作為壓瘡填充物的脫細胞真皮基質(zhì)生物特性研究

楊彩仙，郭繼強，，劉 陽，王 立，張 利，安美文

(1.太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，太原 030024；2.山西白求恩醫(yī)院，太原 030032)

壓瘡(壓力性潰瘍)在臨床上常病發(fā)于中風(fēng)或昏迷而臥床的病人，尤其是截癱患者，主要是由長期內(nèi)源性壓力引發(fā)局部皮膚組織缺血、壞死所致，其中1/3[1]壓瘡均位于骶尾部。骶尾部及坐骨結(jié)節(jié)處的壓瘡?fù)饪谛?、?chuàng)底大，深部組織損傷嚴重，潛在壞死范圍大于表面所見，其可累及皮膚、皮下組織、肌肉、肌腱甚至深達骨質(zhì)，且常合并慢性感染[2]，據(jù)報道全世界每年約有6萬人死于壓瘡合并癥[3]?，F(xiàn)今有很多類型的重建手術(shù)可為一期擴創(chuàng)后的大面積、大體積的空腔提供其所需皮膚的覆蓋，以及軟組織的填充[2]，傳統(tǒng)的局部皮瓣和臀大肌皮瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)壓瘡，為治愈相對表淺的壓瘡提供了一種切實可靠的方法；而對于深度壓瘡，由于其填充效果并不理想，受壓摩擦后易再發(fā)，已經(jīng)成為一個全球性迫切需要解決的醫(yī)療健康問題[4]。

國際NPUAP-EPUAP壓瘡分級為：Ⅰ期，皮膚完整，局部有壓之不褪色的局限性紅斑，多出現(xiàn)在骨隆突處；Ⅱ期，真皮部分出現(xiàn)缺失；Ⅲ期，全層皮膚組織缺失；Ⅳ期，組織全層缺失，合并有骨、肌肉或肌腱外露，焦痂或腐肉可以出現(xiàn)在創(chuàng)面的某些部位，常常合并有隧道或者潛行出現(xiàn)。深度壓瘡是指壓瘡分期中的Ⅲ期和Ⅳ期壓瘡，即壓瘡的潰瘍期，深度壓瘡的特點是全層皮膚破壞，壞死組織深達皮下組織和深層肌肉組織，伴有嚴重的感染，甚至向周邊及深部擴展，累及骨面。為消滅深度壓瘡形成的“窟窿”最好的辦法無非是填充“窟窿”，而填充壓瘡“窟窿”最佳辦法無非是軟組織[5]。

臨床上應(yīng)用的填充材料主要包括非生物性材料和生物性材料兩大類[6]。由于后者植入體內(nèi)后具有一定的組織和細胞生長誘導(dǎo)作用和自身塑形作用，因此生物性填充材料的開發(fā)和應(yīng)用成為近年來研究的熱點[7-10]。目前臨床應(yīng)用中的4個常用領(lǐng)域，包括最為典型的慢性創(chuàng)面糖尿病足潰瘍，整形外科領(lǐng)域的乳房重建，普通外科領(lǐng)域的腹部皮膚缺損修復(fù)，口腔頜面外科的組織缺損重建修復(fù)[11]。

在眾多的生物軟組織填充材料中，脫細胞真皮基質(zhì)是近年來的研究熱點之一，由于脫細胞真皮基質(zhì)去除了抗原性很強的細胞成分，保留了抗原性相對較弱的細胞外基質(zhì)成分，從而可避免移植后的急性排斥反應(yīng)。在結(jié)構(gòu)上保留了天然真皮的基本框架，更接近于正常真皮結(jié)構(gòu)，很適合作為生物軟組織填充材料修復(fù)臨床上常見的凹陷性組織缺損。同種異體真皮脫細胞基質(zhì)取自異體皮，而異體皮多取自保存完好的尸體皮，其來源十分有限，且存在傳染疾病的危險，同時受到倫理學(xué)的制約，其應(yīng)用受到極大的限制。異種脫細胞真皮的應(yīng)用存在以下缺陷：①較強的免疫原性；②血管化速度緩慢；③潛在異源性病毒微生物感染風(fēng)險[12]。因此，本文采用臨床健康人體包皮環(huán)切術(shù)的標(biāo)本脫細胞進行后續(xù)研究。

