生姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

潘雪莉，趙振軍，胡賢春

（長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe）起源于東南亞沿海[1]，屬姜科（Zingiberaceae）、姜屬（Zingiber）的一種多年生草本植物[2]。生姜因其地下根莖肉質(zhì)、氣味芳香、滋味辛辣，深受人們喜愛，已經(jīng)發(fā)展成為生活中必不可少的香辛料及保健蔬菜之一，目前我國(guó)大量栽種于的西南與華南等地區(qū)[3]。生姜以鮮食為主，但隨著生姜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，生姜汁也逐漸發(fā)展成為生姜深加工產(chǎn)品中的一種重要選擇[4]。

生姜汁富含多種生物活性成分，如生姜精油（萜烯類物質(zhì)）、生姜多酚、生姜多糖、脂類、有機(jī)酸和生姜粗纖維等。在藥用功能與保健作用方面，生姜精油具有清除自由基、抑制細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)等多種藥理功效；姜辣素、姜烯酚、姜黃素等具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗癌、抗氧化等功效[5-7]；近年來，關(guān)于生姜活性成分在降血糖方面的作用及其機(jī)制的研究備受關(guān)注，劉富月[8]利用生姜提取物開展了糖尿病小鼠麥芽糖負(fù)荷，發(fā)現(xiàn)生姜提取物可以提高小鼠對(duì)糖的耐受量，并顯著降低喂飼后小鼠的血糖值；Venkateswaran 等[9]利用微波輔助提取生姜多酚用于降糖活性研究，結(jié)果表明較低濃度的生姜多酚（6.25 μg/mL）即具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性、并在研究中證實(shí)生姜多酚可以通過提高GLUT4基因表達(dá)量和細(xì)胞中胰島素的活性，增強(qiáng)C2C12細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力，達(dá)到最終降低血糖的效果。Chen 等[3]關(guān)于生姜多糖的研究也表明生姜提取物多糖類不僅能有效清除羥基自由基、超氧自由基還具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

生姜汁中還含有豐富的生姜蛋白酶等具催化活性的蛋白類物質(zhì)[10]，前期的研究發(fā)現(xiàn)這些具催化活性的蛋白類物質(zhì)嚴(yán)重影響鮮榨生姜汁存放過程中的品質(zhì)變化，極易導(dǎo)致姜汁的褐化，并產(chǎn)生渾濁、絮狀、沉淀等現(xiàn)象，而這些具催化活性的蛋白類物質(zhì)在姜汁中是否影響姜汁的降糖作用及其在存放過程中降糖活性是否存在的動(dòng)態(tài)規(guī)律至今未見報(bào)道。

本文以5 個(gè)不同地方產(chǎn)的生姜榨成姜汁，分別研究鮮姜汁、姜汁存放過程及其熱處理過程對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性與抑制類型，旨在探討姜汁降血糖的生物學(xué)活性，為生姜降血糖功能的深入研究和深加工產(chǎn)品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試生姜源自5 個(gè)不同產(chǎn)地所產(chǎn)鮮姜，分別是山東臨沂大姜、湖北恩施鳳頭姜、四川自貢小黃姜、云南文山小黃姜和貴州鎮(zhèn)寧小黃姜；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純?cè)噭?，?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside，PNPG），北京索萊寶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase），Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-N 型電子天平，艾科儀器設(shè)備有限公司；HH-6 智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；DF-1 集熱式磁力恒溫?cái)嚢杵?，金壇市江南儀器廠；TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，浙江明德儀器有限公司；XD-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-4800 紫外可見分光光度儀，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 姜汁的制備

選取5 個(gè)不同產(chǎn)地所產(chǎn)鮮姜洗凈后切成小塊狀，用榨汁機(jī)榨汁，先用紗布粗濾，再經(jīng)離心機(jī)離心分離（6000 r/min，15 min），取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，按照單位體積所含鮮姜質(zhì)量，依次配成0.125、0.25、0.5、1.0、1.5 g/mL 5 個(gè)不同的濃度，冷藏備用。

1.3.2 不同品種及濃度姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定參考沈佳奇等[11]的方法，略作修改，具體如下：準(zhǔn)確移取0.01 mol/L PBS緩沖液0.4 mL，樣品組和背景組加入不同濃度的生姜汁0.4 mL，樣品組和陰性組加入0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液0.4 mL，振蕩均勻后于37 ℃恒溫保存5 min，樣品組、背景組和陰性組加入2.5 mmol/L PNPG 溶液0.4 mL，于37 ℃反應(yīng)30 min 后加1.6 mL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，以PBS 緩沖液為空白對(duì)照，于405 nm 處測(cè)定吸光度，每組重復(fù)3 次，按照公式（1）計(jì)算姜汁樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率：

