姜黃植物飲料對(duì)KM 小鼠的解酒作用

陳家明，焦春偉,2，梁慧嘉，鐘靜，謝意珍,2,3*

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東廣州 510663）

（2.廣東粵微生物科技有限公司，廣東肇慶 526000）

（3.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

中國(guó)酒文化歷史悠久，適量飲酒有通風(fēng)、散寒、舒筋、活血等作用；長(zhǎng)期過(guò)量飲酒易致骨骼、肌肉疾病及四肢萎縮等病變，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致酒精性肝臟損害，其表現(xiàn)為漸進(jìn)性的肝臟脂肪變性，進(jìn)而引起肝臟炎癥、纖維化或硬化的發(fā)生，甚至惡化成癌癥，嚴(yán)重危害人體健康[1-3]。市面上的“解酒藥”主要為西藥和中藥，西藥多是改善乙醇代謝的藥物，不正確使用對(duì)身體存在毒副作用[4]；而解酒類(lèi)中藥以葛根、枳椇子等藥材為主，大多局限于對(duì)單一原料的解酒功效研究[5]。目前市面上宣傳有解酒作用的產(chǎn)品，雖然種類(lèi)繁多，但大多存在作用機(jī)制不清晰、解酒效果不明顯等問(wèn)題。因此，開(kāi)發(fā)成分安全、功效明確的天然解酒制品，并對(duì)其作用效果和作用機(jī)制進(jìn)行探索，具有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

姜黃植物飲料（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“姜黃飲”）由姜黃素、葛根、枳椇子、玉米低聚肽粉等組成，通過(guò)小鼠醉酒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有解酒的功效。姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃（Curcuma longaL.）的干燥根莖，主要化學(xué)成分為酚類(lèi)和萜類(lèi)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、胃腸道保護(hù)以及減輕酒精引起的肝損傷等作用[6,7]，其主要活性成分姜黃素通過(guò)改善線粒體功能和減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥來(lái)減輕酒精引起的肝損傷[8]。葛根（Puerariae Lobatae Radix）作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有代表性的解酒藥材之一，具有解表退熱，生津、透疹、解酒等多種功效，其解酒的主要成分包括葛根素、總黃酮、多糖、多肽、黃豆苷元及其衍生物，具有抑制機(jī)體乙醇吸收、加快體內(nèi)乙醇代謝、抗氧化、保護(hù)肝臟、心肌細(xì)胞及神經(jīng)等作用[9,10]。枳椇是鼠李科枳椇屬植物枳椇（Hovenia acerbaLindl）的成熟干燥種子，是傳統(tǒng)常用的解酒護(hù)肝中藥，主要包括黃酮、三萜皂苷、苯丙素類(lèi)以及多糖等成分，具有保肝、解酒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等藥理作用[11,12]，可提高酒后肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）和微粒體乙醇氧化酶（EO）的活性，并可預(yù)防肝纖維化、酒精性和非酒精性脂肪肝[13]。玉米低聚肽是玉米蛋白經(jīng)酶水解、化學(xué)水解或微生物發(fā)酵及特定小肽分離純化技術(shù)獲得的小分子多肽，具有抗氧化、抗高血壓、保護(hù)肝臟、加快乙醇代謝、抗炎等作用[14]，其解酒機(jī)理主要包括激活乙醇代謝途徑中相關(guān)的酶、抗氧化、增強(qiáng)肝臟代謝能力，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)酒精引起的肝損傷具有保護(hù)作用[15,16]。

本文對(duì)姜黃飲對(duì)KM 小鼠的解酒作用及可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，以期為新型解酒產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

4 周齡雄性 KM 小鼠 48 只（許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007），體重25～28 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.2 樣品與試劑

56 °紅星二鍋頭酒，購(gòu)自北京紅星股份有限公司；ADH 試劑盒、ALDH 試劑盒、輔酶Ⅰ（NAD+）試劑盒、還原性輔酶Ⅰ（NADH）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞色素P450（CYP2E1）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；蘇木精-伊紅（HE），購(gòu)自廣州永津生物科技有限公司；乙醇、甲醛，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；磷酸緩沖液（PBS），購(gòu)自康寧公司；純凈水，購(gòu)自華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司。

