微生物檢定法測定四環(huán)素片含量的不確定度分析

高娟，高霞，亢玉紅

(1.陜西省榆林市藥品檢驗所，陜西 榆林 719000；2.榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000)

0 引言

四環(huán)素是一種廣譜抑菌劑，濃度高時具有殺菌作用，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用。目前其測定含量常用的方法為抗生素微生物檢定法中的管碟法(《中國藥典》2015年版四部通則1201)。參考相關(guān)文獻[1-12]，文章對四環(huán)素片含量測定結(jié)果進行不確定度分析，確定影響不確定度的各個影響因素，并對不同的不確定度分量進行評估，給出測量結(jié)果的置信水平和置信區(qū)間，建立四環(huán)素片含量測定不確定度的方法，確定測量結(jié)果的可信程度，以便于在檢驗過程中，嚴格遵守操作規(guī)程，盡量減少實驗中的人為誤差，從而確保實驗結(jié)果更加準確可靠。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司)；CPA225D電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；四環(huán)素標準品(中國食品藥品檢定研 究 院，效 價969U/mg，批 號：130306-201419)；四環(huán)素片樣品(桂林南藥股份有限公司，批號：TC200304)；抗生素檢定Ⅱ號培養(yǎng)基(pH為6.5-6.6，北京三藥科技開發(fā)公司，批號：180423)；藤黃微球菌(CMCC(B)28001，中國食品藥品檢定研究院)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸均為分析純，天津科密歐有限公司；實驗用水為純化水；實驗中所用刻度吸管、不銹鋼小管、平底雙碟均應(yīng)經(jīng)過滅菌。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液的制備

精密稱取四環(huán)素標準品0.01070g，置于100mL的容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸2mL，振搖，使四環(huán)素溶解后，再加滅菌用水稀釋至刻度。精密吸取溶液2份，各10mL置25mL與100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至刻度，溶液濃度分別為40u/mL與10u/mL，作為標準品溶液的高、低濃度。

1.2.2 供試品溶液的制備

取四環(huán)素片4片，全部研細，置于1000mL的容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸200mL，振搖，使四環(huán)素溶解后，再加滅菌用水稀釋至每1mL中約含1000單位的懸浮液。分別精密吸取溶液1mL置25mL與100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH6.0)稀釋至刻度，溶液濃度分別為40u/mL與10u/mL，作為供試品溶液的高、低濃度。

1.2.3 雙碟的制備和培養(yǎng)

取平底雙碟6套，分別加入加熱融化的培養(yǎng)基20mL，在碟底部攤布均勻，放在水平臺面上使之凝固，作為底層。另取加熱融化后的培養(yǎng)基50mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中恒溫，加入藤黃微球菌菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5mL帶菌培養(yǎng)基，攤布均勻，作為菌層。凝固后，用鋼管放置器放置4個不銹鋼小管。將稀釋好的標準品溶液和供試品溶液分別用移液槍定量滴加溶液于不銹鋼小管內(nèi)，在36℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。

1.2.4 抑菌圈直徑的測定和效價計算

取出培養(yǎng)16h后的6套雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個抑菌圈的直徑，照生物檢定統(tǒng)計法[13]進行可靠性測驗及效價計算。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)學(xué)模型

采用二劑量法，通過數(shù)學(xué)模型對四環(huán)素片的含量測定進行分析，效價計算公式[14]如下所示：

其中，P為供試品效價，AT為供試品的估計效價，Ws、Wx分別為標準品與供試品的質(zhì)量，Ps為標準品的效價值，Vs、Vx分別為標準品與供試品的稀釋倍數(shù)，I為高低濃度之比的對數(shù)值(劑量比為4：1時，I=0.602)，S1、S2、T1、T2分別為標準品低濃度、標準品高濃度、供試品低濃度、供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑的總和。

2.2 測量結(jié)果

用抑菌圈測量儀分別對6個雙碟進行掃描測量，結(jié)果見表1，ds1、ds2、dt1、dt2分別為標準品溶液低濃度、標準品溶液高濃度、供試品溶液低濃度、供試品溶液高濃度所致的抑菌圈直徑；ym為一個雙碟中抑菌圈直徑的總和。

表1 抑菌圈測量儀測量的直徑值(mm)

抑菌圈測量儀測定結(jié)果表明，回歸非常顯著(P＜0.01)，偏離平行不顯著(P＞0.05)，平均可信限率Pt的FL%為4.1%，符合要求(應(yīng)＜5%)，抑菌圈清晰可見，且標準品的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm之間，含量測定結(jié)果為944.1U·mg-1，以上結(jié)果均符合標準規(guī)定要求。

2.3 不確定度來源的分析

標準品純度引入的不確定度；標準品稱量過程中引入的不確定度；標準品溶解過程引入的不確定度；標準品稀釋過程中引入的不確定度；供試品溶解過程引入的不確定度；供試品稀釋過程引入的不確定度；抑菌圈測量儀測量過程中引入的不確定度；溫度引入的不確定度。