本文根據(jù)前期研究，確立了一套完善的物理方法、胰酶消化法和洗滌劑漂洗的真皮脫細胞制備工藝。但是，該脫細胞工藝對真皮結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性影響尚未了解，本研究擬對此問題深入研究，檢測該工藝制備的脫細胞真皮基質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)及力學(xué)特性，采用體外培養(yǎng)方法驗證其生物相容性，為其應(yīng)用于壓瘡治療提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 脫細胞基質(zhì)的制備

研究項目經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，研究中涉及到的人體組織為包皮環(huán)切手術(shù)所切下的正常組織，組織來源于無傳染性疾病的患者，患者及家屬對實驗知情并同意。取樣后用生理鹽水沖洗，碘伏消毒，使用含質(zhì)量分數(shù)1%的青霉素及鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)浸潤消毒30 min，PBS洗3遍，去除皮膚的皮下組織，為對照組。對照組再采用γ射線對其滅菌，質(zhì)量分數(shù)0.05%Trypsin酶/EDTA在37 ℃脫細胞24 h，在搖床上使用含質(zhì)量分數(shù)1%的青霉素及鏈霉素的PBS制備脫細胞基質(zhì)。

1.2 基質(zhì)內(nèi)部特性檢測

掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM，JSM-7100F，Jeol日本)觀察兩組材料真皮內(nèi)部結(jié)構(gòu)。將兩組(n=3)材料用0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)洗滌30 min后，用質(zhì)量分數(shù)2.5%戊二醛磷酸緩沖液固定，0.01 mol/L PBS(pH=7.4)浸洗2次，每次5 min；分別用體積分數(shù)50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水各5 min，質(zhì)量分數(shù)100%乙醇脫水3次，每次5 min；之后冷凍干燥樣品，真空噴金，掃描電鏡觀察，拍照。原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM，L01K180，BRUKE德國)觀察兩組材料真皮表面微區(qū)結(jié)構(gòu)。使用一個探針(模型NCHV，BRUKER，UA)和1 Hz表面掃描頻率在輕敲模式下成像，掃描兩組(n=3)材料表面。掃描面尺寸為10 μm×10 μm，并使用Nanoscope軟件對結(jié)果進行評估。

排乙醇稱重法測孔隙率。取基質(zhì)(n=3)，冷凍干燥。每個支架干燥后稱重記為m1，置入50 mL含體積分數(shù)75%的乙醇離心管。抽真空至不再有氣泡溢出，稱含有乙醇和支架材料離心管m2，將含有乙醇的支架材料取出，稱剩余的乙醇及離心管m3.按式(1)計算孔隙率P[13]：

(1)

材料的表觀密度。取基質(zhì)(n=3)，冷凍干燥。將支架做成矩形，用游標(biāo)卡尺測定支架材料的長a、寬b和厚度H，每份樣品重復(fù)操作3次，取平均值。用電子天平稱量支架材料的重量m，則材料的表觀密度ρ按式(2)計算：

(2)

1.3 基質(zhì)生物力學(xué)壓縮彈性模量測量

壓痕法表征基質(zhì)真皮面生物力學(xué)壓縮性能。將各組材料剪成1 cm×1 cm大小，使用Instron5544萬能試驗機(Instron5544，英斯特朗上海材料試驗機公司)鋼針直徑為1 mm，設(shè)置下降速率為1 mm/min，檢測支架壓縮彈性模量。按文獻[14]報道的模型對實驗獲得的載荷-位移曲線進行分析，按照式(3)計算獲得皮膚的整體剛度。

(3)

式中：F表示載荷，E表示皮膚的整體剛度，r表示探針半徑，s表示位移，ν表示泊松比。結(jié)束條件為應(yīng)變達到80%.

1.4 生物學(xué)特性驗證

HE常規(guī)染色觀察真皮基質(zhì)中細胞成分脫除效果。真皮基質(zhì)表面接種能穩(wěn)定表達熒光Lifeact的細胞株24 h、48 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞在基質(zhì)表面的黏附情況，并拍照。分別取真皮基質(zhì)(n=3)置于24孔板中，用于檢測1 d、4 d、7 d的細胞量，HFB接種密度為2.25×104個/孔，另設(shè)9個無基質(zhì)對照孔，按CCK-8(碧云天，上海)說明書分別檢測1 d、4 d、7 d吸光度值觀察細胞的增殖情況。其中CCK-8孵育1 h，酶標(biāo)儀上在450 nm處檢測培養(yǎng)液的吸光度值。按式(4)計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)，根據(jù)《非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料生物性能測試標(biāo)準(zhǔn)》6級毒性分級法評定脫細胞真皮基質(zhì)材料的細胞毒性，評級≥2級則判定材料存在細胞毒性。

