全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜法分析大曲清香型白酒中的揮發(fā)性香氣組分

張志勇，程 偉，陳興杰，杜先鋒，潘天全，楊金玉，李 增，高志遠

(1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036)

白酒是具有2000多年歷史的蒸餾酒，在中國傳統(tǒng)文化、食品及經(jīng)濟方面都占有重要的地位。中國白酒主要有12 種風味類型，其中清香、濃香、醬香及米香是4 種基本香型。清香型白酒因具有明顯的花香和果香、口味自然醇和、爽口回甘等特點，深受消費者的喜愛。大曲清香型白酒以高粱等糧谷為原料，低溫大曲為糖化發(fā)酵劑，發(fā)酵菌種來源于釀造環(huán)境中自然存在的各類微生物，采用固態(tài)地缸發(fā)酵，經(jīng)原料蒸煮、酒精發(fā)酵、淀粉糖化、制曲、原料處理、蒸餾取酒、陳釀及勾兌調(diào)味等工序制成。由于清香型白酒的開放式發(fā)酵方式，使其釀造體系的菌種多樣化，產(chǎn)生的香氣成分相對復雜。研究表明，白酒的揮發(fā)性成分中存在多種健康因子，包括酚類、酸類、酯類、含硫化合物等，使其具有抗氧化、保肝護肝、抑制膽固醇的合成、促進新陳代謝等功能。因此，了解白酒中特殊的揮發(fā)性組分成為重要的研究熱點。

對白酒中豐富多樣的風味物質(zhì)進行分離和濃縮等預(yù)處理，是進行后續(xù)揮發(fā)性物質(zhì)分析的重要步驟。頂空固相微萃?。℉eadspace-solid phase microextraction,HS-SPME）適用于多種樣品的揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的分析；HS-SPME 還可與其他技術(shù)相聯(lián)用，包括全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（Comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC×GC-TOFMS）。HS-SPME-GC×GC-TOF-MS技術(shù)具有峰容量大、分辨率高、分析時間短等顯著特點，已經(jīng)在白酒風味分析中得到應(yīng)用。楊波等運用HSSPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)鑒定出汾酒中含有358 種香氣化合物，241 種健康功能組分；YAO 等應(yīng)用該技術(shù)鑒定了瀘州老窖白酒的風味成分，發(fā)現(xiàn)了24 種具有生物活性的化合物，確定了瀘州老窖白酒中可能的特殊風味化合物來源，表明GC×GCTOF-MS 技術(shù)在白酒微量組成分析方面有明顯的優(yōu)勢。

香氣特征是白酒品質(zhì)的重要組成部分，揮發(fā)性組分是構(gòu)成大曲清香型白酒獨特香氣的重要部分，研究特征香氣組分對調(diào)控大曲清香型白酒的品質(zhì)具有重要意義。HS-SPME 結(jié)合GC×GC-TOF-MS技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為鑒定大曲清香型白酒中的揮發(fā)性香氣組分提供了方法與設(shè)備條件。本實驗采用頂空固相微萃取聯(lián)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（HS-SPME-GC×GC-TOF-MS）技術(shù)分析大曲清香型白酒的揮發(fā)性香氣組分，該研究為大曲清香型白酒的香氣組分分析與感官特征評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗酒樣：大曲清香型白酒（原酒），優(yōu)級酒（酒精度65.2 %vol，以下簡稱DQB），由安徽金種子酒業(yè)股份有限公司提供。

實驗耗材：超純水由Mili Q 純水儀制備(Milli-Q 系統(tǒng)，Millipore，Badford，MA，USA)；2 cm 50/30 μm 固相微萃取三相頭divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)，上海Sigma-Aldrich 貿(mào)易有限公司；無水硫酸鈉（化學純）、氯化鈉（化學純）等，中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司。

分析儀器：GC×GC-TOF-MS(Pegasus4D Leco Corporation，USA)系統(tǒng)：Agilent 氣相色譜儀（型號：7890A），美國LECO 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號：Pegasus 4D）；GC×GC 柱系統(tǒng)：第一維柱：DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，第二維柱：DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)，兩根色譜柱通過毛細管柱連接器以串聯(lián)方式連接。

