辛伐他汀通過介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞免疫促進(jìn)成骨和成血管的研究

屈廣平，趙宇宇，姚曉紅，杭瑞強(qiáng)

(太原理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 醫(yī)用金屬材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024)

以鈦合金為代表的硬組織植入材料已廣泛用于臨床，以修復(fù)或重建受損的硬組織功能，并且在青少年和中年人中有很高的成功率，但老年人的成骨活性較弱，導(dǎo)致骨整合能力差，植入失敗的風(fēng)險(xiǎn)仍然相對(duì)較高[1]。影響成骨活性的因素有很多，其中由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的骨免疫微環(huán)境起著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞是具有高度可塑性的主要免疫效應(yīng)細(xì)胞，參與骨修復(fù)和再生的各個(gè)階段[2]。它們可以極化為促炎的M1和促組織愈合的M2表型，這兩種表型對(duì)于骨再生和植入材料的骨整合都非常重要。M1型巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1β和TNF-α等，以對(duì)抗細(xì)菌感染并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，而M2型巨噬細(xì)胞分泌多種成骨和成血管細(xì)胞因子，如BMP-2和VEGF等，以加速骨再生[3]。對(duì)于青少年和中年人的正常巨噬細(xì)胞，它們可以在骨整合過程中及時(shí)從M1表型轉(zhuǎn)換為M2表型。然而，對(duì)于老年人體內(nèi)的衰老巨噬細(xì)胞來說，這種轉(zhuǎn)換通常會(huì)發(fā)生延遲，從而導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間的炎癥并使骨整合受到影響[4]。

衰老巨噬細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)和線粒體功能障礙(MD)被認(rèn)為是導(dǎo)致M1向M2轉(zhuǎn)變延遲的兩個(gè)主要原因。正常巨噬細(xì)胞因感染和氧化應(yīng)激等外部刺激誘導(dǎo)的ERS，可通過未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)來緩解。然而，對(duì)于衰老巨噬細(xì)胞而言，UPR能力下降導(dǎo)致ERS無法及時(shí)緩解，促進(jìn)NF-κB的激活和巨噬細(xì)胞典型M1標(biāo)志物(TNF-α、IL-1β和i-NOS)的轉(zhuǎn)錄[5]。衰老還可以增加線粒體DNA(mtDNA)突變和活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而降低呼吸鏈活性和三磷酸腺苷的合成，最終導(dǎo)致MD[6].一方面，功能紊亂的線粒體通過增加胞漿Ca2+濃度和ROS產(chǎn)生來激活NLRP3炎性體。另一方面，功能紊亂的線粒體導(dǎo)致M2巨噬細(xì)胞的主要ATP來源——氧化磷酸化(oxphos)水平降低[5]?？偟膩碚f，ERS和MD傾向于將衰老的巨噬細(xì)胞維持在M1表型并阻止它們向M2表型轉(zhuǎn)變。

所有細(xì)胞都可以控制其組分(例如蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)的質(zhì)量以維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。一個(gè)重要的質(zhì)量控制機(jī)制是自噬。自噬為一種分解代謝過程，可以降解細(xì)胞中功能失調(diào)或多余的成分以供自身重復(fù)使用[7]。自噬可以通過清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)或去除ER膜上的UPR傳感器來緩解ERS[8].此外，線粒體自噬可以選擇性地消除功能失調(diào)的線粒體[9]。然而，隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞的自噬水平也會(huì)逐漸降低，無法緩解ERS和清除功能失調(diào)的線粒體以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

LUO et al[10]研究表明，Ti表面的微納米結(jié)構(gòu)可以通過激活ERK-Beclin-1自噬軸來促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化。后續(xù)研究表明，負(fù)載銀納米粒子的TiO2納米管可以通過激活自噬促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化[11]。盡管已經(jīng)取得上述進(jìn)展，但鈦表面形貌誘導(dǎo)的自噬相對(duì)較弱，并且銀納米顆粒的摻入可能會(huì)引起安全問題。相比之下，一些臨床使用的藥物可能更有效、更安全。辛伐他汀是一種降脂藥物，在適當(dāng)劑量下可有效降低心血管風(fēng)險(xiǎn)，且副作用低[12]。最近的研究表明，辛伐他汀可抑制肌細(xì)胞[13]、成骨細(xì)胞[14]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[15]和軟骨細(xì)胞[16]等的mTOR，使ULK1/2和Atg13去磷酸化，并進(jìn)一步引發(fā)自噬體形成促進(jìn)自噬[17]。至于巨噬細(xì)胞，之前的研究表明辛伐他汀可以增強(qiáng)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬[18]，這表明辛伐他汀有望通過誘導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞的自噬恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)其從M1型向M2型轉(zhuǎn)變。

