的提取條件，并對提取液進(jìn)行了DPPH·抗氧化活性研究，以期為車前草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

車前草采集于秦巴山區(qū)，收取新鮮草樣后60℃烘干、粉碎、過篩，收集備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、亞硝酸鈉、硫酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、DPPH·（均為AR）。所有試劑均未經(jīng)純化。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TP-214型電子天平，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，P7021TP-6型超聲波清洗機(jī)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋，99879型電熱干燥箱，Cary50型紫外可見分光光度計(jì)，HK-08A型粉碎機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮類物質(zhì)的超聲波輔助提取

2.1.1 最大吸收波長的確定

參考沈高揚(yáng)等人[8]的測定方法并進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)。吸取3.0mL蘆丁溶液于10mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.8mL，搖勻后放置6min。加入10%的Al2(SO4)3溶液0.1mL，搖勻后放置6min，加入2 mol·L-1的NaOH溶液5mL，加水定容至10mL，搖勻，放置15min。以試劑空白為對照，在360～660nm范圍內(nèi)，對配制的溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜掃描，結(jié)果見圖1。該體系在510nm處的吸光度值最大，因此，在后續(xù)黃酮提取液的定量測定實(shí)驗(yàn)中，確定510 nm為檢測波長。

圖1 最大吸收波長掃描圖Fig.1 Scanning diagram of maximum

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，按照上述方法配置相應(yīng)的待測溶液，在510 nm處測定各溶液的吸光度，以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。得到蘆丁的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）和吸光度A的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=9.5931X+0.0333，R2=0.9977。

圖2 黃酮對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of flavonoid absorption wavelengthreference substance

2.1.3 車前草中黃酮類化合物的提取

準(zhǔn)確稱取車前草粉末（60℃烘干粉碎過篩）1g，加入60%乙醇溶液20mL，在60℃水浴中浸泡2h，分別用10mL和20mL相應(yīng)濃度的提取劑，對車前草溶液超聲波輔助提取2次各30 min。過濾，合并收集的濾液，將濾液轉(zhuǎn)入圓底燒瓶內(nèi)旋蒸至浸膏。用20mL的蒸餾水溶解，分別用10mL、20mL石油醚萃取2次，合并收集水相，轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，定容，得到樣品液。

2.1.4 車前草黃酮類化合物樣品含量的測定

吸取樣品液0.4mL于10mL容量瓶中，按上述確定最大吸收波長的實(shí)驗(yàn)步驟，依次加入上述溶液進(jìn)行顯色，于510nm波長處測定吸光度。代入校準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品液中黃酮的濃度，進(jìn)而計(jì)算車前草中黃酮類物質(zhì)的提取率。

2.2 不同因素對黃酮提取率的影響

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量樣品，分別在不同的提取溶劑（乙酸乙酯、水、甲醇、丙酮、乙醇）、不同的提取劑濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、不 同 的 超 聲 處 理 時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、不同的水浴浸提時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。再在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以確定最佳提取條件。

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

綜合考量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取劑濃度、料液比、超聲時(shí)間、水浴浸提時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 黃酮提取正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factor levels of orthogonal test for flavonoid extraction

2.3 抗氧化性能測試

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見光區(qū)的最大吸收峰為517nm。DPPH·溶液中加入自由基清除劑后，孤對電子被配對，其在517nm處吸光度的改變值與DPPH·的濃度呈定量關(guān)系，可用于檢測自由基的清除程度，從而評價(jià)自由基清除劑清除自由基的能力。清除能力以清除率表示，清除率越大，表明清除能力越強(qiáng)。

DPPH·溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.004g的DPPH·，用無水乙醇溶解后定容于100mL容量瓶中，DPPH·濃度為1×10-4g·L-1。

對照溶液：0.4mL無水乙醇與1×10-4g·L-1的DPPH·溶液4mL加入同一試管中，靜置30min，以無水乙醇為空白，在517nm處測定其吸光度A0。

樣品處理：以最佳工藝提取的黃酮樣液定容于100mL容量瓶，分別移取4、5、6、7、8、9 mL提取液，稀釋定容于10mL容量瓶內(nèi)。取不同濃度的提取液0.4mL，分別加入4 mL的DPPH·溶液，立即搖勻，靜置30min后測其在517nm處的吸光度Ai。取等量的提取液，分別加4mL無水乙醇，立即搖勻靜置30min后測其吸光度Aj。

其中，Ao為未加待測液時(shí)DPPH·的吸光度；Aj為待測液的吸光度；Ai為入加待測液后DPPH·的吸光度。

3 結(jié)果分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

料液比為1∶20、水浴浸提時(shí)間為2h、超聲處理時(shí)間為30min時(shí)，考察不同溶劑對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，不同溶劑提取的黃酮量不同，在同一波長下，無水乙醇的提取率最大，乙酸乙酯的提取率最小。原因在于乙酸乙酯屬于酯類，對粉末狀的車前草的破壞程度較小，只能提取出較少量的黃酮；無水乙醇能快速完整地破壞車前草粉末，從而提取出更多的黃酮。因此，選擇乙醇作為溶劑來提取車前草中的黃酮。

