草魚鱗膠原蛋白肽對骨質(zhì)疏松小鼠骨微結(jié)構(gòu)、血清TNF-α、IL-1β與IL-6和腸道菌群的影響

楊 平，王麗娟，徐 昕，徐彩紅，公麗艷，黃 趁，許 青,*

（1.沈陽師范大學(xué)學(xué)前與初等教育學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一類以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅中老年人健康的骨代謝性疾病。我國老年居民OP患病率增長迅速，50 歲以上人群OP患病率達(dá)19.2%，65 歲以上人群患病率達(dá)32.0%。OP是一種整合協(xié)同信號通路和細(xì)胞因子的系統(tǒng)性疾病，炎性因子在OP發(fā)病中起重要作用。血清炎性細(xì)胞因子中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6等可以促進(jìn)破骨細(xì)胞吸收骨、抑制成骨細(xì)胞形成骨，導(dǎo)致骨密度下降，特別是TNF-α作為前炎性因子之一，可以始動(dòng)調(diào)節(jié)很多炎性因子的釋放，觸發(fā)骨的吸收。此外，OP還與腸道菌群有關(guān)，平衡的腸道菌群有利于維持骨代謝健康。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可以影響骨的積累和丟失，并可以與免疫系統(tǒng)共同影響卵巢切除C57BL/6小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。因此，通過營養(yǎng)干預(yù)炎性細(xì)胞因子的分泌，調(diào)控腸道菌群，成為了目前防治OP癥的新策略。

膠原蛋白肽（collagen peptide，CP）是膠原蛋白的酶解產(chǎn)物，可以促進(jìn)人體成骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞活性，平衡骨轉(zhuǎn)換的能力，預(yù)防與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失，而且可以調(diào)節(jié)腸道菌群，改變小鼠腸道微生物多樣性和糞便菌群組成。但是，目前對CP調(diào)節(jié)腸道菌群與預(yù)防OP的機(jī)制仍不清楚。

本研究通過切除小鼠卵巢建立OP模型，測定草魚鱗CP對小鼠股骨生物力學(xué)、骨微結(jié)構(gòu)、血清炎性細(xì)胞因子、腸道菌群相關(guān)指標(biāo)的影響，分析OP調(diào)節(jié)過程中CP與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度以及腸道菌群之間的關(guān)系，研究CP輔助治療OP的效果及其作用機(jī)制，期望為以CP作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑輔助治療OP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級6 月齡雌性ICR小鼠40 只，體質(zhì)量（18±2）g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2020-0001，每籠5 只，喂食普通顆粒飼料，室溫（20±2）℃，相對濕度40%～65%，自然光照，保持良好通風(fēng)，自由攝取水和食物。

草魚鱗購自沈陽大潤發(fā)超市。

復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）、風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g）丹麥Novozymes公司；鈣爾奇D 惠氏制藥有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

MN002型Micro CT掃描儀 德國布魯克公司；X-12R型高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；Scientz-12N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；MultiskanFC型多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 CP的制備

根據(jù)本課題組的前期研究工作，以草魚鱗為原料，選用復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶同步雙酶解，在酶質(zhì)量比6∶4、魚鱗質(zhì)量濃度18.75 g/L、酶解溫度51.5 ℃、pH 7的條件下酶解3 h，經(jīng)中空纖維膜（3 kD）過濾，得到CP溶液，凍干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 動(dòng)物分組及造模

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組（C組）、模型組(M組)、鈣爾奇D組（Ca組）、草魚鱗膠原蛋白組（PCa組），每組10 只。除C組外的各組小鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉麻醉后，取背側(cè)正中切口進(jìn)入腹腔，摘除雙側(cè)卵巢；C組術(shù)式同上，但不切除卵巢，僅切除卵巢大小的脂肪組織，術(shù)后恢復(fù)7 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。Ca組灌胃鈣爾奇D（260 mg/kg·d），PCa組灌胃CP（750 mg/kg·d）和鈣爾奇D（260 mg/kg·d），C組和M組灌胃1 mL的質(zhì)量濃度9 g/L氯化鈉溶液，每只小鼠灌胃1 次/d。連續(xù)喂養(yǎng)28 d后，無菌環(huán)境下取小鼠腸道糞便于滅菌EP管中，液氮凍存。糞便取樣完畢24 h后，取心臟內(nèi)血液和股骨備用。