式中：

OD背景——未加α-葡萄糖苷酶溶液吸光值；

OD陰性——未加姜汁的吸光值；

OD空白——不加姜汁和酶溶液的吸光值，體積不足部分加等體積緩沖液。

1.3.3 自然存放與熱處理后姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

選擇濃度為1.5 g/mL的山東臨沂大姜姜汁為研究對(duì)象，在室溫（25 ℃）和5 ℃的溫度條件下存放0、1、2、3、4、5 d 后，依次分別取樣測(cè)定存放過程的姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率；以存放5 d 后的姜汁為試材，在50、70、100 ℃分別加熱10、30、60、120、240、300 min，依次分別取樣冷卻后，參照試驗(yàn)方法1.3.1 開展對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定，每組重復(fù)3 次，計(jì)算姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.3.4 不同分子量大小姜汁組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

對(duì)濃度為1.5 g/mL的山東臨沂大姜姜汁分別采用3 ku 和10 ku 的超濾膜進(jìn)行超濾，將姜汁按照分子量（Mw）大小分為三類：Mw≥10 ku、Mw 在3～10 ku之間、Mw≤3 ku。按照試驗(yàn)方法1.3.1 測(cè)定并計(jì)算不同分子量大小的姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。

1.3.5 姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析

利用PBS 緩沖液分別配制濃度為0、0.5、1.5 g/mL山東臨沂大姜姜汁，設(shè)定底物PNPG 的濃度為2.5 mmol/mL，設(shè)置檢測(cè)的時(shí)間間隔為1 min，分析不同α-葡萄糖苷酶濃度下（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/mL）的酶促反應(yīng)速率（反應(yīng)速率則為吸光度的差值ΔOD值與時(shí)間t 的比值）。繪制α-葡萄糖苷酶濃度與酶促反應(yīng)速率的關(guān)系曲線，判斷抑制作用的可逆性。

設(shè)定α-葡萄糖苷酶濃度為0.3 U/mL，分別測(cè)定不同濃度姜汁（0、0.5、1.5 g/mL），在不同濃度底物PNPG（0.075、0.15、0.3、0.625、1.25、2.50 mmol/mL）作用下的酶促反應(yīng)速率，以1/PNPG 與1/V 為橫縱坐標(biāo)，按Lineweaver-Burk 方程繪制曲線，確定抑制作用類型。

1.3.6 姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶紫外-可見光吸收光譜的影響

分別準(zhǔn)確移取一定量0.075 g/mL 姜汁、0.075 g/mL 姜汁經(jīng)超濾后分子量＜3 ku 的組分、0.075 g/mL姜汁經(jīng)超濾后分子量＞10 ku 的組分、0.075 g/mL 姜汁經(jīng)超濾后3 ku＜分子量＜10 ku 的組分、0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶、0.15 g/mL 姜汁、0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶與等體積濃度分別為0.15、0.3、0.75、1.5 g/mL 的姜汁混合（放置5 min 后），在190～800 nm 波長(zhǎng)處的掃描分析紫外-可見光吸收光譜（以PBS 緩沖溶液作為參比調(diào)節(jié)基線，掃描分析均為山東臨沂大姜姜汁）。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Origin 2018 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析與作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種及濃度姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用結(jié)果

由圖1 可知，5 個(gè)不同產(chǎn)地姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶都有不同程度的抑制作用，其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效率具有明顯的地域或品種差異性，總體來看，山東臨沂大姜姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，當(dāng)姜汁濃度為1.5 g/mL 時(shí)，其抑制率可達(dá)到73.38%。同時(shí)姜汁的濃度顯著影響對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率與姜汁的濃度呈正相關(guān)，隨著姜汁濃度的增加，其對(duì)酶活性抑制率顯著增加，如山東臨沂大姜姜汁當(dāng)濃度從0.125 g/mL 增加至1.5 g/mL，其對(duì)酶活性的抑制率從3.91%提高到73.38%。而在不同濃度層面，不同產(chǎn)地或品種姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用表現(xiàn)出不同的效果，如姜汁濃度為0.125 g/mL 時(shí)，姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果為：云南文山小黃姜＞山東臨沂大姜＞四川自貢小黃姜＞湖北恩施鳳頭姜＞貴州鎮(zhèn)寧小黃姜；而當(dāng)姜汁濃度為1.5 g/mL 時(shí)，姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果為：山東臨沂大姜＞云南文山小黃姜＞湖北恩施鳳頭姜＞四川自貢小黃姜＞貴州鎮(zhèn)寧小黃姜。這可能與不同產(chǎn)地或品種的生姜中具有抑制酶活性的化學(xué)成分的含量及其在不同濃度下的存在形態(tài)有關(guān)[9,12]。