本文首先研究辛伐他汀濃度與衰老巨噬細(xì)胞活性、增殖、細(xì)胞骨架組裝、氧化應(yīng)激和極化之間的關(guān)系；然后，評(píng)估辛伐他汀刺激下衰老巨噬細(xì)胞營(yíng)造的免疫微環(huán)境對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響；最后，初步探索鈦表面裝載辛伐他汀介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞功能的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 辛伐他汀對(duì)衰老巨噬細(xì)胞功能的影響

1.1.1藥品

辛伐他汀(SIM)購(gòu)自Adamas。SIM溶液以二甲基亞砜(DMSO，國(guó)藥)為溶劑配制并在-20 ℃儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)過程中條件培養(yǎng)基含SIM濃度為0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L.

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7在補(bǔ)充有胎牛血清(FBS，Gibco)、青霉素(Solarbio)和鏈霉素(Solarbio)的DMEM(Gibco)中培養(yǎng)，細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過程中保存放置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，通過吹打消化細(xì)胞。細(xì)胞按3×105cells/cm2密度接種6 h后，用含1.4 mmol/L的H2O2(Adamas)的培養(yǎng)基刺激2 h使細(xì)胞衰老，培養(yǎng)12 h后做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。除衰老模型建立，其他實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞密度不做特別說明都為5×104cells/cm2.

1.1.3細(xì)胞增殖

利用MTT法評(píng)估細(xì)胞增殖。將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1和2天后，使用MTT(BBI)反應(yīng)液染色，4 h后用DMSO溶解并在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。

1.1.4細(xì)胞形態(tài)

將細(xì)胞接種衰老后利用倒置顯微鏡(IRM，尼康)拍攝細(xì)胞光學(xué)形貌。

1.1.5細(xì)胞活死

將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1和2天后用活死熒光染色液(Invitrogen)37 ℃避光染色40 min，然后用激光共聚焦顯微鏡(CLSM，C2 plus，尼康)拍照。

1.1.6細(xì)胞骨架

將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天后用50 ng/mL的LPS(碧云天)活化刺激2 h，然后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h.之后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，再用骨架染色液(Sigma)避光染色40 min，并用DAPI(Sigma)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，最后利用CLSM拍照。

1.1.7細(xì)胞ROS

利用活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天后加入ROS染色試劑孵育20 min.洗滌后，用Hoechst 33342(碧云天)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。利用CLSM拍攝細(xì)胞活性氧熒光定性圖片。最后通過NIH ImageJ 1.45軟件定量分析每組的平均熒光強(qiáng)度。

1.1.8細(xì)胞免疫熒光

利用Anti-iNOS抗體(Abcam)和Anti-Mannose Receptor抗體(Abcam)染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞的極化。巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天后，用4%多聚甲醛固定30 min，之后進(jìn)行通透、封閉和一抗、二抗(i-NOS用555(紅)，CD206用488(綠))的孵育，最后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，利用CLSM拍攝細(xì)胞免疫熒光定性圖片。最后通過NIH ImageJ 1.45軟件定量分析每組的平均熒光強(qiáng)度。

1.2 衰老巨噬細(xì)胞免疫微環(huán)境對(duì)衰老內(nèi)皮細(xì)胞的影響

在內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和ROS與上文中實(shí)驗(yàn)方法一致。

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA. Hy926與巨噬細(xì)胞培養(yǎng)條件相同。內(nèi)皮細(xì)胞所用培養(yǎng)基為不同組巨噬細(xì)胞上清液和正常DMEM培養(yǎng)基1∶1配制。

將內(nèi)皮細(xì)胞以4×104cells/cm2的密度接種培養(yǎng)24 h后更換含600 μmol/L的H2O2培養(yǎng)基刺激2 h使細(xì)胞衰老，培養(yǎng)12 h后做后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。除衰老模型建立，其他實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞密度不做特別說明都為1×104cells/cm2.

