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    嘔吐毒素對HK2 細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

    2022-07-29 12:11:34張百剛李金亮梁海榮黃橙輝徐冬梅
    現(xiàn)代食品科技 2022年7期
    關(guān)鍵詞:存活率孵育毒素

    張百剛,李金亮,梁海榮,黃橙輝,徐冬梅

    (蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

    嘔吐毒素(vomitoxin)是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)的別稱。20 世紀(jì)70 年代是由Yoshizawa 等[1,2]在鐮刀菌污染的小麥和禾谷類食物中發(fā)現(xiàn)并鑒定出來的,它的化合物種類屬單端孢霉烯B 族類化合物,主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生[3]。DON 的化學(xué)名為3a,7a,l5-三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮,是最常見的霉菌毒素之一。人和動物攝入含DON 的谷物食品會引起一系列中毒反應(yīng),例如腹脹、頭昏、嘔吐等一系列的不良反應(yīng)[4]。研究者發(fā)現(xiàn)高劑量的DON 可對動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的急、慢性毒性作用。研究表明,急性染毒DON 可導(dǎo)致小鼠肝、腎、脾、胸腺的細(xì)胞損傷[5],并會誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖作用[6]。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)DON 過量攝入可引起細(xì)胞毒性、遺傳毒性和免疫毒性[7,8]。雖然DON 的致癌性是不確定的,但對人體來說具有潛在的危險(xiǎn)性[9]。DON 的細(xì)胞毒性,在人體很多細(xì)胞系中被研究[10],研究表明在人肝癌細(xì)胞株(HepG2)中證明了DON 對人體細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的毒性,主要表現(xiàn)為DON 可以抑制細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致細(xì)胞存活率的降低,并且會誘發(fā)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的損傷[11]。

    隨著人們對食品安全的愈加重視,人們對所食用的谷物及其制品的要求越來越嚴(yán)格,目前世界很多國家制定了DON 的限量標(biāo)準(zhǔn)[12],國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布數(shù)據(jù),DON 已被列為三類致癌物。美國食品及藥品管理局規(guī)定DON 的含量為1 mg/kg 是其安全標(biāo)準(zhǔn)范圍。我國食品藥品管理局規(guī)定小麥和谷物類DON 的含量要求小于5000 μg/kg[13]。然而,超過此限量會產(chǎn)生一定的危害,所以研究DON 的毒性作用與毒性機(jī)制,對保護(hù)食品安全和人類健康具有重要意義。雖然研究者對DON 細(xì)胞毒性做了很多研究工作,但是對其引起人腎細(xì)胞毒性的研究還很少。本研究通過探討DON 對人腎小管上皮細(xì)胞HK2 的增殖作用和凋亡蛋白表達(dá)的作用機(jī)制,對進(jìn)一步闡明嘔吐毒素的細(xì)胞毒性提供更多的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細(xì)胞株及試驗(yàn)試劑

    HK2 細(xì)胞株購自蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院儲存庫;DON(白色粉末、純度≥95%)購自阿拉丁生物試劑;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自美國Hyclone公司;DMEM 培養(yǎng)基購自上海源培生物股份有限公司;青霉素和鏈霉素溶液以及PBS 溶液購自北京Solarbio 公司;Hoechst 33328 染色液購自南京建成生物試劑;流式細(xì)胞術(shù)試劑購自美國Becton Dickinson公司;Bax、bcl-2、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9 單克隆抗體均購自美國Proteintech 公司;牛血清白蛋白(BSA)和Triton X.100購自上海Beyotime 公司;LDH 試劑盒、Western 及IP細(xì)胞裂解液均購自碧云天公司;LDH 試劑盒堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)均購自碧云天公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    MCO-170AICL-PC CO2培養(yǎng)箱,普和希健康醫(yī)療器械有限公司;3-18KS 高速冷凍離心機(jī),北京博勱行儀器有限公司;Infinite M Nano 多功能酶標(biāo)儀,美國BIO-RAD 公司;CKX53+DP74 熒光倒置顯微鏡,上海劍凌信息科技有限公司;Beckman Altra 流式細(xì)胞儀,美國Beckman 公司;ChemiScope 6100 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;Mini 伯樂垂直電泳槽,美國Biorad 公司;Trans blot 伯樂濕式轉(zhuǎn)移槽,美國Biorad 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    將HK2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,完全培養(yǎng)基(10%的胎牛血清:DMEM=1:9),在5% CO2,37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí),用0.25%胰酶消化傳代。

    1.2.2 HK2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

    將100 μL(4×103cells/孔)HK2 細(xì)胞接種到96孔板中,待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí),分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON,在37 ℃,含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后,向孔板中加入20 μL/孔的MTT,之后在孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液,放在搖床上緩慢搖動10 min 至紫色結(jié)晶溶解后,用酶標(biāo)儀在490 nm 處測定吸光值。每組各設(shè)6 個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)平行3 次。