1.3.3 股骨生物力學(xué)特性測定

采用三點(diǎn)彎曲法測定股骨生物力學(xué)特性。將離體的右側(cè)股骨置于10 mm跨距支架上，設(shè)置股骨中段為加載點(diǎn)，以1 mm/min加載速率勻速垂直向下擠壓至股骨斷裂，記錄最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力。

1.3.4 股骨微結(jié)構(gòu)分析

采用Micro CT掃描分析股骨微結(jié)構(gòu)。質(zhì)量濃度40 g/L多聚甲醛溶液固定小鼠左側(cè)股骨24 h后，設(shè)定掃描條件為50 kV電壓、800 μA電流、15 μm分辨率，沿股骨長軸掃描，選取距離股骨遠(yuǎn)端生長板1.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)（region of interest，ROI），提取圖像信息，進(jìn)行三維重組，以中心直徑為4 mm的圓柱體作為感興趣區(qū)，采用系統(tǒng)自帶的分析軟件對獲取圖像進(jìn)行定量分析，主要包括骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)中骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁空隙（trabecular separation，Tb.Sp）、結(jié)構(gòu)模式指數(shù)（structural model index，SMI）。

1.3.5 血清炎性細(xì)胞因子檢測

小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度檢測采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.6 腸道菌群多樣性分析

干冰運(yùn)輸小鼠糞便至上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增16S rRNA基因中的V3～V4區(qū)域，QIIME2平臺(tái)分析小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)微生物組數(shù)據(jù)。獲得每個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）代表序列的分類學(xué)信息，分析Alpha多樣性、Beta多樣性、分類學(xué)組成，鑒定組間差異物種。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚鱗CP對小鼠股骨生物力學(xué)特性的影響

由圖1可知，M組的最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為（159.3±12.1）MPa和（18.41±1.96）N，C組最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為（201.2±18.7）MPa和（27.75±2.02）N，M組極顯著低于C組（＜0.01），表明卵巢切除使小鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)下降，抗彎曲能力和抗外壓能力減弱；與M組比，PCa組最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為（178.2±13.3）MPa和（22.18±1.01）N，顯著升高（＜0.05），Ca組分別為（168.14±11.80）MPa和（19.13±2.01）N，升高不顯著（＞0.05）?？梢?，補(bǔ)充CP可以提高OP小鼠股骨的抗彎曲能力和抗外壓能力，增強(qiáng)股骨生物力學(xué)特性。

圖1 小鼠股骨最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力值Fig. 1 Maximum bending load and maximum bending stress of mouse femur

2.2 草魚鱗CP對小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響

骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)中BV/TV代表骨小梁的骨量，Tb.Th代表骨小梁平均厚度，Tb.N代表骨組織與非骨組織交點(diǎn)數(shù)量的平均值，Tb.Sp代表骨小梁之間的髓腔平均寬度，SMI代表描述小梁中板層結(jié)構(gòu)和桿狀結(jié)構(gòu)比例，發(fā)生OP后Tb.N和Tb.Th均減少，Tb.Sp和SMI均增加。由表1可見，與C組比，M組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th指標(biāo)顯著下降（＜0.05），Tb.Sp、SMI顯著提高（＜0.05），表明切除卵巢使小鼠骨小梁數(shù)量減少、厚度降低，骨板層結(jié)構(gòu)減少，骨分解大于合成。與M組比較，PCa組中BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著升高（＜0.05），Tb.Sp、SMI顯著下降（＜0.05），Ca組中BV/TV、Tb.Th顯著升高（＜0.05），Tb.Sp顯著下降（＜0.05），Tb.N、SMI沒有顯著變化（＞0.05），這表明補(bǔ)充CP和鈣爾奇D后股骨骨小梁數(shù)量增多、厚度增加，板層結(jié)構(gòu)增多，骨合成大于分解，且PCa組作用效果優(yōu)于Ca組。

表1 小鼠股骨的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Microstructure parameters of femoral trabecula in mice

由圖2可見，股骨Micro CT的ROI區(qū)三維重建圖像中M組和Ca組微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)相似，骨小梁數(shù)量較少，間距增大，連接性差，骨微結(jié)構(gòu)被破壞。PCa組骨小梁數(shù)量較多、較厚間距較小，連接性及完整性較好，未見斷裂現(xiàn)象，與C組圖像相似，表明補(bǔ)充CP后小鼠骨量增加，骨微結(jié)構(gòu)得到修復(fù)。

圖2 小鼠股骨小梁的三維結(jié)構(gòu)重建Fig. 2 Three-dimensional reconstructed structure of femoral trabecula in mice

