促成骨細(xì)胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選及活性分析

陳永凱，郭玉杰,2，張鴻儒，劉 泓，張春暉,*，姜 珊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.新疆泰昆集團(tuán)有限責(zé)任公司，新疆 昌吉 831100；3.內(nèi)蒙古阿榮旗牧原康肽實(shí)業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162750）

酶解法制備的骨膠原蛋白肽為混合肽，通常具有抗高血壓、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化和促進(jìn)傷口愈合等多種潛在的生理功能。影響肽生物活性的主要因素包括一級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸的排列和組成）和肽鏈長(zhǎng)度等，例如牦牛骨膠原蛋白肽GPAGPPGPIGPV（GP-12）能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而GPAGPAGPR（GP-9）和GEKGETGLR（GE-9）對(duì)成骨細(xì)胞增殖起抑制作用。在骨膠原蛋白分子的三股螺旋（2 條α肽、1 條α鏈）結(jié)構(gòu)中，甘氨酸（Gly）是其特征氨基酸，與其他兩個(gè)氨基酸殘基（多為Pro和Hyp）共同構(gòu)成（Gly-X-Y）的特征序列結(jié)構(gòu)，可能是解析其生物活性的潛在“策略區(qū)”。因此，有必要進(jìn)一步挖掘骨膠原蛋白肽的結(jié)構(gòu)信息與促成骨細(xì)胞增殖活性之間的關(guān)系，為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的定向制備提供參考。

活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究方法涉及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)和虛擬篩選三大領(lǐng)域。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要依靠建立動(dòng)物模型，但成本高、周期長(zhǎng)，常用作活性研究的最后一步。Yamada等前期研究發(fā)現(xiàn)牛乳酪蛋白肽MKP具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性，進(jìn)一步通過建立自發(fā)性高血壓大鼠模型發(fā)現(xiàn)，三肽MKP能經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血漿，顯著降低高血壓大鼠的收縮壓。體外實(shí)驗(yàn)主要包括化學(xué)實(shí)驗(yàn)、酶相關(guān)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等，可直接驗(yàn)證肽的生物活性，但不適合初期大規(guī)模篩選，多與其他分離純化技術(shù)聯(lián)用。顏阿娜等采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)合高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法成功鑒定出了黑鯊魚皮抗氧化肽PGGTM。計(jì)算機(jī)輔助虛擬篩選技術(shù)可有效彌補(bǔ)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)的不足，提高篩選效率，常見的虛擬篩選方法包括定量-構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）建模、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和分子對(duì)接等。在篩選促成骨細(xì)胞增殖活性肽的相關(guān)研究中，可將肽與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）進(jìn)行半柔性對(duì)接，以對(duì)接能（CDOCKER energy，CE）評(píng)價(jià)其潛在的促增殖活性，此法在促成骨細(xì)胞增殖牛骨膠原蛋白肽和乳鐵蛋白肽的篩選中均取得了良好的效果。

牦牛是我國(guó)珍貴的畜牧資源，牦牛屠宰產(chǎn)生的骨副產(chǎn)物質(zhì)量約占胴體質(zhì)量的20%～30%，但綜合利用卻嚴(yán)重不足，現(xiàn)已證實(shí)牦牛骨膠原蛋白肽具有良好的成骨活性，能顯著改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型癥狀。本研究采用酶法制備牦牛骨膠原蛋白肽，通過CDOCKER分子對(duì)接技術(shù)靶向篩選作用于EGFR的促成骨細(xì)胞增殖活性肽段，基于體外細(xì)胞增殖培養(yǎng)驗(yàn)證其活性并闡釋與EGFR的結(jié)合機(jī)制，以期為促成骨細(xì)胞增殖活性肽的靶向篩選和工業(yè)化制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛腿骨由西藏農(nóng)牧學(xué)院提供；牦牛骨膠原蛋白肽由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成，經(jīng)鑒定純度均大于98%；小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

乙腈（質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Fisher Chemical公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)）、三氟乙酸（色譜級(jí)） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK-8溶液 北京索萊寶科技有限公司；復(fù)合蛋白酶 丹麥Novozymes公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中試生產(chǎn)裝備（包括破骨機(jī)、工業(yè)純水機(jī)、蒸煮罐、靜置罐管式冷卻器、管式分離機(jī)、碟式分離機(jī)、脫色罐、單效蒸發(fā)器、噴霧干燥機(jī)） 上海本優(yōu)機(jī)械有限公司；1260-II型HPLC儀 美國(guó)Agilent公司；Ultimate 3000型毛細(xì)管HPLC儀、電噴霧-組合型離子阱質(zhì)譜儀、Multiskan FC型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M200型恒溫培養(yǎng)箱 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛骨膠原蛋白肽制備流程