1.1.3 設(shè)備

M200 PRO NanoQuant 酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；HM 340E 石蠟切片機(jī)、HistoStar 組織包埋機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific 公司；5804R 離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；7890A 氣相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies公司；ML-1600 顯微鏡，武漢康濤科技有限公司；ALT 160-4NM 型天平，德國(guó)KERN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃飲料的制備

將葛根、枳椇子，按料液比1:12，1:10，加水提取兩次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并提取液，過(guò)濾，濾液經(jīng)減壓濃縮、離心后加入配方量的姜黃素、玉米低聚肽粉等，攪拌至均勻，即得。分別配置姜黃飲低劑量組（JCL）（固含物0.2 g/mL；姜黃素含量0.92 mg/mL；總黃酮含量3.25 mg/mL），姜黃飲高劑量組（JCH）（固形物含量0.4 g/mL；姜黃素含量1.83 mg/mL；總黃酮含量7.39 mg/mL）。

1.2.2 小鼠防醉實(shí)驗(yàn)

取KM 小鼠48 只，按體重隨機(jī)分為4 組，即空白組（C）、模型組（M）、姜黃飲低劑量組（JCL）和姜黃飲高劑量組（JCH），每組12 只。實(shí)驗(yàn)前禁食48 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，姜黃飲低劑量和高劑量組以0.2 mL/10 g 灌胃，空白組和模型組以同等量水灌胃。30 min 后，除空白組外，各組均以0.15 mL/10 g劑量灌胃紅星二鍋頭酒，分別計(jì)時(shí)，記錄醉酒潛伏時(shí)間（灌酒后到翻正反射消失）和醒酒時(shí)間（入睡開(kāi)始直至翻正反射恢復(fù)）。

1.2.3 姜黃飲對(duì)醉酒小鼠血液中乙醇濃度的影響采用氣相色譜法[17]測(cè)定小鼠血液中乙醇含量色譜條件：安捷倫DB-1701 毛細(xì)管柱（(14%-氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷為固定相，柱長(zhǎng)為30 m，內(nèi)徑0.32 mm，膜厚度為0.25 μm）；進(jìn)樣口、柱溫箱、檢測(cè)器溫度分別為200、90、250 ℃；載氣N2、H2、空氣流速分別為20、30、400 mL/min；FID 檢測(cè)器；進(jìn)樣量：1 μL；分流比為30:1。稱(chēng)取乙醇（GC＞99.8%）1.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL 容量瓶中，加入水溶解并定容至刻度，搖勻，即得儲(chǔ)備液（20 mg/mL）。精密移取儲(chǔ)備液適量，用水分別稀釋成濃度1、2、4、8、10 mg/mL，搖勻，即得工作標(biāo)準(zhǔn)液。以乙醇的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以乙醇質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為y=253.41x+9.0524（R=0.9991）。

1.2.4 姜黃飲對(duì)醉酒小鼠肝組織 ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1、GSH-PX的影響

取血后將脫臼處死小鼠，取小鼠肝臟，經(jīng)冷PBS（4 ℃）洗凈、濾紙吸干水分后，稱(chēng)取其中的0.1 g加入至預(yù)冷的1 mL PBS 中，使用組織搗碎勻漿機(jī)制成勻漿，10000 r/min 離心15 min，提取上清液。按各試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定上清液中ADH、ALDH、NAD+、NADH、CYP2E1 和GSH-PX 含量。

