不同產(chǎn)地牛至化學(xué)成分比較研究

朱曉富，盧圣鄂，卓 維，劉 艷，辛元堯，黃紅燕，任風(fēng)鳴

（重慶市藥物種植研究所，重慶市南川區(qū) 408435）

牛至（Origanum vulgareL.）又名止痢草、小葉薄荷等，是唇形科（Lamiaceae）牛至屬（Origanum）多年生草本植物［1］，收載于《中國藥典》1977年版和《湖南中藥》1993 年版［2］。在我國，牛至野生分布十分廣泛，西南、長江沿岸地區(qū)、西北、華北等地均有分布［1，3-4］；路旁、山坡、林下及草地，海拔500～3 600 m皆可生長［4］。它具有清熱解表、利水消腫的功效，主治感冒、頭痛、急性胃腸炎、中暑、腹痛以及水腫等癥［5-7］。

牛至中的成分主要為揮發(fā)性成分，其芳香精油因具很好的抗菌作用而被廣泛研究［8-9］。非揮發(fā)性成分，如酚、黃酮、三萜、甾體和其他化合物則很少被研究［10-13］。牛至產(chǎn)地不同精油含量差異顯著［15-16］。牛至精油成分以香荊芥酚和麝香草酚為主，是一種天然、環(huán)保且安全的理想抗生素替代品［5，17］。

本課題組于2020 年對云南省和四川省產(chǎn)地牛至中香荊芥酚、麝香草酚含量的測定和主要活性成分差異進行了分析，為今后牛至產(chǎn)地的選擇和評價提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（沃特世公司）；GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津）；GS-100A超聲波提取器（深圳市歌能清洗設(shè)備有限公司）；WondaSil-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm × 5 μm），（日本島津）；BP121S 型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；GZX-9246MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；XS-D4A 高速萬能粉碎機（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；HH-S4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.1.2 材料與試劑

牛至樣品分別采自于云南省、四川省，采集時間為2020 年8 月，經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為唇形科植物牛至（Origanum vulgareL.）的干燥地上部分，10 個產(chǎn)地結(jié)果見表1，分別用L1-L10 表示。香荊芥酚（CAS：499-75-2，純度≥98%）、麝香草酚（CAS：89-83-8，純度≥98%）均購自于四川省維克奇生物科技有限公司。

表1 10個不同產(chǎn)地牛至的樣品Tab.1 10 samples from different oregano

1.2 方法

1.2.1 HPLC測定香荊芥酚、麝香草酚含量方法1.2.1.1 HPLC 分析條件：色譜柱：WondaSil-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm × 5 μm）；流動相：（甲醇25%，乙腈25%，水50%）；流速（1 mL·min-1），柱溫（30℃）；進樣量（20 μL）；波長（276 nm），參考文獻劉紅兵［3］。1.2.1.2 對照品溶液：稱取香荊芥酚和麝香草酚標準品，置于容量瓶中，甲醇定容，得到香荊芥酚質(zhì)量濃度0.018 7 mg·mL-1、麝香草酚質(zhì)量濃度0.014 4 mg·mL-1的對照品溶液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備：精密稱量牛至樣品細粉約1.0 g，置三角瓶中，甲醇溶液25 mL 浸泡，超聲處理45 min，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.2.2 HPLC 測定香荊芥酚、麝香草酚含量方法學(xué)考察

1.2.2.1 精密度檢查：以（1.2.1.2）方法制備出的對照溶液，重復(fù)5次，記錄峰面積，計算香荊芥酚、麝香草酚的RSD結(jié)果。

1.2.2.2 重現(xiàn)性檢查：選擇含香荊芥酚0.211%，麝香草酚0.341%的牛至樣品，采用（1.2.1.3）方法制備供試品，每次20 uL 進樣，記錄峰面積，計算香荊芥酚、麝香草酚的RSD結(jié)果。

1.2.2.3 穩(wěn)定性檢查：采用（1.2.1.3）方法制備供試品，分別在0 h，3 h，6 h，12 h，18 h，24 h 范圍內(nèi)進行試驗，每次20 uL 進樣，記錄峰面積，計算香荊芥酚、麝香草酚的RSD結(jié)果。

1.2.2.4 加樣回收率實驗：選擇已知含量的枳殼藥材1.0 g，采用（1.2.1.3）方法制備供試品，準確添加適量香荊芥酚、麝香草酚，記錄峰面積，計算香荊芥酚、麝香草酚的平均回收率和RSD結(jié)果［16-18］。

