水族抗痹證藥酒抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實驗研究

吉楊丹 帥 敏 吳 倩 梁子聰 王 恒 臧貴勇*

1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558003；2.黔南州人民醫(yī)院，貴州 都勻 558000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎( rheumatoid arthritis，RA) 是臨床上一種致殘性很高的疾病，其病理表現(xiàn)為滑膜炎性增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄，晚期可出現(xiàn)關(guān)節(jié)周圍肌肉萎縮及關(guān)節(jié)僵硬變形[1-3]。中藥治療RA在臨床應(yīng)用上已有較大的突破，其中雷公藤、祖師麻、青楓藤、白芍等有效成分亦被生產(chǎn)成中藥制劑用于臨床治療[4]。然而挖掘及開發(fā)更多中藥、民族藥抗RA制劑也成為目前熱門的課題。本方搜集于三都水族民族地區(qū)民間，其被應(yīng)用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、骨關(guān)節(jié)炎已有基礎(chǔ)，而且臨床效果較好。課題組前期已經(jīng)就該藥酒就急性毒性實驗進(jìn)行了研究并已發(fā)表相關(guān)論文。本實驗建立大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，以不同濃度水族抗痹證藥酒方灌胃干預(yù)，觀察其是否具有治療RA的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α ELISA試劑盒購自北京誠林生物公司，弗氏完全佐劑購于美國Sigma公司。顯微鏡 E200型(日本尼康)，酶標(biāo)儀MR-96A型(深圳邁瑞)等。

1.2 藥酒的制備 由刺五加、雷公藤、黑骨藤、楤木等按一定比例用53度白酒浸泡3個月以上。

1.3 實驗動物與分組 清潔級SD雌性大白鼠50只，體質(zhì)重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)。造模前用數(shù)字隨機(jī)法將大鼠其分成模型組，空白對照組，抗痹證藥酒高、中、低劑量治療組，每組10 只。

1.4 建模及灌胃 佐劑性關(guān)節(jié)炎建模[5]取羊毛脂16 g與液體石蠟(72 mL)加溫后置于研缽中，然后將卡介苗等體積滴加入研缽(逐滴加入)，充分研磨均勻后配制成CFA，并分裝至1.5 mL EP管中。除空白組外，其余各組大鼠用75%酒精對大鼠右足趾進(jìn)行消毒，將CFA 0.15 mL注射于大鼠右足趾皮下，空白組不作任何處理。建模成功后，水族抗痹證藥酒高、中、低劑量組分別給 5 mL/kg、2.5 mL/kg、1.25 mL/kg抗痹證藥酒提取物灌胃，空白組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每天 1次，持續(xù)2周。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量測定 造模第14天，末次給藥1 h后，股動脈取血，靜置，離心，取上清液，在-20 ℃下保存待測。白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量采用ELISA法測定，按照試劑盒說明書操作。

1.5.2 病理組織形態(tài)學(xué)檢查 取右踝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本于4%甲醛溶液固定，脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡鏡檢觀察。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行，計量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量測定的結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，抗痹證藥酒不同劑量組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，其中高劑量組血清白介素1-β含量，中劑量組和高劑量組血清白介素6含量，低劑量組、中劑量組、高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較具有顯著性差異(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的結(jié)果比較

3.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片觀察結(jié)果 正常組(圖1 A)關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)層次分明，細(xì)胞排列整齊，關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)未見破壞；模型組(圖1 B)足關(guān)節(jié)滑膜見明顯充血、水腫，血管翳形成，滑膜可見大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨輕度破壞；與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組(圖1 C、圖1 D、圖1 E)大鼠關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤情況相對減輕；與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況以及淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤最輕。

4 討論

RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎性介質(zhì)作用是其發(fā)病的主要因素。而白介素-1β、白介素6、腫瘤壞死因子-α是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)參與其致炎過程的主要促炎因子之一[2-3，6]。目前在白介素-1家族中有多個成員，其中白介素-1β是通過激活單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞參與RA的致炎過程。白介素-1β的主要作用是抑制骨和軟骨的修復(fù)，在RA致病過程中是導(dǎo)致骨和軟骨破壞的關(guān)鍵細(xì)胞因子[7]。研究[8]表明，腫瘤壞死因子-α比白介素-1β更具有致炎作用，高水平的腫瘤壞死因子-α除了參與RA關(guān)節(jié)破壞和滑膜炎癥外，還與肉芽腫樣滑膜炎產(chǎn)生相關(guān)。腫瘤壞死因子-α和白介素-1β兩種細(xì)胞因子之間雖然作用不同，但相互調(diào)節(jié)，抑制糖蛋白和膠原合成，影響軟骨的修復(fù)，加快骨質(zhì)破壞[9]。白介素6由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的，是RA關(guān)節(jié)炎癥中的重要炎癥介質(zhì)。它雖不直接參與滑膜增生和關(guān)節(jié)軟骨破壞，但它是腫瘤壞死因子-α和白介素-1β等炎癥因子的效應(yīng)因子，具有炎癥放大器的作用[10]。

大鼠注射佐劑后，關(guān)節(jié)可出現(xiàn)紅腫熱痛、功能障礙等炎癥表現(xiàn)，血清炎癥因子增高，關(guān)節(jié)滑膜增厚，炎細(xì)胞浸潤等病理表現(xiàn)，與RA患者的臨床表現(xiàn)十分相似，所以佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是一種公認(rèn)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型制作方法[5]。本實驗血清炎癥因子檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，抗痹證藥酒組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均有不同程度下降，而高劑量組血清白介素1-β含量、中高劑量組血清白介素6含量和低中高劑量組血清腫瘤壞死因子-α含量比較，具有顯著性差異(P<0.05)。踝關(guān)節(jié)鏡下病理觀察可見，與模型組相比，水族抗痹證藥酒不同劑量組(圖1 C、圖1 D、圖1 E)大鼠關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤情況相對減輕；與低中劑量組比較，高劑量組滑膜充血、水腫情況，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤情況最輕。證實抗痹證藥酒不同劑量組均具有佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量的作用，從而減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥，關(guān)節(jié)軟骨、骨質(zhì)破壞。水族抗痹證藥酒在抑制大鼠RA模型炎癥因子方面效果顯著，但其作用機(jī)制還有進(jìn)一步挖掘的價值。本實驗證實了該方具有抗RA的效果，為今后民族方藥開發(fā)與利用奠定了理論基礎(chǔ)。