1.2.5 胃和十二指腸病理切片的觀察

取小鼠胃和腸組織拍照后經(jīng)4%甲醛固定，修塊水洗，梯度乙醇溶液脫水至透明，浸蠟包埋，經(jīng)組織切片機(jī)處理后得到厚度約為4 μm 的切片，通過(guò)蘇木精-伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值x±SD 表示，多重組間比較采用One-way Anova。p＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01 為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.001 為有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠防醉酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空白組小鼠未攝入酒精，行為與正常小鼠無(wú)異。由表1 可知，模型組小鼠死亡率和醉酒率分別為41.67%和91.67%，姜黃飲低劑量組小鼠死亡率和醉酒率分別為33.34%和83.34%，高劑量組小鼠死亡率和醉酒率分別為16.67%和66.67%，說(shuō)明姜黃飲能降低小鼠的醉酒率及醉酒引起的死亡率。模型組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時(shí)間分別為74.00 min 和420.83 min，姜黃飲低劑量組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時(shí)間分別為98.25 min 和344.58 min，高劑量組小鼠醉酒潛伏期和醒酒時(shí)間分別為235.00 min 和232.00 min。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組均能延長(zhǎng)醉酒潛伏期、縮短醒酒時(shí)間，其中高劑量組的醉酒潛伏期顯著延長(zhǎng)，醒酒時(shí)間顯著縮短，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。羅安玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)葛根、藤茶、玉米低聚肽復(fù)合組方能顯著延長(zhǎng)小鼠的醉酒時(shí)間至55.14 min，縮短醒酒時(shí)間至75.88 min，明顯改善醉酒小鼠的行為學(xué)指標(biāo)（p＜0.05）。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的高劑量組類(lèi)似，表明姜黃飲高劑量組有明顯的解酒功效。

表1 小鼠的防醉酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of anti-inebriation test in mice

2.2 小鼠血液中乙醇含量結(jié)果

各組小鼠經(jīng)56 °紅星二鍋頭酒灌胃8 h 后，測(cè)定血液中乙醇的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。姜黃飲低、高劑量組小鼠血液乙醇含量分別為6.78 mg/mL 和4.21 mg/mL，與模型組7.29 mg/mL 比較，姜黃飲低、高劑量組均能降低血清乙醇含量，其中高劑量組血清乙醇含量明顯下降，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。表明姜黃飲可有效降低飲酒后血液中乙醇含量。何會(huì)等[18]研究表明，枳椇子葛根中劑量復(fù)方能降低醉酒小鼠血清中的乙醇、乙醛含量，降低醉酒率。姜黃飲解酒機(jī)制可能與此研究類(lèi)似。

表2 小鼠血液中乙醇的含量Table 2 Results of concentration of ethanol in blood of mice

2.3 姜黃飲對(duì)小鼠肝組織ADH和ALDH的影響

乙醇通過(guò)肝臟的氧化途徑和肝外組織的非氧化途徑進(jìn)行代謝，其中氧化途徑是最重要的乙醇代謝途徑，包括乙醇脫氫酶系統(tǒng)、肝微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)、過(guò)氧化物酶體系。乙醇在ADH、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)和過(guò)氧化氫酶的作用下氧化為乙醛，乙醛進(jìn)一步在ALDH 的作用下氧化為乙酸[19,20]。ADH 和ALDH 是酒精代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶[21]，其活力的變化是評(píng)估酒精代謝快慢的重要指標(biāo)。

如圖1 所示，小鼠攝入乙醇后，會(huì)引起機(jī)體ADH、ALDH 活力的升高。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟ADH 活力分別為2.76 U/mg prot 和3.74 U/mg prot。與模型組對(duì)比，姜黃飲低、高劑量組均可提高飲酒小鼠肝臟ADH 的活力（p＜0.05），表明姜黃飲各劑量組均能加快乙醇氧化為乙醛的速度，有利于乙醇的代謝。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟ALDH 活力分別為6.63 U/mg prot 和8.36 U/mg prot。與模型組對(duì)比，姜黃飲高劑量組可以提高飲酒小鼠肝臟ALDH 的活力（p＜0.05），表明姜黃飲高劑量組能加快乙醛氧化為乙酸的速度，加速乙醇的代謝。該結(jié)果與陶施民等[22]研究結(jié)果相同，其研究發(fā)現(xiàn)葛根枳椇子梔子膠囊通過(guò)增強(qiáng)肝乙醇代謝關(guān)鍵酶ADH和ALDH及抗氧化酶活性，加快酒精在體內(nèi)代謝的速度。