1.2.2.5 線 性關(guān)系考察：本方法參照文獻［16-18］，以（1.2.1.2）方法制備出的對照溶液0.5 μL，1 μL，2 μL，4 μL，8 μL，16 μL，24 μL 范圍內(nèi)進樣測定，以峰面積對對照品的進樣量做工作曲線，得回歸方程。

1.2.3 GC-MS分析牛至中成分

1.2.3.1 GC-MS分析條件：GC-MS2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津），石英毛細管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm），柱初溫（40℃），保持（2 min），升溫速率（5℃·min-1），柱終溫（200℃），保持（15 min），載氣（He），分流比（50∶1），進樣量（2 μL）。MS 條件：離子源（EI），電子能量（70 eV），掃描范圍（45～600 m/z），離子源溫度（230℃），接口溫度（260℃），本方法參照文獻［22-23］。

1.2.3.2 GC-MS 牛至樣品溶液制備：準確稱取牛至粉末約1.0 g，加入10 mL 甲醇，超聲波45 min，通過0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.4 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0 和Excel 統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至含量測定HPLC方法學(xué)考察結(jié)果

通過方法學(xué)考察確定儀器精密度、重復(fù)性均良好，樣品處理后24 h 內(nèi)吸光度較穩(wěn)定，且加樣回收率較理想，線性關(guān)系考察結(jié)果表明香荊芥酚進樣量在0.000 9～0.448 8 μg 范圍時和麝香草酚進樣量在0.007 2～0.345 6 μg 范圍時呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。說明采用HPLC 法可適用于牛至中的香荊芥酚以及麝香草酚含量測定。

表2 HPLC方法學(xué)考察結(jié)果（n=6）Tab.2 Investigation results of HPLC methodology（n=6）

2.2 牛至中香荊芥酚、麝香草酚含量HPLC 測定結(jié)果

在我國，牛至中香荊芥酚和麝香草酚的含量因產(chǎn)地不同差異顯著。在牛至中香荊芥酚含量上，昆明、大理、麗江部分產(chǎn)地的含量較高；在牛至中麝香草酚含量上，大理、麗江和四川部分地區(qū)的含量高。昆明西山貓貓菁和昆明長蟲山兩個產(chǎn)地的牛至中麝香草酚含量較低，低于1%。大理產(chǎn)地的牛至中香荊芥酚含量較低，在1.5%左右。在牛至中香荊芥酚和麝香草酚總量上，大理、麗江采摘的牛至中兩種化合物總含量相對高些，品質(zhì)相對好些。HPLC 色譜圖見圖1，不同牛至樣品中麝香草酚以及香荊芥酚的含量見表3。

表3 樣品來源及測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Sample sources and measurement results（n=3）

圖1 牛至對照品（A）、牛至樣品（B）HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of oregano reference substance（A）and oregano sample（B）

2.3 GC-MS分析不同產(chǎn)地牛至成分

樣品GC-MS譜圖中，依次對物質(zhì)含量高且峰型完整的色譜峰積分，對所積分色譜峰開始質(zhì)譜掃描，質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索（質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST08s.LIB），參考已發(fā)表的相關(guān)文獻來確定相關(guān)化合物的名稱，綜合分鑒定出牛至中21種主要成分，采用峰面積歸一化法測定牛至中化學(xué)成分相對含量。綜合比較、評價不同產(chǎn)地牛至化學(xué)成分的差異。GC-MS 色譜圖見圖2，結(jié)果見表4。

圖2 牛至的GC-MS色譜圖Fig.2 GC-MS chromatogram of oregano

從表4 數(shù)據(jù)分析可得，10 個產(chǎn)地牛至成分結(jié)果對比，所含成分種類相同，主要基本成分一致，綜合分析鑒定出21種主要相同成分。

表4 不同產(chǎn)地牛至化學(xué)成分分析結(jié)果Tab.4 Chemical composition analysis results of oregano from different origins

在牛至21 種成分中，香荊芥酚含量占15%～34%，其中L1、L2、L3、L7 中的香荊芥酚相對于其他產(chǎn)地較高，含量在30%以上，含量分別為30.22%、32.28%、33.28%、34.18%，而L8、L9 相對于其他產(chǎn)地最低，含量為13.58%、15.36%；麝香草酚含量在牛至21 種成分中占15%～42%，其中L3、L5、L7 中的麝香草酚相對于其他產(chǎn)地較高，含量在32%以上，含量分別為32.30%、42.27%、35.34%，而L1、L2 相對于其他產(chǎn)地最低，含量為20.12%、15.11%；鄰傘花烴含量相對較低，在牛至21 種成分中占0.35%～1.6%，其中L6 含量1.69%、L7 含量0.91%相對較高。石竹烯也是牛至草的主要成分，含量在牛至21種成分中占2%左右。此外，牛至中還有γ-松油烯、石竹烯、大牛兒烯D以及γ-欖香烯。