1.2.2內(nèi)皮細(xì)胞NO

通過DAF-FM DA試劑盒(碧云天)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的NO合成。將內(nèi)皮細(xì)胞在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后加入染色劑避光孵育30 min，通過CLSM觀察并獲取熒光照片。最后通過NIH ImageJ 1.45軟件對(duì)熒光強(qiáng)度定量分析。

1.2.3內(nèi)皮細(xì)胞成血管

使用ECMatrixTM(Millipore，美國(guó))進(jìn)行體外血管生成測(cè)定。將內(nèi)皮細(xì)胞(6×104cells/cm2)和條件培養(yǎng)基混合均勻后加入基質(zhì)膠中在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4、8、12和18 h.到達(dá)指定時(shí)間后，使用IRM每組隨機(jī)拍照6張以上圖像。最后用Photoshop CC 2015軟件對(duì)照片中出現(xiàn)的結(jié)、環(huán)和管的數(shù)量進(jìn)行定量分析。

1.2.4內(nèi)皮細(xì)胞遷移

使用劃痕法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。將內(nèi)皮細(xì)胞以4×104cells/cm2的密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2天。然后用移液器槍頭在24孔板底部劃出“十”字構(gòu)建傷口愈合模型。加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12和24 h后，通過IRM拍攝細(xì)胞遷移情況，并使用Photoshop CC 2015軟件定量分析。

1.3 衰老巨噬細(xì)胞免疫微環(huán)境對(duì)衰老干細(xì)胞的影響

在干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞增殖、形態(tài)和ROS與上文中實(shí)驗(yàn)方法一致。

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源于3周齡大鼠股骨和脛骨骨髓。本文中使用的干細(xì)胞為第2-4代。將干細(xì)胞在補(bǔ)充有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的α-MEM(Gibco)中培養(yǎng)，細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)過程中保存放置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。消化和培養(yǎng)方式與內(nèi)皮細(xì)胞相同。實(shí)驗(yàn)過程中所用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為在完全培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入10 mmol/L β-甘油磷酸鈉(Solarbio)、50 μg/mL抗壞血酸(Sigma)和10 nmol/L地塞米松(Sigma).

將干細(xì)胞以1×104cells/cm2密度接種培養(yǎng)24 h后更換含100 μmol/L的H2O2培養(yǎng)基刺激2 h，誘導(dǎo)干細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)。除非另有說明，否則在以下實(shí)驗(yàn)中接種的細(xì)胞密度均為1×104cells/cm2.

1.3.2干細(xì)胞膠原分泌

干細(xì)胞分泌I型膠原蛋白的定性和定量分析通過天狼星紅(Sigma)染色來評(píng)估。將干細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7和14天。所有樣品兩天更換一次培養(yǎng)基同時(shí)加入巨噬細(xì)胞上清，兩者比例為1∶1(體積比)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用4%多聚甲醛固定30 min后加入天狼星紅染色劑避光染色18 h，然后用醋酸(國(guó)藥)漂洗干凈，再利用體視顯微鏡觀察拍照獲取干細(xì)胞膠原分泌的定性結(jié)果。將孔板回收，并用由0.2 mmol/L NaOH(天津光復(fù))和甲醇(天津風(fēng)船化學(xué)試劑)1∶1(體積比)混合配制的洗脫液對(duì)膠原蛋白進(jìn)行洗脫。避光處理30 min，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.3.3干細(xì)胞基質(zhì)礦化

干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平通過茜素紅(Sigma)染色法來評(píng)估。將干細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14和21天。所有樣品兩天更換一次培養(yǎng)基，同時(shí)加入巨噬細(xì)胞上清，兩者比例為1∶1(體積比)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用75%乙醇(天津光復(fù))固定細(xì)胞1 h，然后加入茜素紅溶液避光染色30 min，用去離子水漂洗干凈后利用體視顯微鏡觀察拍照獲取干細(xì)胞礦化水平的定性結(jié)果。用10 mmol/L磷酸鈉洗脫液(含10%西吡氯銨(阿拉丁))對(duì)礦化產(chǎn)物進(jìn)行洗脫。室溫避光處理2 h后，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