牦牛骨破碎→沖洗血污→熱壓提?。?35 ℃、3 h）→靜置分層（1.5 h）→酶解脫色（1.5 AU/g復(fù)合蛋白酶，56 ℃、4.5 h）→噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度190 ℃、出風(fēng)溫度80 ℃）

1.3.2 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布測(cè)定

參考Ye Mengliang等的方法并稍作修改，采用HPLC法測(cè)定牦牛骨混合肽分子質(zhì)量分布，配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品甘氨酰肌氨酸（146 Da）、甘氨酰甘氨酰酪氨酰-精氨酸（451 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6 511 Da）、細(xì)胞色素c（12 327 Da）以及牦牛骨混合肽溶液，經(jīng)0.22 μm膜過濾，待用。色譜條件：TSK gel G2000 SWXL柱（7.8 mm×300 mm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣3 次，流速1.0 mL/min，流動(dòng)相為含45%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙腈和0.1%三氟乙酸的超純水溶液，采用等梯度洗脫，洗脫時(shí)間為20 min，于214 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對(duì)數(shù)（lg）為縱坐標(biāo)，保留時(shí)間（）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用手動(dòng)積分的方式測(cè)定不同分子質(zhì)量活性肽的占比。

1.3.3 牦牛骨膠原蛋白肽序列測(cè)定

采用納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nano liquid chromatogram-tandem mass spectrometry，nano LC-MS/MS）測(cè)定牦牛骨膠原蛋白肽序列。

1.3.3.1 液相分離條件

預(yù)柱：Acclaim PepMap RPLC C柱（5 mm×300 μm，5 μm）；分析柱：Acclaim PepMap RPLC C柱（150 mm×150 μm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸+2%乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸+80%乙腈；流速：600 nL/min；梯度洗脫條件：0～5 min，6%～9% B；5～20 min，9%～14% B；20～50 min，14%～30% B；50～58 min，30%～40% B；58～60 min，40%～95% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜分析條件

采用正離子掃描模式；設(shè)定毛細(xì)管溫度320 ℃、毛細(xì)管噴射電壓2 300 V。一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：70 000；AGCtarget：3×10；MaximumIT：40 ms；掃描范圍：350～1 800/。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：分辨率：75 000；AGCtarget：1×10；MaximumIT：60 ms；Top N：20；NCE/stepped NCE：27。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

使用Maxquant 1.6.2.10平臺(tái)分別檢索目標(biāo)多肽。

1.3.4 EGFR和多肽前處理

從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）下載EGFR-表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）（PDB編號(hào)：1IVO）復(fù)合物結(jié)構(gòu)，采用Discovery Studio 2019軟件刪去原配體EGF和水分子，添加氫原子，補(bǔ)充非完整的氨基酸殘基并模擬缺失的loop區(qū)域；分別繪制牦牛骨肽的一級(jí)序列，添加CHARMm力場(chǎng)，采用Smart Minimizer算法對(duì)其進(jìn)行能量最小化處理，最大步數(shù)設(shè)定為2 000 步，RMS梯度值設(shè)為0.01。

1.3.5 活性口袋確定

以EGF和EGFR的結(jié)合位點(diǎn)為對(duì)接位點(diǎn)，設(shè)定活性口袋半徑為22，將原配體結(jié)合區(qū)域完全包裹。

1.3.6 分子對(duì)接

定義經(jīng)過前處理的多肽為配體，EGFR為受體，使用Discovery Studio 2019軟件的CDOCKER半柔性對(duì)接方式進(jìn)行分子對(duì)接，僅保留一個(gè)CE最低的構(gòu)象。以具有促成骨細(xì)胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GDRGETGPAGPAGPIGPV（GD-18）和GPSGPAGKDGRIGQPG（GP-16）為陽(yáng)性對(duì)照，選取CE較陽(yáng)性肽CE差值大于20 kcal/mol的多肽用于后續(xù)研究。

1.3.7 多肽合成

參考Xu Zhe等的方法，采用固相合成技術(shù)合成牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22，HPLC-MS檢驗(yàn)純度，均大于98%。

1.3.8 多肽促成骨細(xì)胞增殖活性驗(yàn)證

參考 Zhu Lingyu等的方法并稍作修改，將小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞以2×10個(gè)/mL、每孔100 μL接種于96 孔板中，恒溫培養(yǎng)24 h后移去原培養(yǎng)基，隨后配制系列質(zhì)量濃度梯度的多肽溶液，以每孔200 μL加入96 孔板中，在溫度為37 ℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，空白組加入等體積培養(yǎng)基，采用CCK-8法測(cè)定增殖率，每組實(shí)驗(yàn)做4 次平行。按下式計(jì)算前成骨細(xì)胞的相對(duì)增殖率。

