胰腺癌患者脫氧胞苷激酶(dCK)蛋白表達與吉西他濱 化療敏感性的關(guān)系

荊鑫，張強

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000)

1 吉西他濱與脫氧胞苷激酶的作用過程

吉西他濱(2'，2' - 雙氟脫氧胞苷，GEM)是細胞周期特異性的DNA合成、修復(fù)抑制劑，屬于胞嘧啶核苷衍生物，也屬于代謝物抗癌藥，其抗癌作用通過細胞的吸收及磷酸化。它主要作用于脫氧核糖核酸合成階段的腫瘤細胞，通過抑制腫瘤細胞從g1向S的發(fā)展，限制D脫氧核糖核酸復(fù)制和細胞分裂。吉西他濱轉(zhuǎn)運至腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮抑制脫氧核糖核酸復(fù)制作用需要借助腫瘤細胞膜的多種人核苷轉(zhuǎn)運體(hNTs)，這些人核苷轉(zhuǎn)運體主要包括鈉依賴型(hCNT)和鈉非依賴型(hENT)。吉西他濱作為臨床一線化療用藥，長期在胰腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的臨床治療中發(fā)揮作用[6]。

在細胞中，吉西他濱依賴于脫氧胞苷激酶(dCK)的作用才能發(fā)揮癌作用的發(fā)揮，這是一種重要的代謝調(diào)節(jié)因子，可催化很多種特定底物水平磷酸化。它作為脫氧胞苷激酶磷酸化反應(yīng)的良好底物，經(jīng)脫氧胞苷激酶磷酸化后，吉西他濱主要生成了三種磷酸化下游產(chǎn)物。作為DNA復(fù)制過程中的重要原料，脫氧核苷酸需要通過核苷酸還原酶還原而產(chǎn)生，然而核苷酸還原酶的活性可以被吉西他濱二磷酸鹽抑制，從而使脫氧核苷酸的產(chǎn)生減少，進一步負反饋抑制作用被逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致更多的吉西他濱三磷酸鹽的積聚。同時三磷酸鹽可以直接抑制脫氧胞苷脫氨酶，進而使更多的單磷酸鹽轉(zhuǎn)化成活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽和三磷酸鹽，這些活性產(chǎn)物又通過上述方式來抑制腫瘤細胞DNA的復(fù)制，進而發(fā)揮它們的抗癌作用[7]，除此之外，活性產(chǎn)物三磷酸鹽也可利用自身特有的“掩蔽鏈”作用，達到干擾腫瘤細胞DNA自我修復(fù)的目的，進而阻礙腫瘤細胞的DNA合成，DNA鏈斷裂，最終殺死腫瘤細胞[8]。有研究證明癌癥患者體內(nèi)如果脫氧胞苷激酶表達量下降、活性降低甚至于基因缺失則會導(dǎo)致細胞內(nèi)核苷酸庫失去平衡，從而導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，會降低核苷類藥物的抗癌效用[9]。因此，脫氧胞苷激酶被認為是吉西他濱和其他核苷藥物體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，對此類藥物發(fā)揮抗癌效用起著十分關(guān)鍵的作用。

2 基因的遺傳多態(tài)性與吉西他濱及其他核苷類藥物化療耐藥性的相關(guān)性研究

單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指因為基因組水平上單核苷酸變異而造成的DNA鏈斷裂，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。序列多態(tài)性屬于人類最常見的遺傳和變異類型之一。由于它可以影響基因的表達及其對應(yīng)蛋白的合成，所以SNP在影響人體對藥物的代謝反應(yīng)中的作用越來越受到醫(yī)學界的重視。近年來，有學者發(fā)現(xiàn)核苷類抗腫瘤藥物代謝關(guān)鍵酶(dCK)的多個相關(guān)SNP位點可影響其基因的表達及其對應(yīng)蛋白的合成，從而影響該類藥物對腫瘤細胞的復(fù)制和生長的抑制作用，削弱其抗癌療效。所以某些SNP位點有可能用來預(yù)測核苷類藥物效用。

