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    草魚鱗膠原蛋白肽對骨質(zhì)疏松小鼠骨微結(jié)構(gòu)、血清TNF-α、IL-1β與IL-6和腸道菌群的影響

    2022-07-29 02:40:36王麗娟徐彩紅公麗艷
    食品科學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:微結(jié)構(gòu)小梁菌群

    楊 平,王麗娟,徐 昕,徐彩紅,公麗艷,黃 趁,許 青,*

    (1.沈陽師范大學(xué)學(xué)前與初等教育學(xué)院,遼寧 沈陽 110034;2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院,遼寧 沈陽 110034)

    骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)是一類以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特點(diǎn),嚴(yán)重威脅中老年人健康的骨代謝性疾病。我國老年居民OP患病率增長迅速,50 歲以上人群OP患病率達(dá)19.2%,65 歲以上人群患病率達(dá)32.0%。OP是一種整合協(xié)同信號通路和細(xì)胞因子的系統(tǒng)性疾病,炎性因子在OP發(fā)病中起重要作用。血清炎性細(xì)胞因子中的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6等可以促進(jìn)破骨細(xì)胞吸收骨、抑制成骨細(xì)胞形成骨,導(dǎo)致骨密度下降,特別是TNF-α作為前炎性因子之一,可以始動(dòng)調(diào)節(jié)很多炎性因子的釋放,觸發(fā)骨的吸收。此外,OP還與腸道菌群有關(guān),平衡的腸道菌群有利于維持骨代謝健康。研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群可以影響骨的積累和丟失,并可以與免疫系統(tǒng)共同影響卵巢切除C57BL/6小鼠的骨微結(jié)構(gòu)。因此,通過營養(yǎng)干預(yù)炎性細(xì)胞因子的分泌,調(diào)控腸道菌群,成為了目前防治OP癥的新策略。

    膠原蛋白肽(collagen peptide,CP)是膠原蛋白的酶解產(chǎn)物,可以促進(jìn)人體成骨細(xì)胞增殖,抑制破骨細(xì)胞活性,平衡骨轉(zhuǎn)換的能力,預(yù)防與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失,而且可以調(diào)節(jié)腸道菌群,改變小鼠腸道微生物多樣性和糞便菌群組成。但是,目前對CP調(diào)節(jié)腸道菌群與預(yù)防OP的機(jī)制仍不清楚。

    本研究通過切除小鼠卵巢建立OP模型,測定草魚鱗CP對小鼠股骨生物力學(xué)、骨微結(jié)構(gòu)、血清炎性細(xì)胞因子、腸道菌群相關(guān)指標(biāo)的影響,分析OP調(diào)節(jié)過程中CP與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度以及腸道菌群之間的關(guān)系,研究CP輔助治療OP的效果及其作用機(jī)制,期望為以CP作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑輔助治療OP提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、材料與試劑

    SPF級6 月齡雌性ICR小鼠40 只,體質(zhì)量(18±2)g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2020-0001,每籠5 只,喂食普通顆粒飼料,室溫(20±2)℃,相對濕度40%~65%,自然光照,保持良好通風(fēng),自由攝取水和食物。

    草魚鱗購自沈陽大潤發(fā)超市。

    復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g)、風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g)丹麥Novozymes公司;鈣爾奇D 惠氏制藥有限公司;IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒 南京建成生物工程研究所。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MN002型Micro CT掃描儀 德國布魯克公司;X-12R型高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司;Scientz-12N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;MultiskanFC型多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾公司。

    1.3 方法

    1.3.1 CP的制備

    根據(jù)本課題組的前期研究工作,以草魚鱗為原料,選用復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶同步雙酶解,在酶質(zhì)量比6∶4、魚鱗質(zhì)量濃度18.75 g/L、酶解溫度51.5 ℃、pH 7的條件下酶解3 h,經(jīng)中空纖維膜(3 kD)過濾,得到CP溶液,凍干后保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 動(dòng)物分組及造模

