渤海沉積物中產(chǎn)甲烷途徑及產(chǎn)甲烷菌群落特征

許曉晴，陳燁，甄毓，米鐵柱，李晶，劉昌嶺

1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100

2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266237

3.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266100

4.中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所，青島 266237

甲烷是大氣中含量最豐富的碳?xì)浠衔?，可通過(guò)一系列復(fù)雜的氧化反應(yīng)影響大氣化學(xué)；同時(shí)，它也是重要的溫室氣體，100年內(nèi)溫室效應(yīng)是二氧化碳的28倍，對(duì)全球變暖起著重要作用[1-2]。地球上大部分甲烷來(lái)源于微生物產(chǎn)甲烷作用，即通過(guò)環(huán)境中有機(jī)質(zhì)厭氧發(fā)酵的最終途徑產(chǎn)生。微生物介導(dǎo)的甲烷生成是地球上最大的甲烷來(lái)源，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是碳匯和生態(tài)碳流動(dòng)的第一步。產(chǎn)甲烷菌廣泛分布于海洋沉積物、淡水沉積物、水稻田土壤、動(dòng)物胃腸道、地礦及地?zé)岘h(huán)境中[3-4]。目前已知的產(chǎn)甲烷菌屬于甲烷火球菌目（Methanopyrales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微球目（Methanomicrobiales）、甲烷胞菌目（Methanocellales）和馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）[5]。最新研究還發(fā)現(xiàn)韋斯特古菌門、深古菌門等部分成員中也具有產(chǎn)甲烷菌代謝途徑相關(guān)基因，推測(cè)也具有產(chǎn)甲烷能力[6-7]。自然界中能被產(chǎn)甲烷菌利用并產(chǎn)生甲烷的底物非常有限，僅包括甲酸鹽、乙酸鹽、甲基化合物（如甲胺、三甲胺、甲醇等）、CO2等幾種結(jié)構(gòu)十分簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)[8-9]。產(chǎn)甲烷途徑包括甲基營(yíng)養(yǎng)型、乙酸代謝型和H2/CO2還原型3種類型，而自然界中的甲烷主要來(lái)自于乙酸發(fā)酵途徑和H2/CO2還原途徑[10]。產(chǎn)甲烷菌種類不同，不同區(qū)域?qū)Φ孜锢玫念愋筒煌?，?dǎo)致產(chǎn)甲烷途徑有很大差別。

中國(guó)一些海域的產(chǎn)甲烷菌及產(chǎn)甲烷活性得到了充分研究并取得了相應(yīng)成果。Zhou等[11]發(fā)現(xiàn)南海北部產(chǎn)甲烷菌的主要類群為Methanomicrobiales、Methanosarcinales和Methanomassiliicoccus。陳金泉和王風(fēng)平[12]對(duì)珠江口沉積物的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)甲烷菌群落組成隨深度增加而變化，在甲烷-硫酸鹽過(guò)渡帶上方及下方區(qū)域產(chǎn)甲烷優(yōu)勢(shì)菌群不同，產(chǎn)甲烷途徑也不同，說(shuō)明受陸源影響的河口地區(qū)甲烷代謝途徑多樣，不同沉積物深度產(chǎn)甲烷代謝類型可能不同。李小飛等[13]采用室內(nèi)培養(yǎng)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，研究了長(zhǎng)江口沉積物中厭氧區(qū)和富氧區(qū)產(chǎn)甲烷潛力及產(chǎn)甲烷菌群落組成特征，發(fā)現(xiàn)甲烷排放速率、甲烷產(chǎn)生潛力、產(chǎn)甲烷群落結(jié)構(gòu)在厭氧區(qū)和富氧區(qū)沉積物中有明顯差異，其中，厭氧區(qū)沉積物中產(chǎn)甲烷菌的優(yōu)勢(shì)群落為Methanococcoides、Methanosarcina和Methanosaeta，富氧區(qū)沉積物中則以Methanosarcina、Methanosaeta和Methanocella為主。