2.3 草魚鱗CP對小鼠血清炎性細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α可刺激破骨細(xì)胞的生成和融合，增加骨髓庫中破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的比例及促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，使骨吸收增加，骨重建失去平衡，骨量下降。其中，TNF-α是引起OP發(fā)生的核心，是炎性細(xì)胞因子水平升高的始動(dòng)因素。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α單克隆抗體可有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)OP，敲除TNF-α編碼基因的去勢小鼠不再出現(xiàn)OP，而敲除IL-6、IL-1編碼基因的小鼠仍會(huì)發(fā)生OP。表2顯示，與C組相比，M組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高（＜0.05），表明卵巢切除引起了小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌增加，使骨吸收大于形成。與M組相比，PCa組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），而Ca組IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度顯著降低（＜0.05），TNF-α質(zhì)量濃度無顯著改變（＞0.05），可見鈣爾奇D對OP小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度沒有顯著影響，而補(bǔ)充CP能夠顯著降低TNF-α的質(zhì)量濃度。因此，CP可以通過降低TNF-α分泌，抑制破骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨形成，平衡骨轉(zhuǎn)換的能力，PCa組作用強(qiáng)于Ca組。

表2 小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α in mice

2.4 草魚鱗CP對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 OTU Venn圖分析

OTU Venn圖可以直觀反映樣本中物種的組成相似性及重疊情況。由圖3可知，4 組小鼠腸道菌群中共有的OTU為805個(gè)，M組特有2 285個(gè)，C組特有1 545個(gè)，PCa組特有3 089個(gè)，Ca組特有2 034個(gè)，OTU數(shù)量最多的為PCa組，最少的為C組?？梢?，各組小鼠腸道菌群物種組成差異性較大，卵巢切除導(dǎo)致了小鼠腸道菌落組成的變化，補(bǔ)充CP和鈣爾奇D可以激活某些腸道菌成為優(yōu)勢菌。

圖3 小鼠腸道菌群OTU水平的Venn圖Fig. 3 Venn diagram showing the unique and shared OTU in the intestinal flora among different groups of mice

2.4.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析中Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)代表菌群的豐富度。由圖4可知，M組Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)最低，PCa組Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)顯著高于M組（＜0.05），這表明卵巢切除小鼠腸道菌群豐富度降低，補(bǔ)充CP使OP小鼠腸道群落豐富度增加。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)能夠反映群落的多樣性，二者在本研究各組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），表明切除卵巢、補(bǔ)充CP和鈣爾奇D沒有使小鼠腸道菌群的多樣性發(fā)生變化。

圖4 小鼠腸道菌群Alpha多樣性的分析Fig. 4 Alpha diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性可以評估不同組間微生物群落間的差異，本研究通過主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析Beta多樣性。由圖5可知，各組樣品明顯分隔，M組主要分布于左上象限，其中1個(gè)樣品靠近Ca組樣品，可能由個(gè)體差異導(dǎo)致；C組分布于右下象限，Ca組分布于右上象限，PCa組分布于左下象限。

圖5 對小鼠腸道菌群Beta多樣性的分析Fig. 5 Beta diversity analysis of intestinal flora in mice

2.4.4 分類學(xué)組成分析

本研究從門和屬水平考察了CP對OP小鼠腸道菌群種類和豐度的影響，菌群門水平的組成如圖6A所示，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）在各組菌群總量中均超過90%，為腸道優(yōu)勢菌門，不同組中這兩種菌的相對豐度分別為M組34.72%、46.44%，Ca組64.39%、29.04%，PCa組55.09%、37.99%，C組55.46%、39.78%。腸道菌群失調(diào)時(shí)厚壁菌門和擬桿菌門豐度比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）升高，本研究中M組F/B值為1.34±0.04、C組為0.72±0.02、PCa組為0.69±0.01、Ca組為0.45±0.01，M組高于C組，PCa組和Ca組低于M組，可見卵巢切除導(dǎo)致了小鼠腸道菌群失調(diào)，補(bǔ)充CP和鈣爾奇D改變了OP小鼠腸道菌群的分類學(xué)門水平組成，改善了腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)。