2.4 姜黃飲對(duì)小鼠肝組織NAD+和NADH 的影響

NADH 和NAD+參與許多重要的細(xì)胞反應(yīng)，其在細(xì)胞中的水平及比例，決定了細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行的速度[20]。乙醇在肝臟中氧化代謝過(guò)程，ADH 將乙醇氧化成乙醛，同時(shí)伴隨著輔酶NAD+還原為NADH 的過(guò)程，乙醇氧化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)和線粒體中肝臟NADH/NAD+比率顯著增加[23]。

如圖2 所示，模型組NAD+含量為0.12 nmol/mg prot，與空白組相比極顯著增加（p＜0.001），NADH/NAD+的比值顯著降低（p＜0.01）。姜黃飲低、高劑量組NAD+含量分別為0.07 nmol/mg prot 和0.08 nmol/mg prot，與模型組相比顯著降低（p＜0.01）；NADH 含量分別為0.34 nmol/mg prot 和0.39 nmol/mg prot，與模型組相比分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和顯著提高（p＜0.05，p＜0.01），NADH/NAD+的比值顯著提高（p＜0.01），表明姜黃飲可加速NAD+向NADH 的轉(zhuǎn)化，加速乙醇的代謝。

2.5 姜黃飲對(duì)小鼠肝組織細(xì)胞色素P450（CYP2E1）和GSH-PX 的影響

當(dāng)機(jī)體乙醇濃度超過(guò)10 mmol/L，乙醇氧化系統(tǒng)被激活成主要的酒精代謝途徑，細(xì)胞色素P450（CYP2E1）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸參與反應(yīng)，將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛[24,25]。如圖3 所示，模型組小鼠肝臟CYP2E1 含量為58.11 pg/mg，與空白組相比極顯著降低（p＜0.001），表明乙醇會(huì)降低小鼠肝臟CYP2E1的含量。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟CYP2E1 含量分別為58.89 pg/mg 和78.51 pg/mg，姜黃飲高劑量組與模型組相比小鼠肝臟CYP2E1 含量極顯著提高（p＜0.001）；低劑量組含量雖然沒(méi)有顯著升高，但也呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，表明姜黃飲可提高肝臟中CYP2E1的含量，加速乙醇代謝，發(fā)揮解酒作用。該結(jié)果與鄭連姬等[25]研究結(jié)果作用一致，其研究表明魔芋葡甘露聚糖通過(guò)提高肝臟中ADH、ALDH、P450 含量，加速乙醇代謝，發(fā)揮其防醉解酒作用。

GSH-PX 是肝臟細(xì)胞內(nèi)主要的水溶性抗脂質(zhì)過(guò)氧化的物質(zhì)，其含量的高低決定著抗氧化能力的強(qiáng)弱[26]。酒精長(zhǎng)期使用者，其肝細(xì)胞內(nèi)GSH-Px 含量會(huì)明顯降低甚至耗竭，其中肝臟中GSH-Px 減少在線粒體中最為明顯，從而加劇對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的損害[27]。如圖3所示，模型組小鼠肝臟GSH-Px活力為914.5 pg/mg，與空白組相比極顯著降低（p＜0.001），表明乙醇會(huì)降低GSH-Px 的活力，機(jī)體抗氧化功能減弱。姜黃飲低、高劑量組小鼠肝臟GSH-Px 活力分別為1285.00 pg/mg 和1341.00 pg/mg，與模型組相比極顯著提高（p＜0.001），表明姜黃飲可以增強(qiáng)小鼠肝臟中GSH-PX 的活力，提高其抗氧化能力，減輕乙醇代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。該結(jié)果與范土貴等[28]研究結(jié)果類(lèi)似，表明姜黃素超分子包合物通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px 的活力以及降低丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量來(lái)改善乙醇誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞的損傷。