(4)

細胞長入情況。取真皮基質(zhì)(n=6)于6孔板，HFB接種密度為1×104個/孔，培養(yǎng)體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)細胞3 d后，將其中3個基質(zhì)從中間剖開(示意簡圖見圖1)，多聚甲醛固定，DAPI(Sigma，美國)染色觀察支架橫截面細胞的分布；基質(zhì)與HFB共培養(yǎng)9 d后，取出剩余3個基質(zhì)從中間剖開，DAPI染色觀察支架橫截面細胞的分布。

圖1 基質(zhì)縱向橫截面示意簡圖Fig.1 Schematic diagram of longitudinal cross section of matrix

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，測試樣本為3個，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)

掃描電鏡下可見脫細胞基質(zhì)內(nèi)部纖維與正常組織纖維相比損失了一部分，表現(xiàn)出缺損，如圖2所示。

圖2 SEM材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖Fig.2 SEM images of material internal structure

對照組材料與基質(zhì)的高度分別為(1 659.3±605.4)nm，(2 451.0±404.4)nm；粗糙度分別為(0.790±0.035)，(0.819±0.007).原子力顯微鏡檢測支架表面100 μm2的面積內(nèi)發(fā)現(xiàn)最高高度和粗糙度基質(zhì)和正常組織相比無統(tǒng)計學(xué)意義，脫細胞處理沒有改變基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 兩組材料表面微區(qū)高度及粗糙度Fig.3 Height and roughness of microzone on the surface of the two groups of materials

材料孔隙率可反應(yīng)材料內(nèi)部的疏松程度。通過采用排乙醇稱重法測量材料孔隙率，本文發(fā)現(xiàn)基質(zhì)孔隙率為(86.7±2.1)%，相比對照組的孔隙率(59.2±9.9)%顯著上升，P<0.05，結(jié)果如圖4所示。

*表示與對照組相比，實驗組顯著性統(tǒng)計值P<0.05，***表示P<0.001.圖4 兩組材料孔隙率及表觀密度Fig.4 Void ratio and apparent density of two groups

通過檢測，本文發(fā)現(xiàn)與對照組密度值(0.393±0.136)g/cm3相比，基質(zhì)的密度值(0.099±0.020)g/cm3下降，這與細胞去除后留下空隙相關(guān)，說明基質(zhì)材料疏松，結(jié)果如圖4所示。

2.2 基質(zhì)壓縮彈性模量表征結(jié)果

材料壓縮彈性模量表征材料抵抗彈性變形的能力，基質(zhì)壓縮彈性模量(12.59±5.50)MPa與對照組材料壓縮彈性模量(6.75±2.20)MPa相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即在壓瘡修復(fù)中受壓時該基質(zhì)抗壓性能與正常皮膚無差異，結(jié)果如圖5所示。

圖5 各組材料壓縮彈性模量Fig.5 Elastic modulus in compression of each group

2.3 生物學(xué)特性表征結(jié)果

2.3.1HE染色和細胞黏附實驗

HE染色可使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色，細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色，兩組材料HE染色結(jié)果如圖6所示。對照組真皮中存在大量細胞，基質(zhì)中基本無核酸成分，說明脫細胞效果較好。接種細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)在支架上細胞大多數(shù)呈圓形，20倍鏡觀察到有少數(shù)細胞黏附、鋪展較完全，表現(xiàn)為細胞呈梭形；48 h后，低倍鏡下看到有更多的細胞黏附在支架上，20倍鏡觀察到絕大部分細胞已完全鋪展到支架上，呈梭形，如圖7所示。