1.4 鈦表面裝載辛伐他汀對(duì)衰老巨噬細(xì)胞的影響

1.4.1樣品制備

將鈦片用丙酮、乙醇和去離子水超聲10 min，然后用35%鹽酸(國(guó)藥)60 ℃下酸蝕35 min，再用去離子水超聲清洗10 min并烘干。用10 mmol/L Tris-buffer(生工)配制1 mg/mL的多巴胺(生工)溶液，并用NaOH調(diào)pH至8.5.將酸蝕后的樣品避光浸泡12 h，去離子水沖洗并干燥。

將2%殼聚糖(生工)和4%明膠(生工)加入1.5%醋酸溶液，55 ℃攪拌至完全溶解，加入交聯(lián)劑京尼平(阿拉丁)繼續(xù)攪拌1 h，然后混入不同量的辛伐他汀藥物震蕩攪拌均勻，最終濃度為0.1、1、10、100、1000 μmol/L，取100 μL混合藥物的水凝膠均勻涂覆在接好多巴胺的鈦片上，在37 ℃恒溫箱中靜置4 h，待其成為水凝膠膜結(jié)構(gòu)后用紫外線照射殺菌備用。

1.4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

在本實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞活死與上文中巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法一致。

1.5 組別說明

本文中所有組別名稱及處理歷史見表1.

表1 樣品組別說明Table 1 Group descriptions of samples

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均取自3個(gè)平行試樣，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式表達(dá)。利用IBM SPSS 14.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。所有圖中*表示p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，**表示p<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，***表示p<0.001為有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 衰老巨噬細(xì)胞對(duì)辛伐他汀的生物學(xué)響應(yīng)

圖1(a)為用于建立衰老巨噬細(xì)胞模型的增殖柱狀圖。正常細(xì)胞比衰老細(xì)胞對(duì)應(yīng)的吸光度值高12%左右。圖1(b)、(c)分別為正常和衰老巨噬細(xì)胞ROS熒光圖像。從圖中可以看出，衰老細(xì)胞比正常細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。圖1(d)、(e)分別為正常和衰老巨噬細(xì)胞的光學(xué)形貌圖?？梢钥闯?，衰老組細(xì)胞較正常組偏大。以上結(jié)果表明，衰老巨噬細(xì)胞模型已成功建立。

(a) 正常和衰老巨噬細(xì)胞增殖柱狀圖；(b) 正常巨噬細(xì)胞ROS染色圖像；(c) 衰老巨噬細(xì)胞ROS染色圖像；(d) 正常巨噬細(xì)胞光學(xué)形貌圖；(e) 衰老巨噬細(xì)胞光學(xué)形貌圖圖1 衰老巨噬細(xì)胞模型的建立Fig.1 Establishment of senescent model of macrophages

圖2為不同辛伐他汀濃度對(duì)巨噬細(xì)胞活力影響的熒光染色圖。其中，活細(xì)胞為綠色，死細(xì)胞為紅色。從圖中可以看出，正常細(xì)胞的活力和增殖均顯著高于衰老細(xì)胞。衰老細(xì)胞中，隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞活力和增殖逐漸改善，且在0.1 μmol/L時(shí)達(dá)到最大。更高的藥物濃度顯著抑制細(xì)胞的活力，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖2 巨噬細(xì)胞的活死染色圖像Fig.2 Live/dead staining images of macrophage

圖3為不同辛伐他汀濃度對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響。正常細(xì)胞的增殖速率顯著高于衰老細(xì)胞。低濃度藥物可以有效促進(jìn)衰老細(xì)胞增殖，當(dāng)藥物濃度為0.1 μmol/L時(shí)，衰老細(xì)胞活性顯著增加，但當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增加時(shí)，反而抑制細(xì)胞增殖。特別是10 μmol/L和100 μmol/L組，第2天的吸光度值顯著低于第1天，說明高濃度藥物刺激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖3 巨噬細(xì)胞MTT定量結(jié)果Fig.3 MTT quantitative results of macrophages

圖4為巨噬細(xì)胞在不同濃度的辛伐他汀刺激下的細(xì)胞骨架熒光染色圖片。一般情況下，M0表型巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)為經(jīng)典的圓形，M1表型巨噬細(xì)胞為有偽足的圓形，而M2表型巨噬細(xì)胞為梭形。從圖中可以看出，正常細(xì)胞和衰老細(xì)胞表現(xiàn)為圓形或星形。對(duì)于衰老細(xì)胞，低濃度藥物使細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為梭形，0.1 μmol/L組能觀察到細(xì)胞絲狀偽足，表明巨噬細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)良好且傾向于M2型極化。當(dāng)藥物濃度過高時(shí)，細(xì)胞又表現(xiàn)為圓形。