2.6 姜黃飲對(duì)小鼠胃部和小腸的影響

如圖4 所示，與空白組對(duì)比，模型組小腸可見(jiàn)明顯的水腫和出血點(diǎn)，十二指腸損傷嚴(yán)重。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組小鼠小腸水腫和出血點(diǎn)明顯減少，表明姜黃飲可減輕乙醇對(duì)小鼠腸道引起的損傷，減少小鼠腸道出血和水腫。

與空白組對(duì)比，模型組小鼠胃部可見(jiàn)明顯的水腫。與模型組相比，姜黃飲低、高劑量組小鼠胃部均未出現(xiàn)水腫。表明姜黃飲對(duì)小鼠胃部和腸道有保護(hù)作用。

2.7 姜黃飲對(duì)小鼠胃部和十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖5 所示，模型組小鼠的胃粘膜可見(jiàn)明顯的出血、粘膜下水腫，上皮細(xì)胞分離、脫落，腺體排列不規(guī)則等現(xiàn)象，而姜黃飲各劑量組均有不同程度的改善，其中姜黃飲高劑量組改善最為明顯。這可能與姜黃飲中的姜黃素的含量有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與龐曉軍等[29]研究解酒飲對(duì)急性胃黏膜損傷小鼠的保護(hù)作用相同，表明姜黃飲可以改善乙醇對(duì)胃黏膜損傷，具有護(hù)胃作用。Alejandra 等[30]發(fā)現(xiàn)姜黃提取物有較強(qiáng)的胃保護(hù)作用，提取物中姜黃素含量的變化會(huì)影響其在乙醇誘導(dǎo)的損傷大鼠模型中胃潰瘍的預(yù)防作用，姜黃素的含量對(duì)于增強(qiáng)姜黃提取物的胃保護(hù)作用至關(guān)重要。

由圖5 可見(jiàn)，模型組小鼠的十二指腸腸絨毛嚴(yán)重脫落，腸道機(jī)械屏障損傷明顯。姜黃飲各劑量組均有不同程度的改善，其中姜黃飲高劑量組改善最為明顯。表明姜黃飲可保護(hù)十二指腸，減輕乙醇對(duì)十二指腸的損傷。

3 結(jié)論

本研究以自制的姜黃植物飲料，通過(guò)構(gòu)建高濃度酒精致小鼠醉酒模型，以小鼠防醉試驗(yàn)行為學(xué)變化、醉酒小鼠血液乙醇濃度、體內(nèi)乙醇代謝關(guān)鍵酶的含量或活性及胃腸組織變化為指標(biāo)，評(píng)價(jià)姜黃飲對(duì)小鼠的解酒作用。在姜黃解酒飲的干預(yù)下，小鼠醉酒率和醉酒引起的死亡率下降。與模型組相比，姜黃飲高劑量組醉酒潛伏期、縮短醒酒時(shí)間顯著延長(zhǎng)（p＜0.05），血液乙醇含量極顯著降低（p＜0.01），乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶活力顯著提高（p＜0.05），NADH/NAD+比值極顯著提高（p＜0.01），細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量極顯著提高（p＜0.01），表明姜黃飲能通過(guò)增強(qiáng)ADH、ALDH 活力，提高NADH/NAD+比值，增加CYP2E1 含量從而加快乙醇的代謝，有明顯的解酒作用。通過(guò)增強(qiáng)小鼠肝臟中GSH-Px 的活力，提高其的抗氧化能力，減輕乙醇代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害。姜黃飲還能明顯減輕乙醇對(duì)小鼠腸道引起的損傷，減少小鼠腸道出血和水腫。以上結(jié)果表明，姜黃飲具有解酒功效，對(duì)肝臟、胃部及十二指腸有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其增強(qiáng)機(jī)體乙醇代謝路徑關(guān)鍵酶及抗氧化酶的活性，加快體內(nèi)乙醇代謝速度，保護(hù)肝臟及胃腸道有關(guān)。