HPLC法同時(shí)測(cè)定烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯成分的含量

孫崇魯 章璐幸 俞松林 李士敏

浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100

烏藥Linderaaggregate(Sims) Kosterm.系樟科山胡椒屬植物，又名矮樟、香桂樟、銅錢柴，主產(chǎn)于浙江、湖南、廣西、安徽、廣東等地，以浙江省天臺(tái)縣較為著名，稱天臺(tái)烏藥，2018年入選新“浙八味”[1]。目前烏藥的研究大多集中在其根塊的化學(xué)成分和生物活性方面，烏藥根塊提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等廣泛的活性[2-5]，在中藥市場(chǎng)上已被用作治療藥物。但烏藥的地下塊根生長(zhǎng)緩慢，需要8～10年才能達(dá)到商品藥材的要求。在漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)過程中，烏藥莖葉部分資源利用率極低，大部分均被丟棄。然而，在民間醫(yī)學(xué)中，烏藥葉常用來治療急性蜂窩組織炎、臀癰、胃炎以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。歷代本草均有記載，烏藥葉具有溫中燥脾、消食殺蛔的功效，用于治療腹中寒痛[6]。浙江民間也常用烏藥葉入茶飲，有降脂、護(hù)肝等保健功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏藥葉具有明顯的抗氧化、降脂、改善記憶及消炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[7-10]。

課題組前期對(duì)烏藥葉進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從烏藥葉的乙醇提取物中分離得到了4個(gè)倍半萜內(nèi)酯類成分，分別鑒定為hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H。結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中atractylenolide III, lindenanolide H為首次從烏藥葉中分離得到。

圖1 4種倍半萜內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)圖

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[11]表明，倍半萜內(nèi)酯類具有抗腫瘤、抗瘧、抗菌消炎等活性。文獻(xiàn)[12]報(bào)道atractylenolide III具有抗炎、抗腫瘤、健脾運(yùn)脾以及促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等功效，提示倍半萜內(nèi)酯可能為烏藥葉所具主要功效的活性成分。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC同時(shí)測(cè)定烏藥葉中主要倍半萜內(nèi)酯類成分含量的方法，為建立全面合理的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供研究基礎(chǔ)，并利用此法對(duì)10批次不同產(chǎn)地的烏藥葉進(jìn)行測(cè)量，以期為今后在烏藥葉的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 對(duì)照品 hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H均自制，經(jīng)ESI-MS，1H-NMR和13C-NMR確認(rèn)，HPLC測(cè)定化合物純度，歸一化法計(jì)算純度>95%。流動(dòng)相所用乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

不同產(chǎn)地烏藥葉經(jīng)浙江大學(xué)新藥開發(fā)研究中心彭昕教授鑒定為烏藥葉Linderaeaggregateleaf，樣品信息見表1。上憑證標(biāo)本存于浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥物研究所。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取一定量的hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1 and B2, atractylenolide III, lindenanolide H對(duì)照品，分別加入適量甲醇超聲溶解，使各對(duì)照品濃度均為4.0 mg/mL。精密移取各對(duì)照品溶液 1.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得各對(duì)照品濃度均為0.4 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，并于4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取烏藥葉粉末約1.0 g于50 mL離心管中，加入50 mL甲醇，超聲提取30 min，離心取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液，濃縮至干得膏體，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用前取溶液?jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件 采用Inertsustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min, 10% A→30% A; 5～40 min, 30% A→90% A; 40～45 min, 90%→10% A; 45～50 min, 10% A)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。在上述條件下，混合對(duì)照品溶液及樣品溶液的色譜圖如圖2所示。

注：1. hydroxylinderstrenolide;2. 6-acetyl lindenanolide B1 and B2;3. atractylenolide III; 4.lindenanolide H圖2 混合對(duì)照品(A)和樣品溶液(B)HPLC色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得濃度分別為20、40、80、160、240、320、400 mg/L的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定hydroxylinderstrenolide, 6-acetyl lindenanolide B1and B2, atractylenolide III, lindenanolide H的峰面積，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，得到的峰面積取平均值，然后以對(duì)照品濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。由相關(guān)系數(shù)值可知4種倍半萜內(nèi)酯的濃度與峰面積之間的線性關(guān)系良好。

表2 4種標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)各個(gè)對(duì)照品的峰面積計(jì)算相應(yīng)的RSD，分別為1.90%、0.64%、0.57%、1.40%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取烏藥葉粉末(S-8)約1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，于 0、2、4、8、12、24 h后分別按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的峰面積計(jì)算相應(yīng)的RSD，分別為0.87%、1.31%、1.11%、1.14%,表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一產(chǎn)地的樣品粉末(S-8)，精密稱定6份，每份約1.0 g，分別按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的峰面積計(jì)算相應(yīng)的RSD，分別為1.63%、1.54%、2.00%、2.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知4種倍半萜內(nèi)酯含量的烏藥葉樣品6份(S-8)，分別精密加入對(duì)照品適量，然后按“2.2”項(xiàng)所述的方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算4種倍半萜內(nèi)酯化合物的平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的平均回收率在96.69%～104.50%，RSD均小于3.0%，表明該方法的回收率良好。

表3 4種倍半萜內(nèi)酯類化合物的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的烏藥葉粉末約1.0 g，精密稱定3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，記錄各倍半萜內(nèi)酯的峰面積，根據(jù)外標(biāo)法中的線性回歸方程方法計(jì)算樣品中 4 種倍半萜類成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地烏藥葉4種倍半萜內(nèi)酯含量測(cè)定結(jié)果 (n=3, mg/g)

3 討論

鑒于倍半萜內(nèi)酯類為脂溶性化合物，重點(diǎn)考察了幾種無水有機(jī)溶劑的提取能力，包括乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用甲醇做溶劑時(shí)所測(cè)各指標(biāo)平均含量較高。同時(shí)也考察了提取方法的影響，包括超聲提取及加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者差異不大?？紤]到超聲的簡(jiǎn)便易行，所以選擇了超聲提取。

試驗(yàn)分別對(duì)4個(gè)倍半萜內(nèi)酯的溶液進(jìn)行了紫外全波長(zhǎng)掃描，其最大吸收波長(zhǎng)基本上都在210 nm左右，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]，分別考察比較了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等多種組合的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相在梯度洗脫情況下，所測(cè)的4個(gè)倍半萜內(nèi)酯成分分離效果較好，峰形窄而對(duì)稱。

對(duì)于10批次烏藥葉含量測(cè)定的結(jié)果表明，不同產(chǎn)地烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯成分含量差異很大，這可能與不同種植基地其烏藥引種來源以及不同的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。從收集的10批次烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯的總含量來看，來自于浙江和安徽的樣品明顯優(yōu)于其它產(chǎn)地。

試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定烏藥葉中4種倍半萜內(nèi)酯的HPLC分析方法，該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，對(duì)于評(píng)價(jià)烏藥葉質(zhì)量評(píng)價(jià)具有一定的參考價(jià)值。