對于脫氧胞苷激酶(dCK)來說，其SNP可以位于非編碼區(qū)或編碼區(qū)，可以各自影響其基因表達以及對應(yīng)蛋白的合成和活性，最終影響該代謝關(guān)鍵酶的效用。近年來，隨著臨床對藥物代謝過程和基因組學不斷深入的研究，人們逐漸認識到藥物代謝酶的單核苷酸多態(tài)性可能是個體出現(xiàn)作用差異的主要因素，愈來愈多的證據(jù)表明抗腫瘤藥物代謝關(guān)鍵酶dCK基因的遺傳多態(tài)性是使癌癥患者在化療過程中敏感程度不同的原因之一，有報道稱與核苷類藥物代謝有關(guān)的酶的SNP的改變可引起藥代動力學和毒性之間的個體差異[10]。因此，尋找影響吉西他濱等化療藥物基因表達或蛋白質(zhì)合成及活性的關(guān)鍵SNP位點，相當于尋找這些化療藥物的化學敏感性遺傳標記。在臨床上對患者實現(xiàn)預(yù)測化療藥物敏感性的目的，從而實現(xiàn)對癌癥患者的個體化治療，顯著提高患者預(yù)后。

脫氧胞苷激酶(DCK)包含7個外顯子，該基因在人類第4號染色體上，其相對分子質(zhì)量為34kb，它主要通過磷酸化脫氧胞苷及其類似物來在癌癥治療中發(fā)揮的抵抗作用。有研究發(fā)現(xiàn)在在急性髓細胞性白血病(AML)的化療中所采取的1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(AraC)的細胞毒活性受dCK磷酸化代謝的影響，從而影響其化療效果[11]。目前，許多研究表明多個dCK基因的SNP位點與核苷類化療敏感性有關(guān)。通過檢測dCK基因的SNP位點可以預(yù)測化療的敏感性。

自發(fā)現(xiàn)SNP位點的遺傳多態(tài)性在核苷類藥物化療中的重要影響以來，有越來越多的醫(yī)學研究者在這一領(lǐng)域想要探索出更明確的方向，2004年，陳竺等人的研究小組對不同種族的人群進行了dCK基因測序，鑒定出十三種之前沒有被發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，最終確認了7種，這7個SNP位點就是關(guān)于影響dCK基因或蛋白活性改變的SNP位點。在122項針對急性白血病患者的dCK基因研究中，Mank-Seymour發(fā)現(xiàn)C-360G和C-201T這兩個SNP位點的基因遺傳頻率較高。同時擁有基因型-360CG/-201TT患者對核苷類藥物的敏感性高于基因型-360CG或基因型-201TT的患者，前者dCK基因轉(zhuǎn)錄水平較高，因此兩個SNP位點-360CG/-201 TT與核苷類藥物反應(yīng)相關(guān)。證實了SNP位點的遺傳多態(tài)性在核苷類藥物化療中重要作用[12]；2007年，Lamba等人在人類DNA樣本中研究了他們的歐洲和非洲祖先的dCK基因，發(fā)現(xiàn)這些樣本中dCK基因的啟動子和外顯子區(qū)域存在C356G和C364T SNP突變，而這些SNP位點的突變與dCK的活性降低有關(guān)。此外，Lamba J等人還發(fā)現(xiàn)了dCK基因的表達在非洲人群中相較北歐和其他后裔人群更高更廣泛[13]。Joerger等人[14]發(fā)現(xiàn)了dCK基因的C364 T SNP突變位點與dCK的酶活性的降低和dCK相關(guān)蛋白表達水平下降有緊密聯(lián)系；2008年Kocabas[15]等通過對人的240個DNA樣本重測序來研究dCK和CMPK基因的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了dCK基因中A70G和C364T兩個SNP位點的突變與dCK的蛋白表達和dCK酶活性的降低密切相關(guān)，因此為通過檢測SNP位點預(yù)測胰腺癌患者核苷類藥物化療療效給予了方向；Rivero[16]針對74例正在使用吉西他濱化療方案的濾泡性淋巴瘤患者進行dCK基因的多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)了那些C28624T SNP位點發(fā)生改變的癌癥患者在化療后出現(xiàn)了不同的副作用，提示可以利用檢測dCK基因SNP位點的突變來預(yù)測胰腺癌患者吉西他濱化療的預(yù)后情況。Okazaki等人[17]發(fā)現(xiàn)細胞可以在化療期間對吉西他濱產(chǎn)生抗性，其中機制之一是決定吉西他濱在細胞內(nèi)的吸收的核苷轉(zhuǎn)運蛋白—人平衡核苷轉(zhuǎn)運蛋白-1(hENT-1)表達水平的降低引起的，可以引起dCK基因A727C SNP突變位點，從而影響胰腺癌患者的化療療效；因此，我們的研究和分析表明，吉西他濱的化療敏感性與腫瘤組織中dCK的表達密切相關(guān)。其中，dCK高表達的患者采用以吉西他濱為主的化療方案治療時可以有更好的效果。