2.4 不確定度分量的計算

2.4.1 標準品溶液配制引入的不確定度

(1)標準品純度引入的不確定度：四環(huán)素標準品含量的標準不確定度一般認為是±1%，概率分布為均勻分布，包含因子，則相對不確定度

(2)稱量過程引入的不確定度：根據(jù)證書電子天平(0.01mg)最大允許誤差為±0.03mg，按矩形分布，，則標準不確定度天平重復(fù)性誤差為±0.05mg，包含因子，則標準不確定度，天平的合成不確 定 度 為，標 準品的稱量為0.1070g，由天平帶來的相對不確定度

(3)溶解及稀釋過程引入的不確定度

①容量瓶的不確定度：由《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[15]查得，A級25mL容量瓶的容量允差為±0.03，按三角分布，包含因子，則不確定度，其相對不確定度為u4=0.0122/25=4.9×10-4；A級100mL單標線容量瓶的容量允差為±0.10，按三角分布，包含因子，則不確定度，其相對不確定度為u6=0.0408/100=4.1×10-4，標準品溶解及稀釋過程中共使用25mL容量瓶1次，100mL容量瓶2次，因此定容體積引入的合成不確定度

②移液管的不確定度：A級10mL移液管的容量允差為±0.02，按三角分布，，則標準不確定度為，標準品稀釋時，使用10mL移液管2次，則相對標準不確定度為

2.4.2 供試品溶液配制引入的不確定度

(1)容量瓶引入的不確定度：A級1000mL容量瓶的容量允差為±0.40，按三角分布，包含因子則不確定度，其相對不確定度u9=0.1633/1000=1.6×10-4；25mL和100mL容量瓶的不確定度計算方法同上，供試品溶解及稀釋過程中共使用25mL容量瓶1次，100mL容量瓶1次，1000mL容量瓶1次，則定容體積引入的合成不確定度

(2)移液管引入的不確定度：A級1mL移液管的容量允差為±0.007，按三角分布，，則標準不確定度為，標準品稀釋時，使用1mL移液管2次，則相對標準不確定度為

2.4.3 溫度引入的不確定度

供試品溶液和標準品溶液在相同條件下配制，膨脹系數(shù)和溫差相同，因此溫度引起的相對不確定度可忽略不計。

2.4.4 抑菌圈測量儀測量過程中引入的不確定度

(1)抑菌圈測量直徑引入的不確定度：對抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)效價公式計算效價為944.1U·mg-1，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得自由度為15，合并樣本標準偏差即標準不確定度為u11=0.1196，則相對標準不確定度為1.3×10-4

(2)抑菌圈測量儀的不確定度：抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02mm，概率分布為均勻分布，，則標準不確定度為抑菌圈測量儀的標準圈直徑為19mm，其相對標準不確定度為

2.5 計算合成不確定度

2.5.1 合成標準不確定度

各項不確定度的分量匯總表，如表2所示。

表2 各項不確定度分量匯總表

上述實驗中的不確定度分量，都是各自獨立的分量，合成相對標準不確定度

2.5.2 擴展不確定度

實驗結(jié)果一般用擴展不確定度來表示，U(y)/y=0.0073，y=944.1U·mg-1，則U(y)=0.0073×944.1U·mg-1= 6.89U·mg-1，按置信概率為95%，包含因子k=2計算，四環(huán)素片效價測定結(jié)果的擴展不確定度為：U=2U(y)=2×6.89U·mg-1=13.8U·mg-1

2.5.3 不確定度報告

按照《中國藥典》2015年版四部通則1201使用抗生素微生物檢定法測定四環(huán)素片的含量，該樣品效價測定的結(jié)果可表示為：(944.1±13.8)U·mg-1(k=2)。

3 討論

3.1 不同影響因素對抗生素微生物檢定法測定不確定度的影響不同，從文中分析的因素來看，標準品的純度對不確定度的影響最大，其次是溶解及稀釋過程中所用的移液管和容量瓶，溫度引起的相對不確定度可忽略不計。

3.2 《中國藥典》四部通則中抗生素微生物檢定法有兩種方法：管碟法和濁度法，實驗采用的方法為管碟法，此法主要為人工操作，需要實驗人員熟練、認真、細致操作，才能得到正確的檢驗結(jié)果，因此抑菌圈直徑值的不確定度與人員關(guān)系最大，進而最終影響到相對標準不確定度的合成。

3.3 本次實驗均采用日常的檢驗條件(包括儀器、方法及實驗條件)，通過分析影響四環(huán)素片含量測定的因素，對各個影響因素進行不確定度分析，其結(jié)果可以真實反映實驗室日常檢驗的水平，并且建立的評定方法可以作為四環(huán)素片含量測定不確定度的分析。

3.4 對測定結(jié)果進行不確定度分析，可以體現(xiàn)實驗室檢測水平的高低，同時也是對實驗室檢測能力的一個評價，作為藥品檢驗一線工作者，為確保檢驗結(jié)果的準確性與可靠性，我們必須高度重視，對影響不確定度的因素進行分析和總結(jié)，進一步提高實驗室的檢測能力和水平。