    將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組(C組)、模型組(M組)、鈣爾奇D組(Ca組)、草魚鱗膠原蛋白組(PCa組),每組10 只。除C組外的各組小鼠經(jīng)10 g/L戊巴比妥鈉麻醉后,取背側(cè)正中切口進(jìn)入腹腔,摘除雙側(cè)卵巢;C組術(shù)式同上,但不切除卵巢,僅切除卵巢大小的脂肪組織,術(shù)后恢復(fù)7 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。Ca組灌胃鈣爾奇D(260 mg/kg·d),PCa組灌胃CP(750 mg/kg·d)和鈣爾奇D(260 mg/kg·d),C組和M組灌胃1 mL的質(zhì)量濃度9 g/L氯化鈉溶液,每只小鼠灌胃1 次/d。連續(xù)喂養(yǎng)28 d后,無菌環(huán)境下取小鼠腸道糞便于滅菌EP管中,液氮凍存。糞便取樣完畢24 h后,取心臟內(nèi)血液和股骨備用。

    1.3.3 股骨生物力學(xué)特性測定

    采用三點(diǎn)彎曲法測定股骨生物力學(xué)特性。將離體的右側(cè)股骨置于10 mm跨距支架上,設(shè)置股骨中段為加載點(diǎn),以1 mm/min加載速率勻速垂直向下擠壓至股骨斷裂,記錄最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力。

    1.3.4 股骨微結(jié)構(gòu)分析

    采用Micro CT掃描分析股骨微結(jié)構(gòu)。質(zhì)量濃度40 g/L多聚甲醛溶液固定小鼠左側(cè)股骨24 h后,設(shè)定掃描條件為50 kV電壓、800 μA電流、15 μm分辨率,沿股骨長軸掃描,選取距離股骨遠(yuǎn)端生長板1.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)(region of interest,ROI),提取圖像信息,進(jìn)行三維重組,以中心直徑為4 mm的圓柱體作為感興趣區(qū),采用系統(tǒng)自帶的分析軟件對獲取圖像進(jìn)行定量分析,主要包括骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)中骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁空隙(trabecular separation,Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模式指數(shù)(structural model index,SMI)。

    1.3.5 血清炎性細(xì)胞因子檢測

    小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度檢測采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法,按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

    1.3.6 腸道菌群多樣性分析

    干冰運(yùn)輸小鼠糞便至上海派森諾生物醫(yī)藥科技有限公司,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增16S rRNA基因中的V3~V4區(qū)域,QIIME2平臺(tái)分析小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)微生物組數(shù)據(jù)。獲得每個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)代表序列的分類學(xué)信息,分析Alpha多樣性、Beta多樣性、分類學(xué)組成,鑒定組間差異物種。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,<0.05為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 草魚鱗CP對小鼠股骨生物力學(xué)特性的影響

    由圖1可知,M組的最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為(159.3±12.1)MPa和(18.41±1.96)N,C組最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為(201.2±18.7)MPa和(27.75±2.02)N,M組極顯著低于C組(<0.01),表明卵巢切除使小鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)下降,抗彎曲能力和抗外壓能力減弱;與M組比,PCa組最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力分別為(178.2±13.3)MPa和(22.18±1.01)N,顯著升高(<0.05),Ca組分別為(168.14±11.80)MPa和(19.13±2.01)N,升高不顯著(>0.05)??梢?,補(bǔ)充CP可以提高OP小鼠股骨的抗彎曲能力和抗外壓能力,增強(qiáng)股骨生物力學(xué)特性。

    圖1 小鼠股骨最大彎曲荷載和最大彎曲應(yīng)力值Fig. 1 Maximum bending load and maximum bending stress of mouse femur