圖3 不同溶劑對黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of different solvents on the extraction rate of flavonoids

料液比為1∶20、水浴浸提時(shí)間為2h、超聲處理時(shí)間為30min，考察不同的提取劑濃度對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示隨著提取劑濃度的增大，在一定范圍內(nèi)，黃酮提取率的增幅較大，提取劑濃度為60%時(shí)，黃酮的提取率最高，隨后開始下降，這可能是由于高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液使得醇溶性雜質(zhì)色素（葉綠素等）、親脂性強(qiáng)的成分的溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭，與乙醇-水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致黃酮類化合物的提取率不升反降。所以，提取劑為60%乙醇，對車前草黃酮類化合物的溶解度最好。

圖4 不同濃度的提取劑對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of different concentrations on the extraction rate of flavonoids

提取劑為60%乙醇、水浴浸提時(shí)間為2h、超聲處理時(shí)間為30min，考察不同的料液比對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，隨著料液比增加，黃酮的提取率增加，料液比達(dá)到1∶20時(shí)，提取率達(dá)到最高，之后呈下降的趨勢。料液比太小，不能完全溶解黃酮類化合物；料液比太大，會過多地溶解其他雜質(zhì)。因此確定料液比1∶20為最佳料液比。

圖5 料液比對黃酮提取率的影響Fig.5 Solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

提取劑為60 %乙醇、料液比為1∶20、水浴浸提時(shí)間為2 h，考察不同的超聲處理時(shí)間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示黃酮的提取率在一定的范圍內(nèi)隨著時(shí)間的延長而有所提高，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，黃酮提取率最大，但超聲處理過程不斷產(chǎn)生熱能，黃酮類化合物活性成分有所損失，因此確定超聲處理時(shí)間為30 min。

圖6 超聲時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.6 ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids

提取劑為60%乙醇、料液比為1∶20、超聲處理時(shí)間為30 min，考察不同的水浴浸提時(shí)間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示隨水浴浸提時(shí)間的增加，黃酮提取率先上升后下降。原因可能是浸提時(shí)間過長會導(dǎo)致其他物質(zhì)被萃取出來，同時(shí)過長的浸提時(shí)間會使溶劑因揮發(fā)而逐漸減少，會損失掉部分黃酮類化合物，導(dǎo)致提取率降低。因此水浴浸提時(shí)間選擇2 h為宜。

圖7 水浴浸提時(shí)間對黃酮提取率的影響圖Fig.7 Effect of water bath time on the extraction rate of flavonoids

3.2 正交實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn) L9(34)（表2），以進(jìn)一步確定車前草中黃酮的最佳提取條件。

表2 黃酮提取的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of flavonoid extraction

由表2可以看出，4個(gè)因素的極差順序?yàn)镽D＞RB＞RC＞RA，說明水浴浸提時(shí)間對黃酮吸光度的影響最大，料液比次之，超聲時(shí)間和乙醇濃度的影響最小。從因素的主次順序，得到用超聲波輔助提取車前草中黃酮的最佳工藝條件為A2B3C2D3，即溶劑為60%乙醇、料液比為1∶25、超聲處理時(shí)間為30min、水浴浸提時(shí)間為2.5h。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，按照最佳提取工藝條件，進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，車前草中黃酮的提取率為5.76%。

3.3 黃酮清除DPPH·自由基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將在最佳工藝條件下得到的提取液，配制成不同濃度的待測液，測定了不同濃度的黃酮提取液對DPPH·自由基的清除能力。以黃酮濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當(dāng)黃酮濃度為0.04mg·mL-1時(shí)，清除率最小為66%，隨著黃酮濃度逐漸增大，清除率呈增長的趨勢，濃度達(dá)到0.12mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大值90%，之后隨著黃酮濃度增大，清除率稍有下降但變化不大，對清除效果基本無影響。因此，0.12mg·mL-1的黃酮提取液對濃度為1×10-4mol·L-1的DPPH·的清除效果最佳。

圖8 黃酮對DPPH·的清除率曲線Fig. 8 Curve of flavonoids to DPPH clearance rate

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助水浸提法，對秦巴產(chǎn)的車前草總黃酮進(jìn)行了提取，以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定了總黃酮的含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳提取條件。在60%乙醇溶劑、料液比1∶25、超聲處理時(shí)間30min、水浴浸提時(shí)間2.5h的條件下提取車前草中的活性成分，黃酮的提取率最大為5.76%。當(dāng)黃酮提取液的濃度為0.12mg·mL-1時(shí)，其對DPPH·的清除率達(dá)到90%左右。