1.2 實驗方法

HS-SPME 方法：用去離子水將DQB 的酒精度稀釋到10%vol，取5 mL 稀釋酒樣加至20 mL 頂空瓶中，加蓋密封。采用DVB/CAR/PDMS 纖維頭對頂空瓶中的樣品進行萃取，置于50 ℃水浴恒溫15 min 后，萃取30 min，隨后將纖維頭立即插入GC進樣口，250 ℃解吸附5 min，再進行GC×GC-TOFMS分析，相同條件下進樣3次。

GC×GC-TOF-MS 方法：第一維柱進樣溫度250 ℃，初始溫度40 ℃，保留5 min，以5 ℃/min升溫至220 ℃，以20 ℃/min升溫至250 ℃，保留2.5 min；氦氣(99.9999 %)1.0 mL/min，無分流；第二維柱的柱溫較第一維柱高5 ℃，調(diào)制解調(diào)器溫度始終保持高于第二維柱5 ℃，全二維分析調(diào)制周期4.0 s，接口溫度270 ℃，離子源溫度250 ℃，電子轟擊源70 eV，檢測器1680 v，采集率50 張/s，質(zhì)譜掃描范圍m/z 29～500，采用NIST譜庫。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；檢測器電壓1365 V，采集質(zhì)量數(shù)范圍35～500 amu、頻率100 spectrum/s，數(shù)據(jù)采集由LECO公司Pegasus4D工作站控制。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由LECO 公司Chroma TOF 工作站對采集的TOF-MS 數(shù)據(jù)進行處理，自動識別信噪比大于50的色譜峰，并自動比對質(zhì)譜庫。采用NIST 14 和Wiley 9 質(zhì)譜庫，自動比對“峰表”，經(jīng)人工解譜與同系物二維色譜出峰規(guī)律比對，作為初步鑒定結(jié)果。去除烷烴類等沒有風味貢獻的化合物，選擇相似度與反相似度均大于700，可能性大于4000 的化合物。在Chroma TOF 工作站中建立保留指數(shù)計算方法，確定化合物一維色譜柱保留指數(shù)，與文獻報道的保留指數(shù)比對，再選擇數(shù)值差異在50 以內(nèi)的化合物作為最終鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法應(yīng)用于DQB揮發(fā)性組分分離的特性分析

白酒中除乙醇和水以外，微量成分主要有醇類、醛類、酸類、酯類、含氮化合物以及其他成分，白酒中的揮發(fā)性香氣組分較為復雜，種類多樣，性質(zhì)各異。全二維氣相色譜采用連續(xù)調(diào)制的方式，將第一維色譜柱中分離的組分轉(zhuǎn)移到第二維色譜柱中進行進一步分離，有利于實現(xiàn)復雜組分的有效分離。根據(jù)被分離樣品的特點,GC×GC 系統(tǒng)的第一維柱子起到主要分離作用，是對極性組分有較好分離能力的極性柱子。厚液膜、中等極性的柱子可以將第一維流出的結(jié)構(gòu)相近的組分在第二維平面上實現(xiàn)較好的分離。

綜上，本實驗的GC×GC 柱系統(tǒng)采用DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)作為第一維柱，DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)作為第二維柱，兩根色譜柱通過毛細管柱連接器以串聯(lián)方式連接。如圖1 所示，全二維氣相色譜圖表明DQB 中存在復雜的揮發(fā)性香氣組分，經(jīng)過GC×GC 系統(tǒng)，DQB 中復雜組分得到了一定程度的分離，但是也存在組分的共流出現(xiàn)象，其色譜分離條件還有待于進一步優(yōu)化。

圖1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析的1D總離子流色譜圖與2D總離子流色譜圖

2.2 DQB 揮發(fā)性組分的HS-SPME-GC×GCTOF-MS鑒定

大曲清香型白酒的釀造工藝主要包括制曲、潤糝、發(fā)酵、蒸餾等，進行“清蒸”處理后的高粱和輔料攤涼后再添加低溫大曲，入缸密封發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過固態(tài)蒸餾得到原酒。釀造過程中，首次蒸餾后的酒醅加入低溫大曲進行二次發(fā)酵，再次蒸酒后作為丟糟，其釀造工藝特點可歸納為“清蒸清燒、地缸發(fā)酵、清蒸二次清”等，主體香是乙酸乙酯和乳酸乙酯等組分。杜艷紅等采用DI-SPME、LLE前處理方法結(jié)合GC-MS定性方法，在紅星二鍋頭（大曲清香型）白酒中鑒定出138 種化合物。如表1 所示，本實驗采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)在DQB中共檢測到可信度較高的揮發(fā)性組分251 種，包括56種酯類、54種醇類、38種酸類、30種醛酮縮醛類、6 種含硫化合物、6 種含氮化合物、21 種呋喃類、20種芳香族類及20種其他類型化合物。