圖6 兩組材料HE染色圖Fig.6 HE staining of two groups of materials

圖7 熒光細胞在支架表面的黏附Fig.7 Adhesion of fluorescent cells on the surface of scaffold

2.3.2細胞毒性檢測結(jié)果

把脫細胞真皮基質(zhì)表面接種HFB后，僅為細胞和培養(yǎng)液的對照孔及基質(zhì)周圍細胞生長狀況如圖8所示，可觀察到細胞長勢基本無差異，至第7 d時，對照組基本鋪滿細胞，材料周邊也基本鋪滿細胞，10倍物鏡下基本呈線形排列。CCK-8檢測細胞增殖檢測結(jié)果如圖9所示，細胞與基質(zhì)共培養(yǎng)7 d細胞數(shù)量不斷增加，表明脫細胞基質(zhì)良好的生物相容性。根據(jù)《非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料生物性能測試標(biāo)準(zhǔn)》6級毒性分級法評定脫細胞基質(zhì)細胞毒性[11]，得到表1，判定該材料無細胞毒性。但對照組孔細胞增殖水平仍高于實驗組，推測接種細胞數(shù)較多，基質(zhì)占據(jù)一定的空間位置，而細胞又不容易從基質(zhì)底部長入基質(zhì)，空間因素的限制導(dǎo)致實驗組細胞數(shù)量少于對照組。

圖8 HFB在存在基質(zhì)(實驗組)與不存在基質(zhì)(對照組)的生長Fig.8 Growth of HFB in the presence (Experience group) and without the presence (Control group)

圖9 HFB不同時間CCK-8檢測增殖結(jié)果Fig.9 Proliferation of HFB detected by CCK-8

表1 材料組細胞相對增殖率及毒性評價Table 1 Evaluation of cell relative proliferation rate and toxicity in material group

2.3.3細胞長入情況

基質(zhì)表面接種細胞3 d后，從支架邊緣沿厚度方向剖開，倒置熒光顯微鏡觀察到縱向橫截面沿厚度方向有大量藍色細胞核的分布，細胞長入方向如紅箭頭所示，靠近支架邊緣細胞較多(如圖10所示)，且分布不均勻?；|(zhì)表面接種細胞9 d后，縱向橫截面基本充滿均勻的藍色細胞核。

圖10 細胞在基質(zhì)上的長入情況Fig.10 Cell growth in matrix

3 討論

脫細胞真皮基質(zhì)去除了抗原性很強的細胞成分，保留了抗原性相對較弱的細胞外基質(zhì)成分，從而可避免移植后的急性排斥反應(yīng)[15]。在結(jié)構(gòu)上保留了天然真皮的基本框架，更接近于正常真皮結(jié)構(gòu)，且脫細胞真皮基質(zhì)在體內(nèi)會逐漸降解并被新生組織替代，成為在功能、形態(tài)上與周圍正常組織一致或相似的自體組織。因此，脫細胞真皮基質(zhì)可作為組織凹陷的良好充填物，可片狀重疊充填，亦可雙層、三層甚至更多層充填[16]。

目前脫細胞基質(zhì)存在天然材料固有的缺點——力學(xué)性能較差，針對組織工程脫細胞真皮制備中存在的不足，研究組織工程真皮基質(zhì)的制備方法及其特性能為臨床治療創(chuàng)面提供依據(jù)[17]。本文所使用的真皮來自健康人的包皮環(huán)切術(shù)的人體多余組織，術(shù)前會進行常規(guī)檢查，相較異體尸體皮較安全，且此部位皮膚彈性優(yōu)于人身體其他部位[18]，但將人體脫細胞真皮基質(zhì)作為壓瘡填充物的研究鮮有報道。

細胞外基質(zhì)衍生的生物支架是使用自上而下構(gòu)建組織的，由經(jīng)過處理的天然細胞外基質(zhì)組成的生物支架已經(jīng)被植入數(shù)百萬人體內(nèi)，應(yīng)用范圍從疝氣治療和肩部肩袖修復(fù)到乳房重建手術(shù)[9，19]。生物支架是通過殺死細胞并洗掉它們的殘余物而形成的，留下組織細胞外基質(zhì)，它是蛋白聚糖和蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，可以根據(jù)臨床需要加工成植入物、可注射水凝膠或顆粒懸浮液，它們可在特定部位作為細胞遷移和新組織發(fā)育的支架[10]，本文中脫細胞基質(zhì)與對照組相比，其相對增殖率判定該基質(zhì)無細胞毒性作用，且體外培養(yǎng)9 d HFB可基本充滿基質(zhì)內(nèi)部。因此，該真皮脫細胞基質(zhì)可應(yīng)用于壓瘡治療中的組織填充物，為壓瘡周圍正常細胞遷移提供附著位點，以便于新的皮膚組織的形成。

理想的組織填充材料必須具備以下條件[6]：1) 組織相容性好；2) 不致癌，不致畸；3) 與宿主有一定的結(jié)合能力；4) 無微生物、病毒或其他病原體存在；5) 無抗原性、不導(dǎo)致免疫及組織相關(guān)性疾?。?) 效果持久、可靠；7) 易于消毒、貯藏；8) 置入宿主體內(nèi)后易于成形、塑形及固定。