2.2 姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析

在不同濃度姜汁（山東臨沂大姜）的抑制作用下，分別在改變酶濃度（底物PNPG 濃度不變）和改變底物PNPG 濃度（酶濃度不變）的條件下測(cè)定姜汁抑制酶活性反應(yīng)體系中的酶促反應(yīng)速率，以α-葡萄糖苷酶的濃度為橫軸，以酶促反應(yīng)速率為縱軸作圖2a，圖2a顯示酶促反應(yīng)速率隨著酶濃度的變化呈現(xiàn)線性擬合關(guān)系，隨著姜汁濃度的增加，酶促反應(yīng)速率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，符合可逆抑制反應(yīng)的特征，因此可以判斷姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有可逆性。以不同底物PNPG 的濃度為橫坐標(biāo)，以酶促反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖2b，在酶濃度不變的條件下，酶促反應(yīng)速率與姜汁濃度和底物PNPG 的濃度呈正相關(guān)。利用底物濃度與酶促反應(yīng)速率的雙倒數(shù)作曲線，見圖3，發(fā)現(xiàn)不同濃度姜汁對(duì)應(yīng)的擬合線性曲線均交于Y 軸的同一點(diǎn)，表明隨姜汁濃度的變化，其曲線斜率隨濃度增加而減小，但抑制酶活性反應(yīng)的最大速率保持不變，由此判斷姜汁在抑制α-葡萄糖苷酶活性反應(yīng)體系中的抑制作用為可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

綜上所述，高中政治文化生活板塊中傳統(tǒng)文化的教學(xué)滲透要利用課堂情境，滲透?jìng)鹘y(tǒng)文化；利用實(shí)踐活動(dòng)，挖掘文化精髓；更新教師素養(yǎng)，滲透?jìng)鹘y(tǒng)文化，最終確保中國(guó)傳統(tǒng)文化融入工作思想政治教育的路徑更為暢通。

生姜對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有強(qiáng)烈的抑制作用，劉富月等[8]研究34個(gè)不同產(chǎn)地的生姜提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果，發(fā)現(xiàn)云南羅平小黃姜乙醇提取物的抑制率最高，動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明小黃姜乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用是可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[12]，本文在研究姜汁α-葡萄糖苷酶活性抑制過程中也發(fā)現(xiàn)姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用具有品種或產(chǎn)地及濃度差異性，但姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用表現(xiàn)為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制，可能姜汁中對(duì)α-葡萄糖苷酶活性發(fā)揮抑制作用的主要活性成分不同于小黃姜的乙醇提取物，因而導(dǎo)致抑制酶活性的機(jī)制存在差別。

2.3 貯藏過程中姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

以濃度為1.5 g/mL 山東大姜鮮姜汁為研究對(duì)象，分別測(cè)定在室溫25 ℃和低溫5 ℃條件下存放過程姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用動(dòng)態(tài)變化，貯藏過程中姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率見圖4a。結(jié)果表明姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率呈顯著下降趨勢(shì)，5 ℃存放姜汁的酶活性抑制率從71.32%降為30.69%，25 ℃存放姜汁的酶活性抑制率從72.27%降為32.61%，同時(shí)其對(duì)酶活性抑制率的下降也受存放溫度的影響，低溫5 ℃存放姜汁的酶活性抑制率下降速率（存放3 d 后抑制率為33.17%，僅為初期抑制率的46.5%）要高于室溫25 ℃存放的姜汁?？赡芘c低溫條件下姜汁中含有豐富的蛋白質(zhì)和多酚等類等有關(guān)，蛋白質(zhì)在低溫下空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，會(huì)促進(jìn)其他物質(zhì)與之相互作用，更容易發(fā)生締合作用[13]。

2.4 熱處理?xiàng)l件下姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

將濃度為1.5 g/mL的山東臨沂大姜鮮姜汁在低溫下經(jīng)過5 d 的貯存后，分別在50、70、100 ℃條件下進(jìn)行熱處理，測(cè)定熱處理過程中姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率，結(jié)果見圖4b。結(jié)果顯示，當(dāng)貯存后的姜汁經(jīng)過50、70、100 ℃熱處理后，姜汁對(duì)酶活性的抑制率快速增加，溫度越高增速越快，熱處理4 h 后對(duì)酶活性的抑制率達(dá)到最高，100 ℃條件下加熱4 h 后姜汁對(duì)酶活性的抑制率接近恢復(fù)至鮮姜汁的水平，達(dá)到60.11%，而熱處理4 h 后，姜汁對(duì)酶活性的抑制率開始顯著下降。

姜汁中活性物質(zhì)含量豐富，無論在室溫還是低溫條件下貯藏姜汁常表現(xiàn)為易褐化、產(chǎn)生絮狀沉淀等現(xiàn)象，而經(jīng)過存放后的姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著下降，可能與姜汁貯藏過程具有抑酶活性的物質(zhì)與姜汁中的大分子如蛋白類等發(fā)生締合作用有關(guān)，締合作用的發(fā)生會(huì)制約其對(duì)酶的抑制活性，而存放后的姜汁經(jīng)過熱處理抑酶活性顯著提高，說明抑酶活性物質(zhì)締合作用的產(chǎn)物不穩(wěn)定，通過熱處理有助于解絡(luò)合作用的發(fā)生[13]。