    2.2 草魚鱗CP對小鼠股骨微結(jié)構(gòu)的影響

    骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)中BV/TV代表骨小梁的骨量,Tb.Th代表骨小梁平均厚度,Tb.N代表骨組織與非骨組織交點(diǎn)數(shù)量的平均值,Tb.Sp代表骨小梁之間的髓腔平均寬度,SMI代表描述小梁中板層結(jié)構(gòu)和桿狀結(jié)構(gòu)比例,發(fā)生OP后Tb.N和Tb.Th均減少,Tb.Sp和SMI均增加。由表1可見,與C組比,M組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th指標(biāo)顯著下降(<0.05),Tb.Sp、SMI顯著提高(<0.05),表明切除卵巢使小鼠骨小梁數(shù)量減少、厚度降低,骨板層結(jié)構(gòu)減少,骨分解大于合成。與M組比較,PCa組中BV/TV、Tb.Th、Tb.N顯著升高(<0.05),Tb.Sp、SMI顯著下降(<0.05),Ca組中BV/TV、Tb.Th顯著升高(<0.05),Tb.Sp顯著下降(<0.05),Tb.N、SMI沒有顯著變化(>0.05),這表明補(bǔ)充CP和鈣爾奇D后股骨骨小梁數(shù)量增多、厚度增加,板層結(jié)構(gòu)增多,骨合成大于分解,且PCa組作用效果優(yōu)于Ca組。

    表1 小鼠股骨的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Microstructure parameters of femoral trabecula in mice

    由圖2可見,股骨Micro CT的ROI區(qū)三維重建圖像中M組和Ca組微觀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)相似,骨小梁數(shù)量較少,間距增大,連接性差,骨微結(jié)構(gòu)被破壞。PCa組骨小梁數(shù)量較多、較厚間距較小,連接性及完整性較好,未見斷裂現(xiàn)象,與C組圖像相似,表明補(bǔ)充CP后小鼠骨量增加,骨微結(jié)構(gòu)得到修復(fù)。

    圖2 小鼠股骨小梁的三維結(jié)構(gòu)重建Fig. 2 Three-dimensional reconstructed structure of femoral trabecula in mice

    2.3 草魚鱗CP對小鼠血清炎性細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響

    炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α可刺激破骨細(xì)胞的生成和融合,增加骨髓庫中破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的比例及促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化,使骨吸收增加,骨重建失去平衡,骨量下降。其中,TNF-α是引起OP發(fā)生的核心,是炎性細(xì)胞因子水平升高的始動(dòng)因素。研究發(fā)現(xiàn),TNF-α單克隆抗體可有效預(yù)防或逆轉(zhuǎn)OP,敲除TNF-α編碼基因的去勢小鼠不再出現(xiàn)OP,而敲除IL-6、IL-1編碼基因的小鼠仍會(huì)發(fā)生OP。表2顯示,與C組相比,M組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度顯著升高(<0.05),表明卵巢切除引起了小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌增加,使骨吸收大于形成。與M組相比,PCa組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度顯著降低(<0.05),而Ca組IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度顯著降低(<0.05),TNF-α質(zhì)量濃度無顯著改變(>0.05),可見鈣爾奇D對OP小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度沒有顯著影響,而補(bǔ)充CP能夠顯著降低TNF-α的質(zhì)量濃度。因此,CP可以通過降低TNF-α分泌,抑制破骨細(xì)胞生成,促進(jìn)骨形成,平衡骨轉(zhuǎn)換的能力,PCa組作用強(qiáng)于Ca組。

    表2 小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of serum IL-1β, IL-6 and TNF-α in mice

    2.4 草魚鱗CP對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

    2.4.1 OTU Venn圖分析

    OTU Venn圖可以直觀反映樣本中物種的組成相似性及重疊情況。由圖3可知,4 組小鼠腸道菌群中共有的OTU為805個(gè),M組特有2 285個(gè),C組特有1 545個(gè),PCa組特有3 089個(gè),Ca組特有2 034個(gè),OTU數(shù)量最多的為PCa組,最少的為C組??梢?,各組小鼠腸道菌群物種組成差異性較大,卵巢切除導(dǎo)致了小鼠腸道菌落組成的變化,補(bǔ)充CP和鈣爾奇D可以激活某些腸道菌成為優(yōu)勢菌。