本文脫細胞基質(zhì)采用的γ射線[20-21]是常用的組織移植物滅菌方法，γ射線能使其他物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基(OH·H)再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環(huán)狀結(jié)構(gòu)或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，可有效抑制或殺死微生物[22]。本文采用的γ射線輻射的劑量為國際原子能機構(gòu)(international atomic energy agency，IAEA)所建議的25 kGy[23]，故本文所用脫細胞基質(zhì)作為壓瘡填充物無微生物、病毒或其他病原體存在，無細胞成分，易于消毒、貯藏。

胰蛋白酶是人體自身也存在的，對人體不致癌、不致畸，γ射線作為組織移植物滅菌，未見其對人體致癌、致畸報道，故本文中基質(zhì)制備中所使用試劑對人體較安全。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中無細胞、核酸成分，故本文所用脫細胞基質(zhì)作為壓瘡填充物抗原性低、不導(dǎo)致免疫及組織相關(guān)性疾病。

本實驗結(jié)果基質(zhì)內(nèi)部呈現(xiàn)纖維縱橫交錯的結(jié)構(gòu)，且微區(qū)表面高度與粗糙度和正常皮膚無差異，即基質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)未被破壞，有利于細胞長入基質(zhì)內(nèi)部[24]。本文基質(zhì)孔隙率為(86.7±2.1)%，與胡杰等[25]的脫細胞真皮基質(zhì)材料孔隙率相似(70%～90%)，他們的基質(zhì)材料在應(yīng)用時細胞得以長入，又不至于造成纖維消化出現(xiàn)塌陷和空隙層，若本文基質(zhì)應(yīng)用于壓瘡，理應(yīng)細胞易長入且不易塌陷。

本文表觀密度測試發(fā)現(xiàn)基質(zhì)表觀密度值為(0.099±0.020)g/cm3，與王一騰[26]的殼聚糖-明膠支架的0.085 g/cm3相似，與徐學(xué)蓋等[27]的PLA@Gelatin/MNP支架0.073 g/cm3相似。基質(zhì)壓縮彈性模量與正常皮膚相似，用于壓瘡填充物耐壓，抗變形能力強。基質(zhì)孔隙率、表觀密度與對照組相比均具有顯著性差異，但彈性模量與對照組相比沒有顯著差異，說明脫除的細胞成分對基質(zhì)壓縮彈性模量無影響，故本文基質(zhì)壓縮彈性模量與正常皮膚非常相近。

細胞48 h可完全黏附、鋪展到基質(zhì)表面、基質(zhì)對細胞無毒性作用、基質(zhì)與細胞體外共培養(yǎng)3 d發(fā)現(xiàn)可長入基質(zhì)內(nèi)部一部分、共培養(yǎng)9 d可發(fā)現(xiàn)細胞充滿基質(zhì)內(nèi)部，均表明本文的脫細胞基質(zhì)具有良好的生物學(xué)性能。這與人們一直以來認為的組織細胞外基質(zhì)與其來源的天然組織相似的認識一致，其可能提供重要但未知的，吸引和調(diào)節(jié)細胞功能的生物信號。這種雙重結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系可以用于再生醫(yī)學(xué)，例如將豬細胞外基質(zhì)引入傷口，不僅填充了組織空隙，而且通過將負責(zé)組織重建的細胞吸引到材料中，隨后改變它們的行為來激活增強傷口愈合反應(yīng)的途徑[28]。植入體對生物支架的再生反應(yīng)，與特定的免疫信號有關(guān)，現(xiàn)在認為這是修復(fù)和再生過程中的早期關(guān)鍵步驟[29]。

本文使用的是來源于健康人體的同種異體的脫細胞皮膚基質(zhì)，不會對患者自體其他部位產(chǎn)生損傷，且優(yōu)于異種基質(zhì)，作為壓瘡組織填充物植入人體易于塑形、固定，后期患者細胞長入基質(zhì)形成新組織，該組織填充物效果可達良久。綜上所述，本文所制備的脫細胞基質(zhì)脫細胞真皮制備方法相對簡單，制備條件溫和，滿足壓瘡理想填充材料的要求，使用人體脫細胞真皮基質(zhì)作為組織填充物是治療壓瘡可靠的修復(fù)手段，值得臨床推廣。