2.5 不同分子量姜汁組分對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

采用超濾膜分離的方法對(duì)同一濃度的姜汁（山東臨沂大姜姜汁，濃度為1.5 g/mL）按照分子量進(jìn)行分級(jí)，依次分為Mw≥10 ku、Mw 在3 ku～10 ku 之間和Mw≤3 ku，分別測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率（圖5）。由圖5 可知，Mw≥10 ku 的姜汁組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，最高可以達(dá)到67.16%，而Mw≤3 ku 的姜汁組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制效果較差，抑制率僅為13.65%。Mw 在3～10 ku 之間的姜汁組分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制效果在上述二者之間，抑制率為28.62%。結(jié)果表明姜汁中發(fā)揮抑制酶活性的物質(zhì)主要集中在Mw≥10 ku 組分中。

2.6 不同分子量姜汁紫外-可見光譜分析

對(duì)濃度為0.075 g/mL 的姜汁及其超濾組分（Mw≤3 ku、Mw≥10 ku、3 ku＜Mw＜10 ku）分別進(jìn)行紫外可見光譜掃描，結(jié)果如圖6 所示。由圖6 的光譜圖可知，姜汁及其超濾組分在波長(zhǎng)200～240、240～260、260～280 及390～420 nm 等處均有顯著的吸收峰，說明姜汁中含有核酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物。在波長(zhǎng)220～240 nm 處，姜汁超濾組分的吸收峰顯著高于原姜汁，說明經(jīng)過超濾后姜汁中在此波段有吸收峰的物質(zhì)濃度顯著提高；在波長(zhǎng)240～260、260～280 nm 處，超濾組分吸收峰與分子量呈正相關(guān)，與原姜汁相比，超濾后姜汁Mw≥10 ku 組分和3 ku＜Mw＜10 ku 組分中在此波段有吸收峰的物質(zhì)濃度顯著提高，姜汁Mw≤3 ku 組分中在此波段有吸收峰的物質(zhì)濃度略有降低。

2.7 姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶紫外-可見吸收光譜的影響分析

圖7 為不同濃度的姜汁與α-葡萄糖苷酶相互作用后的紫外-可見吸收光譜。α-葡萄糖苷酶在220 nm 處有最大吸收峰，不同濃度姜汁（0.15、0.3 g/mL）在220～280 nm 處均有較大吸收峰，0.15 g/mL 姜汁、0.3 g/mL 姜汁與0.3 U/mLα-葡萄糖苷酶混合后，雖然α-葡萄糖苷酶的吸收峰不顯著，但是與單純的姜汁的吸收光譜相比，姜汁與α-葡萄糖苷酶的混合液在240～260 nm 和260～280 nm 處的吸光值明顯降低，在其他可見光波段處混合液的吸光值也表現(xiàn)為顯著降低。

生姜對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用源于生姜的活性成分。生姜不同溶劑的粗提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率不同，其中乙醇提取物的抑制率最高[12]。進(jìn)一步的研究表明，生姜中具有降糖活性的物質(zhì)主要有黃酮[14]、姜辣素[15]和生姜多糖[3]等物質(zhì)，本研究姜汁在與α-葡萄糖苷酶互作的體系中，發(fā)現(xiàn)姜汁在紫外吸收光譜240～280 nm 波段處，吸光值顯著降低，說明姜汁中的核酸、蛋白酶、酚類氧化酶等物質(zhì)可能參與了對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。在多種有機(jī)物同時(shí)存在的分子體系中，有機(jī)物間極易通過分子自組裝或分子拼接等方式，形成新物質(zhì)[16]。姜汁活性成分是否通過分子拼接等方式發(fā)揮對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用尚待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

3.1 姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有顯著的抑制作用，濃度越高抑制效果越好，5 個(gè)不同產(chǎn)地生姜汁的抑酶效果顯示，山東大姜姜汁對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果最好；

3.2 經(jīng)過貯藏后姜汁的抑酶活性顯著降低，對(duì)貯藏后的姜汁進(jìn)行熱處理可以顯著提高α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果；

3.3 超濾膜分離結(jié)果表明，姜汁中發(fā)揮抑制酶活性的物質(zhì)主要集中在Mw≥10 ku 組分中；

3.4 通過姜汁與α-葡萄糖苷酶的紫外可見吸收光譜分析發(fā)現(xiàn)，姜汁在紫外吸收光譜240～280 nm 波段處，吸光值顯著降低，說明姜汁中在240～280 nm 處有吸收峰的物質(zhì)參與了對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。