此外，研究人員還針對臨床上接受吉西他濱化療的胰腺癌患者，采取了他們接受吉西他濱化療前的腫瘤組織樣本和他們接受化療后的腫瘤組織樣本的生存時間做了相關(guān)性分析，結(jié)果表明腫瘤組織中dCK蛋白的含量與患者的化療后生存期關(guān)系緊密，dCK蛋白表達水平越高，生存時間越長[18]。以上這些研究發(fā)現(xiàn)都為利用檢測dCK基因SNP位點來預(yù)測胰腺癌患者吉西他濱化療敏感性提供了依據(jù)。

3 脫氧胞苷激酶(dCK)蛋白表達與吉西他濱化療敏感性的關(guān)系

脫氧胞苷激酶(dCK)廣泛存在于人體組織和細胞中，屬于一種代謝酶，它可以使人體的核苷酸庫保持平衡，并催化多種特異性底物的磷酸化，如嘧啶和嘌呤脫氧核苷，包括重要的抗病毒藥物和細胞生長抑制藥物等。吉西他濱就是dCK磷酸化的良好底物之一，吉西他濱通過細胞膜上的人核苷轉(zhuǎn)運體進入細胞，繼而被dCK分步磷酸化，而其產(chǎn)生的磷酸化產(chǎn)物，可以通過許多種方式來抑制腫瘤細胞中DNA的復(fù)制及合成，化療藥物就達到了它的抗腫瘤作用。吉西他濱在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤效用的過程中脫氧胞苷激酶在其中起到了不可或缺的作用，扮演了化療藥物活化過程中限速酶的角色[19]。

介于dCK在核苷類藥物的抗腫瘤效用中扮演了不可或缺的作用，那么我們當然可以猜想dCK活性的改變會直接影響到這一類化療藥物的化療效果。Hubeek等人[20]利用了118個兒科組織樣本(包括多種癌癥)研究脫氧胞苷激酶蛋白的表達水平，這些樣本包括病理切片和組織細胞等成分等，發(fā)現(xiàn)不同癌癥患者脫氧胞苷激酶蛋白的表達情況不相同，除此之外他們還發(fā)現(xiàn)患有同一種癌癥病人的脫氧胞苷激酶蛋白的表達水平也存在個體性差異，進一步證實了臨床癌癥患者體內(nèi)脫氧胞苷激酶蛋白的表達水平與阿糖胞苷等化療類藥物的敏感性相關(guān)。