圖4 巨噬細(xì)胞的骨架熒光圖像Fig.4 Fluorescence images of macrophage cytoskeleton

圖5為不同辛伐他汀濃度對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS(綠色)水平影響的定性(a)和定量(b)圖。從圖中可以看出，低濃度藥物能夠減少巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，0.01 μmol/L組和0.1 μmol/L組對(duì)比衰老細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯降低，而當(dāng)藥物濃度繼續(xù)升高時(shí)，氧化應(yīng)激水平提高。

圖5 巨噬細(xì)胞ROS熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.5 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of macrophage ROS

圖6為巨噬細(xì)胞i-NOS(M1標(biāo)志物)免疫熒光染色圖像(a)及定量(b)結(jié)果。結(jié)果表明，衰老細(xì)胞高表達(dá)i-NOS(紅色)，因此為典型的M1型巨噬細(xì)胞。加入辛伐他汀后，i-NOS的表達(dá)不同程度地降低。隨著藥物濃度的增加，衰老巨噬細(xì)胞i-NOS表達(dá)強(qiáng)度先減少后增加，當(dāng)藥物濃度為0.1 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度最低，表明其極化為M1型的傾向最低。

圖6 巨噬細(xì)胞i-NOS熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.6 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of macrophage i-NOS

圖7為巨噬細(xì)胞在不同辛伐他汀濃度刺激下CD206(M2標(biāo)志物)的免疫熒光染色圖像(a)及定量(b)結(jié)果。所有組的巨噬細(xì)胞均表達(dá)CD206，但加入藥物之后，CD206的表達(dá)水平更高，表明其M2型極化趨勢(shì)更為明顯。隨著藥物濃度的增加，CD206的表達(dá)強(qiáng)度與i-NOS相反，當(dāng)藥物濃度達(dá)到0.1 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度最高。說明辛伐他汀能夠改變衰老巨噬細(xì)胞極性，使其從促炎的M1型向促組織愈合的M2型轉(zhuǎn)變。

圖7 巨噬細(xì)胞CD206熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.7 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of macrophage CD206

2.2 衰老內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞免疫微環(huán)境的生物學(xué)響應(yīng)

圖8(a)為正常和衰老內(nèi)皮細(xì)胞的增殖柱狀圖。正常細(xì)胞比衰老細(xì)胞的吸光度值高10%左右。圖8(b)、(c)分別為正常和衰老內(nèi)皮細(xì)胞的ROS熒光圖像。從圖中可以看出，衰老細(xì)胞的ROS水平顯著高于正常細(xì)胞。圖8(d)、(e)分別為正常和衰老內(nèi)皮細(xì)胞的光學(xué)形貌圖?？梢钥闯觯ダ辖M細(xì)胞較正常組偏大。以上結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞的衰老模型已成功建立。

(a) 正常和衰老內(nèi)皮細(xì)胞增殖柱狀圖；(b) 正常內(nèi)皮細(xì)胞ROS染色圖像；(c) 衰老內(nèi)皮細(xì)胞ROS染色圖像；(d) 正常內(nèi)皮細(xì)胞光學(xué)形貌圖；(e) 衰老內(nèi)皮細(xì)胞光學(xué)形貌圖圖8 內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型的建立Fig.8 Establishment of senescent model of endothelial cells

圖9為衰老內(nèi)皮細(xì)胞在衰老巨噬細(xì)胞上清液作用下的NO合成的定性(a)和定量(b)結(jié)果?？梢钥闯?，衰老內(nèi)皮細(xì)胞的NO熒光強(qiáng)度較低，而巨噬細(xì)胞上清液可上調(diào)衰老細(xì)胞的NO合成。定量結(jié)果表明，與其他組相比，CS-0.1組可顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO的合成。

圖9 內(nèi)皮細(xì)胞NO熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.9 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of NO secreted by endothelial cells