腸道菌群多樣性屬水平的分布見圖6B，Ca、PCa組和C組3 組中相對豐度排名前兩位的菌群均為乳酸桿菌（）、普雷沃菌（），M組為乳酸桿菌、螺桿菌（）。與C組相比，M組小鼠腸道菌群中的乳酸桿菌相對豐度下降，擬桿菌（）和螺桿菌相對豐度升高；與M組比，PCa組乳酸桿菌和普雷沃菌相對豐度升高、擬桿菌相對豐度下降，Ca組普雷沃菌相對豐度升高，乳酸桿菌和擬桿菌相對豐度下降。乳酸桿菌是腸道的益生菌，可以促進(jìn)短鏈脂肪酸分泌，降低腸道pH值，提高腸腔內(nèi)鈣的溶解度，增強(qiáng)鈣細(xì)胞旁路的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制和消除條件致病菌；普雷沃菌可以調(diào)節(jié)雌激素缺乏導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)，減少腸壁中的炎性細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。螺桿菌是常見的致病菌，與很多疾病的發(fā)生相關(guān)?？梢姡殉睬谐笮∈竽c道菌群中條件致病菌數(shù)量增加，腸道微生態(tài)健康失衡，這與張廣文等研究結(jié)果相似，補(bǔ)充CP可促進(jìn)乳酸桿菌、普雷梭菌等益生菌的生長，抑制條件致病菌在腸道的定植與繁殖，改善小鼠腸道菌群紊亂。

圖6 小鼠腸道菌群在門、屬水平上的分布Fig. 6 Distribution of intestinal flora in mice at the phylum and genus levels

2.4.5 組間差異物種鑒定

利用線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）可以發(fā)現(xiàn)組間豐度有顯著差異的物種，本研究設(shè)定線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值為3.0。由圖7可見，本研究中組間差異物種的影響程度由大到小排序，M組為螺桿菌屬（）、胃瘤球菌屬（）、-變形菌綱（Deltaproteobacteria)、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）、布勞特氏菌（Blautia）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、科林斯菌（）、罕見小球菌屬（）、丹毒絲菌科梭菌屬（）；Ca組為另枝菌屬（）、嗜糖假單胞菌屬（)、AF12；PCa組為普雷沃菌屬（）；C組無LDA分?jǐn)?shù)大于3的菌種。螺桿菌屬、紫單胞菌科在代謝紊亂或炎性反應(yīng)時(shí)相對豐度增加；-變形菌綱的細(xì)胞膜中含有大量脂多糖，可激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；脫硫弧菌科影響腸道通透性；科林斯菌參與膠原的降解，可以降低緊密連接蛋白的表達(dá)并生成破壞膠原蛋白的產(chǎn)物，增加腸壁通透性，導(dǎo)致炎性疾病的發(fā)生和持續(xù)；丹毒菌科與IL-1β濃度增加呈正相關(guān)，在炎性反應(yīng)過程中豐度增加。布勞特氏菌和罕見小球菌屬可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低腸腔內(nèi)pH值，升高游離鈣離子濃度，本研究中其分布增加可能與缺乏鈣而引起的補(bǔ)償調(diào)節(jié)有關(guān)?？梢姡琈組小鼠腸道菌群組成成分發(fā)生明顯改變，多種致病菌群豐度升高，腸道菌群失調(diào)，腸道中能分解膠原蛋白的菌數(shù)量增多。另枝菌屬是一種兼性致病菌，包含減弱免疫反應(yīng)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的菌屬，該菌在豐度適宜時(shí)有益于健康，但若豐度過高，可損害腸道屏障，引起炎性病變；嗜糖假單胞菌屬和AF12的功效尚不明確；普雷沃菌屬可抑制腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂。由此可見，補(bǔ)充CP促進(jìn)了腸道益生菌的繁殖，抑制了條件致病菌的定植與繁殖，改善了腸道的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了腸道微生態(tài)環(huán)境恢復(fù)健康，而補(bǔ)充鈣爾奇D僅抑制了條件致病菌的生長，這與小鼠腸道菌群的分類學(xué)組成分析結(jié)果一致。

圖7 小鼠腸道菌群組間差異顯著性分析Fig. 7 Analysis of significant differences in intestinal flora among mouse groups

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究CP對OP小鼠股骨生物力學(xué)特性、骨微結(jié)構(gòu)、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，得到如下主要結(jié)論：1）CP可以提高OP小鼠股骨的抗彎曲能力和抗外壓能力，增加骨量和修復(fù)骨微結(jié)構(gòu)。2）CP可以減少OP小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，降低骨吸收，促進(jìn)骨形成。3）CP可以改變OP小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)益生菌的生長，抑制條件致病菌在腸道的定植與繁殖。因此，補(bǔ)充CP可以緩解卵巢切除誘導(dǎo)的OP，其作用機(jī)制可能與減少血清中炎性細(xì)胞因子的分泌、調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)。