表1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中分離鑒定的化合物統(tǒng)計

酯類化合物在大曲清香型白酒中起主要呈香作用，乙酸乙酯作為特征性的香氣組分，其含量決定了不同品牌清香型白酒的香氣特點和感官特征。清香型白酒“口微甜、刺激性較強、帶有一定的爽口苦味”等口感與醇類化合物的含量及比例有重要關(guān)系。酸類物質(zhì)對各香氣成分起到較好的協(xié)調(diào)、平衡等作用，能夠增加酒體的醇厚感；酸類物質(zhì)也是新酒老熟的重要催化劑，對香氣具有一定的抑制和掩蔽作用。醛類物質(zhì)雖然多但相對含量并不高，但是對清香型白酒的香氣具有較大的貢獻。由于呋喃類、芳香族及含硫化合物通常具有特殊香氣，可能對DQB 的香氣產(chǎn)生重要影響，因而，本文在鑒定出的揮發(fā)性香氣組分中著重對比分析了呋喃類、芳香族及含硫化合物。

2.2.1 呋喃類化合物

呋喃類化合物在白酒中的含量相對較低，研究表明呋喃類化合物是醬香型白酒的重要呈香物質(zhì)和特征化合物。如表2 所示，在DQB 中檢測到21種呋喃類化合物，其中的2-戊基-呋喃具有果香、青香及豆香，乙酸糠醛具有藥香、辛香。在豉香型白酒中也檢測到2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、2-戊基-呋喃及糠醛等特殊香氣物質(zhì)。苯并呋喃是本實驗中檢測到的另一重要化合物，具有特殊香氣，并具有多種生理活性，如抗腫瘤活性、抗氧化、抗菌等。DQB中檢測到的乙酸糠醛、苯并呋喃等呋喃類化合物，可能對DQB 獨特的香氣形成及人體健康具有積極影響，可作為DQB 的重要香氣組分。

表2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鑒定出的呋喃類化合物

呋喃類化合物在清香型白酒中的含量相對較低，可能對清香型白酒風味的貢獻較小，相關(guān)研究文獻也較少；因此，需要深入研究呋喃類化合物在清香型白酒香氣組分中發(fā)揮的作用。釀酒大曲和酒醅是酒體中呋喃類化合物的重要來源，釀酒工藝及蒸餾環(huán)境也是影響酒體中呋喃類化合物種類和含量的重要因素。綜上，乙酸糠醛、2-戊基-呋喃、苯并呋喃等具有特殊香氣的呋喃類化合物及其與其他香氣組分的相互作用，可能對DQB 的香氣產(chǎn)生重要影響。

2.2.2 揮發(fā)性含硫化合物

白酒中含有的揮發(fā)性含硫化合物一般由含硫氨基酸轉(zhuǎn)化而來，具有香氣閾值低的特點，能賦予白酒獨特的香氣。含硫化合物具有熱不穩(wěn)定性，極易發(fā)生氧化反應(yīng)，例如，二甲基硫、甲硫醇可氧化成二甲基二硫和二甲基亞砜等。如表3 所示，本實驗在DQB 中共檢測到6 種含硫化合物，其中，甲硫醇具有腐爛的卷心菜氣味，二甲基三硫具有洋蔥味，二甲基二硫具有洋蔥和白菜香味，在五糧液、劍南春、今世緣、汾酒等多種品牌白酒中均檢測到相關(guān)的幾種揮發(fā)性含硫化合物。在DQB 中檢測到的甲硫醇等揮發(fā)性含硫化合物會讓人產(chǎn)生不愉快的感覺，某些特殊的含硫化合物還可能對白酒香氣產(chǎn)生消極影響；因此，對含硫化合物的研究有助于進行DQB的品質(zhì)調(diào)控。