式中：為樣品溶液的吸光度；為空白組溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Duncan方差分析，設(shè)定顯著性水平＜0.05或＜0.01，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；繪圖軟件為Origin 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布

標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lg與保留時(shí)間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（＝0.979 4），說明測(cè)定結(jié)果具有較高的可信性。根據(jù)GB 31645—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 膠原蛋白肽》的定義，膠原蛋白肽是指以富含膠原蛋白的新鮮動(dòng)物組織（包括皮、骨、筋、腱、鱗等）為原料，經(jīng)過提取、水解、精制生產(chǎn)的，分子質(zhì)量低于10 000 Da（質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于90%）的產(chǎn)品。如圖1所示，分子質(zhì)量小于3 000 Da的肽段占91.8%，其中小于1 000 Da的占69.2%，說明該批肽粉符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

研究發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量的牛骨膠原蛋白肽（＜3 000 Da）、牦牛骨膠原蛋白肽（＜3 000 Da）以及豬骨膠原蛋白肽（＜1 000 Da）均能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，發(fā)揮成骨活性。因此，本實(shí)驗(yàn)制備的牦牛骨膠原蛋白肽可能具有開發(fā)成為抗骨質(zhì)疏松功能食品的潛在價(jià)值，故進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 牦牛骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布Fig. 1 Molecular mass distribution of yak bone collagen peptides

2.2 牦牛骨膠原蛋白肽序列分析

膠原蛋白呈現(xiàn)典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性且易于加工利用。自然界中共存在28種膠原蛋白，其中I型膠原蛋白含量最高，廣泛分布于動(dòng)物的皮膚、骨骼和肌腱等部位。如表1所示，本實(shí)驗(yàn)中從牦牛骨膠原蛋白肽中共鑒定得到78 條肽段，其中I型膠原蛋白肽占比為82.0%，來源于α鏈和α鏈的肽分別占I型膠原蛋白肽總量的45.3%和54.7%，并且其序列均與膠原蛋白的（Gly-X-Y）特征序列相吻合，表明鑒定結(jié)果具有較高的可靠性。

表1 牦牛骨膠原蛋白肽序列及分子對(duì)接結(jié)果Table 1 Yak bone peptide sequences and their -CDOCKER energy(-CE) values

續(xù)表1

值得注意的是，分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果表明混合肽中有大約45.1%的肽分子質(zhì)量小于500 Da，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則，分子質(zhì)量小于500 Da的化合物往往具有較高的生物利用度和較好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，更易開發(fā)成為口服藥物，但本實(shí)驗(yàn)鑒定的分子質(zhì)量小于500 Da的肽只有一條——FSGL（422.224 Da）。導(dǎo)致質(zhì)譜對(duì)小肽鑒定能力差的原因可能是太小的片段在分離中不容易獲取，或者組分間性質(zhì)差異小，無法區(qū)分。

2.3 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

EGFR是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族的成員，在無配體時(shí)，EGFR胞外域的第II亞結(jié)構(gòu)域和第IV亞結(jié)構(gòu)域會(huì)形成分子內(nèi)“鉸鏈”，形成自抑制狀態(tài)；當(dāng)配體與胞外域結(jié)合后，EGFR構(gòu)象改變并發(fā)生二聚化，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖或分化。研究表明，以EGFR為受體，通過CDOCKER對(duì)接獲得的乳鐵蛋白肽ENLPEKADRDQYE、牛骨膠原蛋白肽HHGDQGAPGAVGPAGPRGPAGPSGPAGKDGR和GPAGANGDRGEAGPAGPAGPAGPR具有顯著的促成骨細(xì)胞增殖活性。在小分子配體與大分子受體對(duì)接研究中，可用-CE表示受體和配體親和力的大小，-CE越大，受體與配體結(jié)合越穩(wěn)定。如表1所示，將鑒定的多肽與EGFR對(duì)接后，-CE的變化范圍從21.493 kcal/mol到170.507 kcal/mol，其中陽(yáng)性肽GD-18和GP-16的-CE分別為134.759 kcal/mol和132.988 kcal/mol。-CE比陽(yáng)性肽高20 kcal/mol以上的多肽共有5 條，分別為GP-18（162.390 kcal/mol）、TP-14（167.276 kcal/mol）、GK-21（170.507 kcal/mol）、GK-22（162.093 kcal/mol）和GP-17（156.133 kcal/mol），除TP-14來源于-乳球蛋白以外，其余均來自于I型膠原蛋白的α鏈。