圖10為內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管定性(a)和定量(b-e)結(jié)果。從圖中可以看出，與衰老組和CS-0組相比，被藥物刺激過的巨噬細(xì)胞上清液與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞在4 h時(shí)就初步形成血管結(jié)點(diǎn)和小管，8～12 h時(shí)表現(xiàn)出更多節(jié)點(diǎn)的形成和更復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并且在12 h時(shí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變大，邊壁變厚。18 h時(shí)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)惡化，發(fā)生塌陷，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，只有CS-0.1組仍有少量血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和血管結(jié)點(diǎn)與小管。

圖10 內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管光學(xué)圖像(a)及定量結(jié)果(b-e)Fig.10 Optical images (a) and quantitative results (b-e) of in vitro angiogenesis of endothelial cells

圖11為內(nèi)皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞上清液共培養(yǎng)后的ROS定性熒光圖像(a)和定量(b)結(jié)果?？梢钥闯觯唇?jīng)處理的衰老細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度較高，加入未經(jīng)藥物刺激的衰老巨噬細(xì)胞上清液也沒有顯著性改善，但是辛伐他汀刺激的巨噬細(xì)胞上清液可以降低內(nèi)皮細(xì)胞ROS的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激，其中CS-0.1組效果最好。

圖11 內(nèi)皮細(xì)胞ROS熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.11 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of ROS produced by endothelial cells

圖12為內(nèi)皮細(xì)胞在巨噬細(xì)胞上清液作用下遷移能力的定性(a)和定量(b)結(jié)果。衰老組和CS-0組之間沒有顯著性差異，加入藥物刺激過的巨噬細(xì)胞上清液可以提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CS-0.1組相比較于其他組都表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。但當(dāng)藥物濃度過高時(shí)(CS-10組)，又表現(xiàn)出對(duì)遷移的抑制作用。

圖12 內(nèi)皮細(xì)胞遷移光學(xué)圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.12 Optical images (a) and quantitative results (b) of migration of endothelial cells

2.3 衰老干細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞免疫微環(huán)境的生物學(xué)響應(yīng)

圖13(a)為正常和衰老干細(xì)胞的增殖柱狀圖。正常細(xì)胞的吸光度值比衰老細(xì)胞高10%左右。圖13(b)、(c)為正常和衰老干細(xì)胞的ROS熒光圖像。從圖中可以看出，衰老干細(xì)胞的ROS熒光強(qiáng)度相較于正常干細(xì)胞明顯增強(qiáng)，說明氧化應(yīng)激水平提高。圖13(d)、(e)為正常和衰老干細(xì)胞的光學(xué)形貌圖。衰老之后的細(xì)胞明顯變大且表面粗糙有顆粒感，其中有一些細(xì)胞呈現(xiàn)未鋪展?fàn)顟B(tài)。以上結(jié)果表明，干細(xì)胞的衰老模型已成功建立。

(a) 正常和衰老干細(xì)胞增殖柱狀圖；(b) 正常干細(xì)胞ROS染色圖像；(c) 衰老干細(xì)胞ROS染色圖像；(d) 正常干細(xì)胞光學(xué)形貌圖；(e) 衰老干細(xì)胞光學(xué)形貌圖圖13 干細(xì)胞衰老模型的建立Fig.13 Establishment of senescent model of bone marrow mesenchymal stem cells

圖14為干細(xì)胞在巨噬細(xì)胞上清液作用下Ⅰ型膠原分泌的定性(a)和定量(b)結(jié)果。在第7天時(shí)，與衰老細(xì)胞相比，加入巨噬細(xì)胞上清液都能夠不同程度地促進(jìn)膠原分泌。其中，CS-0.001和CS-0.1組效果最佳，CS-0和CS-10組無顯著性差異。到第14天，加藥組之間沒有顯著性差異，CS-0.1組相比較于CS-0組有效促進(jìn)膠原分泌。

圖14 干細(xì)胞Ⅰ型膠原分泌定性圖像(a)和定量結(jié)果(b)Fig.14 Qualitative images (a) and quantitative results (b) of type Ⅰ collagen secreted by bone marrow mesenchymal stem cells