綜上已經(jīng)可以看出目前醫(yī)學界對癌癥患者體內(nèi)dCK基因及其編碼蛋白的表達與核苷類藥物的化療療效的相關(guān)性的初步探索已經(jīng)有很多，期望通過發(fā)現(xiàn)他們之間的相關(guān)性來實現(xiàn)預(yù)測胰腺癌患者接受吉西他濱化療療效的目的。Kroep等[21]建立了包括胰腺癌、肺癌、膀胱癌等七種小鼠的腫瘤模型，并開展了吉西他濱化療敏感性的檢測，也測定了dCK酶的活性程度、dCK的mRNA表達水平和蛋白表達水平，結(jié)果顯示dCK是吉西他濱敏感性的重要預(yù)后標志物，其蛋白質(zhì)水平與dCK活性(P＜0.001)和吉西他濱敏感性(P＜0.001)均顯著相關(guān)；Hapke等人[22]通過用含有dCK或LacZ cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LNPO感染三個腫瘤細胞系MCF-7，HT-29和H1437并測量了對核苷類似物的相應(yīng)敏感性證明了在體外致敏的實體腫瘤細胞中轉(zhuǎn)染dCK基因可能是治療這些惡性腫瘤的有用輔助手段；Blackstock等人[23]通過高效液相色譜(HPLC)和氟19磁共振波譜(F-19 MRS)檢查了HT-29人結(jié)腸癌異種移植物中裸鼠中dFdCyd/dFdCTP 的攝取和清除情況，發(fā)現(xiàn)dCK異種移植物在吉西他濱治療后敏感性增強，表現(xiàn)出明顯的腫瘤生長延遲；Ricci等人[24]通過對44例胰腺癌患者手術(shù)切除的標本進行免疫組化染色，結(jié)果顯示dCK蛋白的表達程度與吉西他濱化療患者的年齡、性別、OS和DFS有密切的關(guān)系，并且顯示出一系列的標記強度，范圍從1+到3+，認為dCK蛋白是一種與胰腺癌吉西他濱化療療效有關(guān)聯(lián)的標志物，吉西他濱治療后dCK表達降低，總體生存率提高，另外該團隊還發(fā)現(xiàn)dCK蛋白主要集中于細胞核中，而先前的研究者則通過對44例胰腺癌患者的脫氧胞苷激酶(dCK)進行免疫組織化學評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)44例中有40例dCK陽性，并且dCK表達低與年齡增長，女性，以及患者總體生存率下降顯著相關(guān)，且指出dCK蛋白在細胞質(zhì)中的定位部[25]。Stegmann等人[26]將野生型脫氧胞苷激酶(dCK)cDNA轉(zhuǎn)染到克隆來源的阿糖胞苷(AraC)和地西他濱耐藥的大鼠白血病細胞系中，結(jié)果顯示可完全恢復(fù)藥物敏感性；Manome等人[27]發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體介導(dǎo)的dCK的cDNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)均導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系對ara-C的體外細胞毒性的敏感性提高，用dCK轉(zhuǎn)導(dǎo)的已建立的皮內(nèi)和腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的ara-C治療可在體內(nèi)產(chǎn)生顯著的抗腫瘤作用；Marechal等人[28]進行的dCK蛋白表達相關(guān)的免疫組化檢測，認為dCK蛋白的表達與胰腺癌患者的術(shù)后生存率和無瘤生存率有關(guān)，可作為獨立的預(yù)后預(yù)測因素。

然而上述研究中多采用生存時間和總體生存率對胰腺癌患者核苷類藥物化療敏感性評估，用兩個同一類的評估指標去評估吉西他濱化療敏感性說服力不足，因為在臨床治療中由于癌癥患者的生理機能、免疫功能等存在個體化差異，這些個體化差異也會導(dǎo)致患者對化療藥物的敏感性出現(xiàn)差別，故不能單純靠生存率和生存時間來精準預(yù)測吉西他濱化療對于胰腺癌患者作用的敏感性。且目前關(guān)于此類課題的研究中缺少探討dCK蛋白通路下游的詳細調(diào)控機制，關(guān)于dCK基因及蛋白表達是如何來影響吉西他濱等核苷類藥物的敏感性的具體機制沒有進行深一步的研究，這也為以后的探索提供了方向。