    圖3 小鼠腸道菌群OTU水平的Venn圖Fig. 3 Venn diagram showing the unique and shared OTU in the intestinal flora among different groups of mice

    2.4.2 Alpha多樣性分析

    Alpha多樣性分析中Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)代表菌群的豐富度。由圖4可知,M組Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)最低,PCa組Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)顯著高于M組(<0.05),這表明卵巢切除小鼠腸道菌群豐富度降低,補(bǔ)充CP使OP小鼠腸道群落豐富度增加。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)能夠反映群落的多樣性,二者在本研究各組間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05),表明切除卵巢、補(bǔ)充CP和鈣爾奇D沒有使小鼠腸道菌群的多樣性發(fā)生變化。

    圖4 小鼠腸道菌群Alpha多樣性的分析Fig. 4 Alpha diversity analysis of intestinal flora in mice

    2.4.3 Beta多樣性分析

    Beta多樣性可以評估不同組間微生物群落間的差異,本研究通過主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis,PCoA)分析Beta多樣性。由圖5可知,各組樣品明顯分隔,M組主要分布于左上象限,其中1個(gè)樣品靠近Ca組樣品,可能由個(gè)體差異導(dǎo)致;C組分布于右下象限,Ca組分布于右上象限,PCa組分布于左下象限。

    圖5 對小鼠腸道菌群Beta多樣性的分析Fig. 5 Beta diversity analysis of intestinal flora in mice

    2.4.4 分類學(xué)組成分析

    本研究從門和屬水平考察了CP對OP小鼠腸道菌群種類和豐度的影響,菌群門水平的組成如圖6A所示,擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在各組菌群總量中均超過90%,為腸道優(yōu)勢菌門,不同組中這兩種菌的相對豐度分別為M組34.72%、46.44%,Ca組64.39%、29.04%,PCa組55.09%、37.99%,C組55.46%、39.78%。腸道菌群失調(diào)時(shí)厚壁菌門和擬桿菌門豐度比值(Firmicutes/Bacteroidetes,F(xiàn)/B)升高,本研究中M組F/B值為1.34±0.04、C組為0.72±0.02、PCa組為0.69±0.01、Ca組為0.45±0.01,M組高于C組,PCa組和Ca組低于M組,可見卵巢切除導(dǎo)致了小鼠腸道菌群失調(diào),補(bǔ)充CP和鈣爾奇D改變了OP小鼠腸道菌群的分類學(xué)門水平組成,改善了腸道菌群的組成結(jié)構(gòu)。

    腸道菌群多樣性屬水平的分布見圖6B,Ca、PCa組和C組3 組中相對豐度排名前兩位的菌群均為乳酸桿菌()、普雷沃菌(),M組為乳酸桿菌、螺桿菌()。與C組相比,M組小鼠腸道菌群中的乳酸桿菌相對豐度下降,擬桿菌()和螺桿菌相對豐度升高;與M組比,PCa組乳酸桿菌和普雷沃菌相對豐度升高、擬桿菌相對豐度下降,Ca組普雷沃菌相對豐度升高,乳酸桿菌和擬桿菌相對豐度下降。乳酸桿菌是腸道的益生菌,可以促進(jìn)短鏈脂肪酸分泌,降低腸道pH值,提高腸腔內(nèi)鈣的溶解度,增強(qiáng)鈣細(xì)胞旁路的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),抑制和消除條件致病菌;普雷沃菌可以調(diào)節(jié)雌激素缺乏導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào),減少腸壁中的炎性細(xì)胞因子分泌,促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。螺桿菌是常見的致病菌,與很多疾病的發(fā)生相關(guān)??梢姡殉睬谐笮∈竽c道菌群中條件致病菌數(shù)量增加,腸道微生態(tài)健康失衡,這與張廣文等研究結(jié)果相似,補(bǔ)充CP可促進(jìn)乳酸桿菌、普雷梭菌等益生菌的生長,抑制條件致病菌在腸道的定植與繁殖,改善小鼠腸道菌群紊亂。