2.4 促成骨細(xì)胞增殖活性分析

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)增殖率，CCK-8法較其他常見的檢測(cè)方法具有結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)。如圖2所示，將細(xì)胞在多肽質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/L和3.0 mg/mL條件下分別培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度不低于1.0 mg/mL時(shí)，所有多肽均無顯著的促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖活性，GP-17、GP-18和TP-14甚至能抑制細(xì)胞增殖；當(dāng)質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，GK-22能顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖（相對(duì)增殖率為106%），并且表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，說明GK-22序列可能是促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的特征性序列，具有潛在的研究?jī)r(jià)值。值得注意的是，GK-21的序列僅與GK-22相差一個(gè)末端Gly殘基，卻無顯著的促增殖活性，因此末端Gly殘基對(duì)GK-22的促成骨細(xì)胞增殖具有重要意義。

圖2 MC3T3-E1細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果Fig. 2 Determination of MC3T3-E1 cell proliferation

2.5 不同多肽與EGFR的結(jié)合機(jī)制

配體與EGFR親和力的差異會(huì)導(dǎo)致EGFR產(chǎn)生不同的二聚化構(gòu)象，繼而引發(fā)細(xì)胞增殖或分化。上皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EREG）等弱親和力配體會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分化而抑制增殖；EGF等強(qiáng)親和力配體作用效果相反，某些拮抗劑可以與EGFR胞外域結(jié)合，進(jìn)而掩蓋配體的結(jié)合位點(diǎn)，致使EGFR內(nèi)部酪氨酸激酶激活過程受阻，細(xì)胞增殖受到抑制。如圖3和表2所示，GK-22與EGFR的非鍵相互作用主要為氫鍵和疏水相互作用，可與EGFR的Lys13、Leu14和Thr15形成5個(gè)氫鍵（包括常規(guī)氫鍵和碳?xì)滏I，與Lys13和Thr15各形成2個(gè)氫鍵），與Leu17和His409分別形成烷基相互作用和π-烷基相互作用。同時(shí)，陽(yáng)性肽GP-16也與EGFR的Lys13和Thr15形成氫鍵；GD-18與Thr15形成氫鍵，與Leu17和His409形成烷基相互作用，提示GK-22可能與兩者存在相似的促成骨細(xì)胞增殖機(jī)制。而分子對(duì)接結(jié)果表明GK-21與EGFR的親和力高于GK-22，并且可與Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Tyr45和Gln384形成氫鍵，與Leu17、Leu325、His346和His409形成疏水相互作用，除Lys13外，涵蓋了GK-22與EGFR的所有結(jié)合位點(diǎn)，卻未與GK-22一樣表現(xiàn)出促增殖活性，原因有待進(jìn)一步研究。GP-17、GP-18和TP-14與EGFR的非鍵相互作用除氫鍵和疏水相互作用外，還包括靜電相互作用。GP-17與EGFR形成8個(gè)氫鍵、1個(gè)電荷相互作用、1個(gè)烷基相互作用；其中EGFR的Asp355殘基與之形成4個(gè)氫鍵（含2個(gè)碳?xì)滏I、1個(gè)常規(guī)氫鍵、1個(gè)鹽橋）、1個(gè)電荷相互作用，是兩者結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基。GP-18與EGFR形成9個(gè)氫鍵、1個(gè)π-烷基相互作用、1個(gè)電荷相互作用；TP-14與EGFR形成10個(gè)氫鍵，1個(gè)π-陽(yáng)離子相互作用、1個(gè)烷基相互作用。因此，GK-22可能是EGFR的強(qiáng)親和力配體，而對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖發(fā)揮抑制作用的GP-17、GP-18和TP-14可能是EGFR的弱親和力配體，或者其作為EGFR的拮抗劑，使正常配體的結(jié)合過程受阻。綜上，不同多肽對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同效應(yīng)的原因可能是與EGFR的結(jié)合機(jī)制存在差異。

圖3 不同多肽與EGFR的非鍵相互作用Fig. 3 Non-bond interactions between different polypeptides and EGFR

表2 多肽與EGFR的結(jié)合位點(diǎn)Table 2 Interaction sites between polypeptides and EGFR

續(xù)表2

3 結(jié) 論

骨膠原蛋白經(jīng)復(fù)合酶酶解可獲得低分子質(zhì)量（＜3 000 Da）的混合肽，但發(fā)揮促成骨細(xì)胞增殖活性的肽序列尚不明確。本研究采用nano LC-MS/MS技術(shù)測(cè)定混合肽序列，以牦牛骨膠原蛋白肽GD-18和GP-16為陽(yáng)性對(duì)照，通過CDOCKER半柔性對(duì)接技術(shù)篩選獲得具有潛在促成骨細(xì)胞增殖活性的牦牛骨膠原蛋白肽GP-18、TP-14、GP-17、GK-21和GK-22，體外細(xì)胞增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，GK-22可通過與EGFR結(jié)合，發(fā)揮促成骨細(xì)胞增殖活性。綜上，基于以EGFR為受體的CDOCKER半柔性對(duì)接技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)促成骨細(xì)胞增殖活性骨膠原蛋白肽的靶向篩選。