表3 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鑒定出的含硫化合物

揮發(fā)性含硫化合物對清香型白酒的風味有較大影響，是鑒定白酒缺陷的重要指標，可能對清香型白酒的香氣具有消極影響，或者影響其“清香醇正”的口感。大曲清香型白酒的釀造采用低溫大曲與“兩遍清”工藝，其制曲溫度與糧醅發(fā)酵溫度都較低，發(fā)酵過程中的霉菌及適宜中低溫的細菌菌群較為豐富；因而，其酒體中酯類和含硫化合物的含量與種類明顯較低，酒體主要突出乙酸乙酯的花草香氣，表現(xiàn)為“酒體醇凈”。

2.2.3 芳香類化合物

芳香類化合物是白酒中重要的呈香物質(zhì)，大多數(shù)的芳香族化合物呈幽雅的花香、水果香和甜香，具有香味突出且閾值低、沸點高、難揮發(fā)等特點，酒體的“優(yōu)雅、醇厚”等風味特點的形成與芳香族化合物有著重要的關(guān)系。如表4所示，本實驗在DQB中共檢測到20 種芳香類化合物，其中苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇在多種品牌白酒中被檢測到。研究表明，苯甲醛具有杏仁香味，苯乙醛具有植物花香，苯甲酸乙酯具似蜂蜜香味，苯乙酸乙酯具玫瑰香和蜂蜜香，苯丙酸乙酯具水果香味。綜上，苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯等具有特殊香氣的芳香族化合物，可能對DQB的香氣起到重要作用。

表4 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鑒定出的芳香族化合物

白酒中芳香族化合物的代謝途徑一是原料中的單寧、木質(zhì)素、阿魏酸、香草醛經(jīng)微生物發(fā)酵生成，二是在制曲時形成中間產(chǎn)物，微生物發(fā)酵生成并且在發(fā)酵過程中相互轉(zhuǎn)化。大曲清香型白酒在釀造過程中自然網(wǎng)羅了多種微生物，微生物在持續(xù)發(fā)酵過程中會產(chǎn)生豐富的酶系。釀酒原輔料中固有的揮發(fā)性物質(zhì)一部分可直接隨著蒸餾工藝進入原酒中，一部分則在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為其他揮發(fā)性成分；因此，原料和微生物是DQB 等白酒中香氣成分復雜的重要原因。

3 結(jié)論與討論

白酒釀造過程中的原料、制曲、發(fā)酵容器及地域環(huán)境等因素對釀造微生物種類及代謝具有重要影響，進而形成不同的特征性揮發(fā)性組分，直接影響白酒的香型和品質(zhì)。大曲清香型白酒在釀造過程中所形成的微生態(tài)環(huán)境，主要包括大曲微生物、酒醅微生物以及環(huán)境微生物的相互作用及影響，進而產(chǎn)生具有獨特香氣的風味化合物，使其酒體具有“清、爽、綿、甜、凈”等典型的感官特征。對復雜釀酒微生物之間的相互作用以及交叉代謝等過程，以及產(chǎn)生風味物質(zhì)的途徑等還需要深入研究，明確微生物菌群的代謝途徑、風味物質(zhì)的形成機制等是提高白酒品質(zhì)與風味的重要前提，其中樣品前處理方法及風味檢測設(shè)備與技術(shù)的不斷進步發(fā)揮著重要作用。

DQB 的香氣感官特征是多種揮發(fā)性香氣組分綜合呈香作用的結(jié)果，本實驗采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)對DQB 進行揮發(fā)性香氣組分分析，結(jié)果表明：（1）在DQB 中共檢測到可信度較高的揮發(fā)性組分251種，包括56種酯類、54種醇類、38種酸類、30 種醛酮縮醛類、6 種含硫化合物、6 種含氮化合物、21 種呋喃類、20 種芳香族類及20 種其他類型化合物；（2）DQB 中鑒定出的多種特殊揮發(fā)性香氣組分，如乙酸糠醛、2-戊基-呋喃、苯并呋喃、苯乙酸乙酯等，尤其是苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯等芳香族化合物，可能對大曲清香型白酒的香氣起到重要作用。本該研究為大曲清香型白酒的香氣組分分析與感官特征評價提供依據(jù)。