    將100 μL(4×103cells/孔)HK2 細(xì)胞接種到96孔板中,待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí),加入終濃度為30 μmol/L 的DON,在37 ℃,含5% CO2的孵育箱內(nèi)分別培養(yǎng)0、12、24、48、72 和96 h 后,向孔板中加入20 μL/孔的MTT,之后在孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后加入150 μL/孔DMSO 溶解液,放在搖床上緩慢搖動10 min 至紫色結(jié)晶溶解后,用酶標(biāo)儀在490 nm 處測定吸光值。每組各設(shè)6 個復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)平行3 次。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下:

    式中:

    W——細(xì)胞存活率,%;

    M——給藥組的OD 值;

    M1——對照組的OD 值。

    1.2.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測

    取對數(shù)生長期的HK2 細(xì)胞,分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON,在37 ℃,含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,然后加入4%的多聚甲醛300 μL,在室溫下固定15 min。固定完成后,PBS溶液清洗2 次,在搖床上緩慢搖動10 min,重復(fù)3 次。室溫避光條件下每孔加入300 μL Hoechst33328 染液,染色5 min。PBS 溶液清洗后,用抗熒光猝滅劑封片,片子避光保存,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

    1.2.4 細(xì)胞凋亡率測定

    取對數(shù)生長期的HK2 細(xì)胞,分別加入濃度為0、15、40 和80 μmol/L 的DON,在37 ℃,含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出,PBS 洗滌細(xì)胞1 次,加入適量的0.25%胰酶消化細(xì)胞,消化完成后吸出胰酶消化液,加入3 mL 新的完全培養(yǎng)基(DMEM:FBS=9:1)到離心管中,1000 g 離心5 min,棄上清,收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測。

    1.2.5 細(xì)胞中LDH 的測定

    取對數(shù)生長期的HK2 細(xì)胞接種到6 孔板/1000 μL,分別加入濃度為0、15、30、40、60 和80 μmol/L 的DON,在37 ℃,含5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,收集上清夜待測。按照試劑盒的說明,設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔和對照孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

    1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測Bax、bcl-2、Caspase蛋白表達(dá)水平

    取對數(shù)生長期的細(xì)胞,傳代到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞生長24 h 后,用濃度為0、15、30 和40 μmol/L的DON 處理細(xì)胞24 h,收集細(xì)胞,取上清液,BCA法測定蛋白濃度,按常規(guī)方法提取蛋白。SDS-PAGE電泳,10%分離膠,每孔上樣50 μg 提取的細(xì)胞總蛋白,電泳完畢后經(jīng)電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,室溫封閉1 h。按適當(dāng)比例加入一抗4 ℃搖床過夜,TBST 洗膜3 次,用TBST 按1:10000 比例稀釋二抗,室溫孵育1.5 h。用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。目的條帶與內(nèi)參條帶的比值作為結(jié)果,各處理組樣品與空白對照的比值表示蛋白水平。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果有可比性,對照組值設(shè)為l。

    1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

    所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SE)表示。采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。p<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 DON 抑制HK2 細(xì)胞的增殖

    不同濃度DON 對HK2 細(xì)胞的抑制作用如圖1 所示,由圖可知,DON 對HK2 細(xì)胞的生長具有抑制作用,且隨著濃度增大抑制作用越強(qiáng)。15~80 μmol/L 的DON 對細(xì)胞的抑制率分別為61.82%、53.64%、42.43%、38.66%和36.54%;30 μmol/L 的DON 處理HK2 細(xì)胞0、12、24、48、72 和96 h 后,細(xì)胞的存活率分別為99.84%、80.51%、60.25%、52.22%、62.50%和71.34%。從細(xì)胞存活率可知,30 μmol/L 處理HK2細(xì)胞48 h 后細(xì)胞毒性達(dá)到最大;但72 h 后細(xì)胞的存活率又有所上升。以上結(jié)果表明,DON 對HK2 細(xì)胞的抑制作用有一定的量效關(guān)系[14]。

    2.2 細(xì)胞形態(tài)的變化

    由圖2 的顯微鏡照片可看出,30 μmol/L 的DON可使HK2 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,與正常細(xì)胞相比,凋亡和死亡比例增大,說明DON 對細(xì)胞有毒性作用,并且造成細(xì)胞損傷。由圖3 的熒光顯微鏡照片可看出,不同濃度DON 作用細(xì)胞后,對照組染色質(zhì)均勻、無濃縮、邊集現(xiàn)象,細(xì)胞染色均一,無明顯亮藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組核染色質(zhì)明顯聚集、固縮、并且有細(xì)胞核碎片,凋亡小體出現(xiàn)。當(dāng)DON 濃度增大到40 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡和死亡的比例增大,當(dāng)DON 濃度增大到80 μmol/L 時(shí),細(xì)胞幾乎全部凋亡或死亡。

    2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測

    由圖4 可看出隨著DON 濃度的增大,細(xì)胞凋亡率升高,DON 濃度為15 μmol/L 時(shí),細(xì)胞凋亡率為2.30%,當(dāng)DON 濃度增大到40 μmol/L 時(shí),細(xì)胞凋亡率為30.20%,當(dāng)DON 濃度增大到80 μmol/L 時(shí),細(xì)胞凋亡率為53.50%。由此可說明,隨著DON 濃度的增大,細(xì)胞凋亡率不斷升高,DON 對HK2 細(xì)胞的凋亡有一定的促進(jìn)作用。