圖15為干細(xì)胞在巨噬細(xì)胞上清液作用下細(xì)胞外基質(zhì)礦化的定性圖像(a)和定量結(jié)果(b).從圖中可以看出，在第14天時(shí)，加入巨噬細(xì)胞上清液可以有效提高衰老干細(xì)胞的基質(zhì)礦化，其中CS-0和CS-0.001組間無顯著性差異，CS-10組相比較于其他上清液組表現(xiàn)出輕微的抑制，CS-0.1組表現(xiàn)最好。在第21天時(shí)，衰老組和CS-10組之間無顯著性差異，藥物濃度過高抑制干細(xì)胞的礦化，CS-0.001和CS-0.1表現(xiàn)最好，鈣沉積量最多。

圖15 干細(xì)胞基質(zhì)礦化定性圖像(a)和定量結(jié)果(b)Fig.15 Qualitative images (a) and quantitative results (b) of ECM mineralization of bone marrow mesenchymal stem cells

圖16為衰老干細(xì)胞的ROS定性熒光圖像(a)和定量結(jié)果(b)?？梢钥闯?，對(duì)比加入巨噬細(xì)胞上清液的組別，未加上清液的衰老干細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度較高，不同辛伐他汀濃度刺激后的巨噬細(xì)胞上清液組別對(duì)比CS-0組ROS水平顯著降低，其中CS-0.1組效果最好，熒光強(qiáng)度最低。

圖16 干細(xì)胞ROS熒光圖像(a)及定量結(jié)果(b)Fig.16 Fluorescence images (a) and quantitative results (b) of ROS produced by bone marrow mesenchymal stem cells

2.4 鈦表面裝載辛伐他汀對(duì)巨噬細(xì)胞的影響

圖17為巨噬細(xì)胞在試樣表面培養(yǎng)后的活死染色圖像。從圖中可以看出，各組均沒有死細(xì)胞(紅色)。在未經(jīng)處理的鈦片表面，和衰老細(xì)胞相比，正常細(xì)胞活細(xì)胞(綠色)數(shù)量多，單個(gè)細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度高，說明細(xì)胞活力好。用凝膠裝載藥物后，細(xì)胞數(shù)量有所減少，但隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，Gel-1組達(dá)到峰值。

圖17 巨噬細(xì)胞在試樣表面的活死染色圖像Fig.17 Live/dead staining images of macrophages cultured on sample surfaces

圖18為巨噬細(xì)胞在試樣表面培養(yǎng)后的MTT定量結(jié)果。從圖中可以看出，在未經(jīng)處理的鈦片表面，正常細(xì)胞和衰老細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖數(shù)量相差明顯，第1天數(shù)量相差10%左右，第2天相差一倍以上。鈦片表面負(fù)載藥物后，細(xì)胞數(shù)量有所減少，但隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞數(shù)量先增加后減少，到Gel-1達(dá)到峰值。培養(yǎng)2天后，未裝載藥物和裝載藥物的各組間沒有顯著性差異，說明裝載藥物促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖。

圖18 巨噬細(xì)胞在試樣表面的MTT定量結(jié)果Fig.18 MTT quantitative results of macrophages cultured on sample surfaces

3 討論

植入體表面巨噬細(xì)胞從M1型到M2型的及時(shí)轉(zhuǎn)變對(duì)于骨整合至關(guān)重要[19]。但是，對(duì)于老年人體內(nèi)的衰老巨噬細(xì)胞，內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致這種轉(zhuǎn)變的延遲，從而使炎癥階段延長(zhǎng)，無法順利過渡到修復(fù)階段，抑制骨整合的速度和質(zhì)量。本文表明，0.1 μmol/L的辛伐他汀可以恢復(fù)衰老巨噬細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而促進(jìn)其M1到M2表型的及時(shí)轉(zhuǎn)變，且這種轉(zhuǎn)變營(yíng)造的免疫微環(huán)境促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化和內(nèi)皮細(xì)胞的成血管分化，而成骨和成血管是植入體骨整合的兩個(gè)不可或缺的階段。除此之外，鈦表面裝載辛伐他汀表現(xiàn)出很好的細(xì)胞相容性并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，為之后進(jìn)一步探究植入體表面裝載藥物促進(jìn)骨整合提供了參考。