除主要成分之外，牛至中還檢測到了含量很高的焦兒茶酚，含量在13%～28%，其中L2、L8 相對于其他產(chǎn)地含量較高，含量分別為28.23%、25.17%，而L6、L7 相對于其他產(chǎn)地含量較低，含量分別為13.18%、12.71%。另外，本實驗同時檢測到牛至中含有少量的葉綠醇和植物醇。

3 討論與結(jié)論

牛至精油中含有芳香類、萜類以及鞣酸等多種成分。藥理研究表明，其具有抗菌抗氧化等活性［24-28］。文獻報道，牛至中含有香荊芥酚和麝香草酚，且含量較高。香荊芥酚是牛至中主要的藥用成分，因此它成為了被研究最多的精油成分之一，由于香荊芥酚的抗菌能力，牛至常被用來緩解動物腸道疾?。?9-31］。麝香草酚也是存在于牛至精油中一種抗菌物質(zhì)，單獨使用或與香荊芥酚一起使用時具有很強的抗菌作用［29-31］。牛至中的香荊芥酚和麝香草酚兩個化合物結(jié)構(gòu)相似，互為同分異構(gòu)體，并在牛至中存在一定的轉(zhuǎn)換關(guān)系［19］。通過一次性測定不同產(chǎn)地牛至中香荊芥酚與麝香草酚含量，可以更客觀地評價牛至質(zhì)量。

本研究建立了HPLC 法測定牛至中香荊芥酚和麝香草酚含量的方法。在液相色譜圖中，對照品均與所對應(yīng)樣品出峰的保留時間保持一致，可作為牛至質(zhì)量控制的方法。同時，對10個不同產(chǎn)地的牛至進行了含量測定。結(jié)果表明，牛至中香荊芥酚和麝香草酚的含量因產(chǎn)地不同具有一定的差異。在牛至中香荊芥酚含量上，昆明、大理、麗江等地的含量較高；在牛至中麝香草酚含量上，大理、麗江和四川等地的含量高。綜合分析，大理、麗江等地牛至中香荊芥酚與麝香草酚總量較高，品質(zhì)較好。同時，不同海拔高度地區(qū)產(chǎn)的牛至，其中有效成分含量也差異顯著，通常牛至在海拔較高的產(chǎn)地有效成分含量相對較低［32］。

通過比較不同產(chǎn)地的牛至中香荊芥酚和麝香草酚的含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地存在較大的差異。因此，本實驗選取昆明、大理、麗江、四川產(chǎn)地牛至，利用GC-MS 分析鑒定出了牛至中的21 種主要相同成分，依次為：烯類、醇類、醚類、酚酸類、醛酮醌類、酯類及烷烴類等化合物。在這些成分中，含量較高的成分有香荊芥酚含量占15%～34%，麝香草酚含量占15%～42%，焦兒茶酚含量在13%～28%，葉綠醇含量占6.5%～8.3%，鄰傘花烴含量占0.35%～1.6%，石竹烯含量占2%左右。與前期報道牛至中含有香芹酚、百里香酚和β-石竹烯等成分接近［33］。但由于所采用的方法不同，鑒定成分的種類、數(shù)量以及含量具有較大差異。

通過比較10個產(chǎn)地的牛至提取物的化學(xué)成分，各個產(chǎn)地化學(xué)成分一致，都鑒定得到了21種化學(xué)成分。但通過比較不同產(chǎn)地的牛至成分相對含量，發(fā)現(xiàn)存在較大的差異，說明牛至的資源品質(zhì)參差不齊，可能由于產(chǎn)地環(huán)境的不同、氣候的不同、基因的差異等多種因素共同影響。來自四川的3個產(chǎn)地的牛至化學(xué)成分差異較小，資源相近；云南省中不同產(chǎn)地牛至成分差異同樣較大；來自大理、麗江的4個產(chǎn)地的揮發(fā)油成分含量相對較高，質(zhì)量較好；來自昆明的相對小些。綜上所述，本實驗分析評價了我國不同產(chǎn)地牛至的主要活性成分差異，為今后牛至的產(chǎn)地選擇和鑒別提供科學(xué)依據(jù)和參考。