    2.4 細(xì)胞內(nèi)LDH 的含量

    由圖5 可知,DON 對HK2 細(xì)胞內(nèi)LDH 水平具有一定的影響。隨著DON 濃度增大,細(xì)胞存活率不斷下降,細(xì)胞毒性不斷上升,細(xì)胞內(nèi)LDH 水平不斷下降。當(dāng)DON 濃度為15 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對照組的73.50%。當(dāng)DON 濃度為30 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對照組的61.50%。當(dāng)DON 濃度為40 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對照組36.50%。當(dāng)DON 濃度為60 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)LDH 含量為對照組的30.90%。當(dāng)DON 濃度為80 μmol/L 時(shí),細(xì)胞內(nèi)LDH含量為對照組的18.20%。這就說明,隨著DON濃度增大,細(xì)胞毒性不斷提高,引起細(xì)胞發(fā)生了凋亡或壞死,結(jié)果造成了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞,隨后細(xì)胞漿內(nèi)的LDH 釋放到了培養(yǎng)液中。

    2.5 DON 對HK2 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

    2.5.1 不同濃度DON 處理HK2 細(xì)胞對Bax、bcl-2、NF-KB 蛋白表達(dá)的影響

    圖6 結(jié)果表明,Bax 蛋白隨著藥物濃度的增加而上調(diào);bcl-2 和NF-KB 蛋白表達(dá)下調(diào)。bcl-2 是抗凋亡蛋白,可以抑制蛋白表達(dá)量的增加,與此相反,Bax是促凋亡蛋白,可以促進(jìn)蛋白量的表達(dá)[15]。當(dāng)細(xì)胞被死亡信號刺激后,相關(guān)蛋白酶作用于促凋亡蛋白,使其構(gòu)象發(fā)生變化,引起細(xì)胞器各種功能的喪失,最終會引起細(xì)胞器的凋亡[16]。NF-kB 是一種有效的凋亡抑制劑,它會抑制蛋白與IkB 相結(jié)合,存在于胞質(zhì)中[17]。TNF 誘導(dǎo)時(shí),IkB 首先被磷酸化,然后被泛素降解。但是,NF-kB 二聚體被釋放,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。這些表達(dá)產(chǎn)物能夠抑制細(xì)胞的凋亡,從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。在DON 加藥誘導(dǎo)后,蛋白表達(dá)量增加,說明DON 激活了細(xì)胞內(nèi)NF-kB 的表達(dá),但是是否直接激活,還需要進(jìn)一步研究。

    2.5.2 不同濃度DON處理HK2細(xì)胞對Caspase家族蛋白表達(dá)的影響

    Caspase 屬于半胱氨酸蛋白水解酶的家族,它們各個成員的作用主要是引起細(xì)胞的凋亡[18],但是在細(xì)胞凋亡的過程中它們扮演著不同的角色。Caspase 凋亡蛋白酶在凋亡過程中起著不同的作用,研究者將其家族分為兩大類:始動Caspase 和執(zhí)行Caspase,其中始動Caspase 包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9,執(zhí)行Caspase 主要包括Caspase-3、Caspase-6。Caspase被激活后,作用于底物蛋白,使蛋白質(zhì)分解,引起PCD,這類酶控制著PCD 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和實(shí)施過程。圖7 結(jié)果表明,Caspase 凋亡蛋白都隨著DON 濃度增加呈現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)的趨勢,其中Caspase-3 的變化極為明顯,當(dāng)DON 濃度為15 μmol/L 時(shí),Caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著增加(p<0.001)。當(dāng)DON 濃度為30 μmol/L時(shí),Caspase-3 蛋白表達(dá)量有一定的增加(p<0.05)。當(dāng)DON 濃度為40 μmol/L 時(shí),Caspase-3 蛋白表達(dá)量具有上升趨勢,無顯著差異。Caspase-3 是它們成員中參與凋亡的關(guān)鍵酶之一,很多的細(xì)胞凋亡信號被其激活,使得細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及其細(xì)胞骨架中的重要的蛋白酶失活[13]。

    3 結(jié)論

    嘔吐毒素可顯著抑制人腎小管上皮細(xì)胞HK2 的增殖作用,并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系。嘔吐毒素會使HK2 細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變,進(jìn)而誘導(dǎo)HK2 細(xì)胞發(fā)生凋亡,表現(xiàn)出明顯的凋亡細(xì)胞特征。嘔吐毒素引起了HK2 細(xì)胞內(nèi)LDH 含量的變化,隨著嘔吐毒素濃度增大,細(xì)胞毒性不斷提高,細(xì)胞發(fā)生了凋亡或壞死,結(jié)果造成了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞。嘔吐毒素會使HK2 細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變,嘔吐毒素可上調(diào)Bax、Caspase-2、3、6、8、9 蛋白表達(dá),抑制了bcl-2 和NF-kB 的蛋白表達(dá)。

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