    圖6 小鼠腸道菌群在門、屬水平上的分布Fig. 6 Distribution of intestinal flora in mice at the phylum and genus levels

    2.4.5 組間差異物種鑒定

    利用線性判別分析效應(yīng)量(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)可以發(fā)現(xiàn)組間豐度有顯著差異的物種,本研究設(shè)定線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)值為3.0。由圖7可見,本研究中組間差異物種的影響程度由大到小排序,M組為螺桿菌屬()、胃瘤球菌屬()、-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)、布勞特氏菌(Blautia)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)、科林斯菌()、罕見小球菌屬()、丹毒絲菌科梭菌屬();Ca組為另枝菌屬()、嗜糖假單胞菌屬()、AF12;PCa組為普雷沃菌屬();C組無LDA分?jǐn)?shù)大于3的菌種。螺桿菌屬、紫單胞菌科在代謝紊亂或炎性反應(yīng)時(shí)相對豐度增加;-變形菌綱的細(xì)胞膜中含有大量脂多糖,可激活免疫系統(tǒng),導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生;脫硫弧菌科影響腸道通透性;科林斯菌參與膠原的降解,可以降低緊密連接蛋白的表達(dá)并生成破壞膠原蛋白的產(chǎn)物,增加腸壁通透性,導(dǎo)致炎性疾病的發(fā)生和持續(xù);丹毒菌科與IL-1β濃度增加呈正相關(guān),在炎性反應(yīng)過程中豐度增加。布勞特氏菌和罕見小球菌屬可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸,降低腸腔內(nèi)pH值,升高游離鈣離子濃度,本研究中其分布增加可能與缺乏鈣而引起的補(bǔ)償調(diào)節(jié)有關(guān)??梢姡琈組小鼠腸道菌群組成成分發(fā)生明顯改變,多種致病菌群豐度升高,腸道菌群失調(diào),腸道中能分解膠原蛋白的菌數(shù)量增多。另枝菌屬是一種兼性致病菌,包含減弱免疫反應(yīng)和增強(qiáng)免疫反應(yīng)的菌屬,該菌在豐度適宜時(shí)有益于健康,但若豐度過高,可損害腸道屏障,引起炎性病變;嗜糖假單胞菌屬和AF12的功效尚不明確;普雷沃菌屬可抑制腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂。由此可見,補(bǔ)充CP促進(jìn)了腸道益生菌的繁殖,抑制了條件致病菌的定植與繁殖,改善了腸道的菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)了腸道微生態(tài)環(huán)境恢復(fù)健康,而補(bǔ)充鈣爾奇D僅抑制了條件致病菌的生長,這與小鼠腸道菌群的分類學(xué)組成分析結(jié)果一致。

    圖7 小鼠腸道菌群組間差異顯著性分析Fig. 7 Analysis of significant differences in intestinal flora among mouse groups

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)研究CP對OP小鼠股骨生物力學(xué)特性、骨微結(jié)構(gòu)、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響,得到如下主要結(jié)論:1)CP可以提高OP小鼠股骨的抗彎曲能力和抗外壓能力,增加骨量和修復(fù)骨微結(jié)構(gòu)。2)CP可以減少OP小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌,降低骨吸收,促進(jìn)骨形成。3)CP可以改變OP小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu),促進(jìn)益生菌的生長,抑制條件致病菌在腸道的定植與繁殖。因此,補(bǔ)充CP可以緩解卵巢切除誘導(dǎo)的OP,其作用機(jī)制可能與減少血清中炎性細(xì)胞因子的分泌、調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)。

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