衰老巨噬細(xì)胞通常表現(xiàn)為促炎的M1表型，其向促愈合的M2表型的轉(zhuǎn)換比較困難，產(chǎn)生不利于骨再生和骨整合的促炎免疫環(huán)境[20]。造成這種現(xiàn)象的主要原因是自噬水平降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡[7]。因此，通過誘導(dǎo)自噬來恢復(fù)衰老巨噬細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)是一種很有前途的方法。本文使用一種臨床降血脂藥物辛伐他汀作為自噬誘導(dǎo)劑。發(fā)現(xiàn)0.1 μmol/L的濃度可促進(jìn)衰老巨噬細(xì)胞的活力、增殖和M2型極化，降低胞內(nèi)ROS水平?？梢酝茰y(cè)，辛伐他汀誘導(dǎo)的衰老巨噬細(xì)胞自噬在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

接下來，本文研究在辛伐他汀刺激下由衰老的巨噬細(xì)胞營(yíng)造的免疫微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。與巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基一起孵育后，干細(xì)胞的I型膠原蛋白分泌和細(xì)胞外基質(zhì)礦化上調(diào)。同時(shí)，條件培養(yǎng)基還能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、NO合成和血管生成能力。這些結(jié)果表明，辛伐他汀可以使衰老巨噬細(xì)胞營(yíng)造的促炎免疫微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)榇儆系拿庖呶h(huán)境，從而促進(jìn)成骨和成血管以及植入體骨整合。我們之前的工作表明，M2極化的巨噬細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如BMP-2、TGF-β1和VEGF[21-22]。BMP-2可以結(jié)合并激活干細(xì)胞膜上的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，隨后引發(fā)Smad1/5/8的募集和磷酸化。然后磷酸化的Smad1/5/8與Smad4結(jié)合形成異聚復(fù)合物并易位至細(xì)胞核中以觸發(fā)Dlx5及其下游RUNX2和Osx的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)干細(xì)胞的成骨分化[23]。TGF-β1也是一種成骨誘導(dǎo)劑，可上調(diào)具有PDZ結(jié)合基序(TAZ)的轉(zhuǎn)錄共激活因子在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。TAZ可以作為RUNX2的共激活劑來抑制PPARγ2的表達(dá)，從而抑制干細(xì)胞的成脂分化能力[24]。VEGF是一種有效的促血管生成的細(xì)胞因子，其主要通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGFR2結(jié)合，隨后激活多種下游信號(hào)通路發(fā)揮作用。其中，PLCy-PKC-Ras-Raf-MEK-ERK1/2通路可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，p38-MAPK和FAK-Paxillin通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，PI3K-Akt/PKB通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活，這些功能都對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成至關(guān)重要[25]。

最后，本研究在鈦表面構(gòu)建殼聚糖/明膠涂層成功實(shí)現(xiàn)辛伐他汀的裝載，殼聚糖/明膠涂層的厚度大約為20 μm，吸水溶脹后，涂層厚度可達(dá)到100 μm左右。關(guān)于辛伐他汀的釋放，首先應(yīng)為樣品表面辛伐他汀的溶解，之后由于凝膠吸水膨脹以及明膠的水解，更多的藥物逐漸暴露，進(jìn)行低劑量的持續(xù)釋放。由結(jié)果可知，藥物裝載量與衰老巨噬細(xì)胞的增殖和活力密切相關(guān)，說明該涂層可作為辛伐他汀的緩釋涂層，有望通過藥物的緩慢釋放介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞向M2型極化，營(yíng)造促進(jìn)組織修復(fù)的免疫微環(huán)境，促進(jìn)鈦植入體的骨整合。

4 結(jié)論

本文探究不同辛伐他汀濃度對(duì)衰老巨噬細(xì)胞功能的影響，并進(jìn)一步研究其營(yíng)造的免疫微環(huán)境對(duì)成骨和成血管功能的影響，以及鈦表面裝載辛伐他汀介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞功能的可行性，得出以下結(jié)論：

1) 當(dāng)辛伐他汀濃度低于0.1 μmol/L時(shí)，隨濃度的增加巨噬細(xì)胞的增殖和活力水平提高，氧化應(yīng)激水平降低，向促組織愈合的M2型極化，而濃度過高則誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。

2) 辛伐他汀可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞營(yíng)造有利于組織愈合的免疫微環(huán)境，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和內(nèi)皮細(xì)胞的成血管分化。

3) 鈦表面的殼聚糖/明膠復(fù)合涂層可作為辛伐他汀的載體，通過藥物的緩慢釋放介導(dǎo)衰老巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。