渤海屬中國(guó)內(nèi)海，與其他海域相比具有半封閉性、海床淺等特征，受各種人為活動(dòng)影響較大，是國(guó)內(nèi)眾多海域中污染狀況相對(duì)較重的海域[14-15]。同時(shí)，多條內(nèi)陸河流匯集于此，相對(duì)于其他海域河流陸源性輸入更為突出，河口地區(qū)缺氧或富營(yíng)養(yǎng)化等造成生化因子發(fā)生明顯改變，影響甲烷代謝循環(huán)過(guò)程[16]。在該海域所有入海河流中，黃河徑流量最大，泥沙最豐富，向渤海輸入了大量泥沙和有機(jī)質(zhì)。但黃河輸入物質(zhì)中大部分在河口區(qū)沉積，僅小部分進(jìn)行離岸輸運(yùn)，進(jìn)入黃海[17]。研究表明，不同海域沉積物中產(chǎn)甲烷菌群落特征存在差異，而有機(jī)質(zhì)、硫酸鹽含量、甲烷濃度等環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)及產(chǎn)甲烷活性影響較大[13,18]。此外，以往對(duì)渤海研究多集中于沉積物微生物多樣性和溢油的微生物降解等方面，對(duì)渤海尤其是沉積物中產(chǎn)甲烷微生物研究較少。因此，分析比較渤海黃河近岸區(qū)域與離岸區(qū)域沉積物的產(chǎn)甲烷潛力與產(chǎn)甲烷菌群落特征具有重要意義[19-20]。

本文采集渤海典型站位沉積物樣品，通過(guò)提供不同類型產(chǎn)甲烷底物進(jìn)行培養(yǎng)，分析各樣品中甲烷產(chǎn)量及產(chǎn)甲烷菌群落特征，綜合評(píng)價(jià)沉積物中甲烷產(chǎn)生途徑及產(chǎn)甲烷菌的群落多樣性。研究結(jié)果將為深入了解渤海沉積物中微生物產(chǎn)甲烷途徑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2019年6月搭乘“中漁科102”號(hào)調(diào)查船對(duì)渤海海域進(jìn)行調(diào)查，使用箱式采泥器采集M1站位和M7站位沉積物，再使用PVC管進(jìn)行柱狀樣采集，每個(gè)站位各取4個(gè)平行樣。M1站位（38°13'95''N,119°2'55''E）位于黃河入海口附近，水動(dòng)力作用豐富，受陸源輸入影響較大，M7站位（39°32'12''N,120°28'07''E）位于渤海中部泥質(zhì)沉積區(qū)（圖1），水動(dòng)力相對(duì)較弱，受陸源影響較小，是渤海的低速沉積區(qū)域，2個(gè)站位地理位置在渤海中具有代表性[21]。M1站位柱狀沉積物長(zhǎng)約30 cm，M7站位柱狀沉積物長(zhǎng)約40 cm。本實(shí)驗(yàn)選取M1站位2～6 cm、20～24 cm和M7站位2～6 cm、20～24 cm、32～36 cm，即淺層、中層、深層沉積物作為目標(biāo)層次進(jìn)行后續(xù)分析培養(yǎng)工作，以便獲得不同層次沉積物中較完整的產(chǎn)甲烷菌群落特征與產(chǎn)甲烷規(guī)律。所取4個(gè)平行樣中，一個(gè)采用無(wú)菌注射器分別取目標(biāo)層次沉積物3 mL，并注入裝有6% NaOH溶液的頂空瓶中用于甲烷測(cè)定；一個(gè)采用Rhizon采樣器取目標(biāo)層次間隙水，于-20℃冰箱凍存，用于測(cè)定硫酸根離子含量；一個(gè)在4℃環(huán)境下保存用于產(chǎn)甲烷活性培養(yǎng)；另一個(gè)置于-20℃冰箱凍存，用于微生物總DNA提取和高通量測(cè)序。

圖1 渤海沉積物樣品采集位點(diǎn)Fig.1 Sampling location in the Bohai Sea

1.2 沉積物中甲烷、硫酸鹽以及總有機(jī)碳分析

甲烷作為微生物產(chǎn)甲烷作用的產(chǎn)物，對(duì)評(píng)價(jià)原位產(chǎn)甲烷作用有重要意義，而硫酸鹽、總有機(jī)碳（total organic carbon, TOC）對(duì)產(chǎn)甲烷菌群落組成與原位產(chǎn)甲烷活性有重要影響，為分析其相互關(guān)系，對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。沉積物中的甲烷含量采用靜態(tài)頂空法[22]進(jìn)行測(cè)定：首先，將裝有沉積物的樣品瓶劇烈震蕩，再充分靜置，使液相與氣相之間的甲烷達(dá)到平衡后，取5 mL頂空氣體注入氣相色譜儀（7890B，安捷倫）進(jìn)行甲烷測(cè)定。使用FID氫火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣口設(shè)定溫度為100 ℃，檢測(cè)器溫度為175 ℃，分離柱溫度為50 ℃，載氣為高純氮?dú)?。間隙水中SO42-含量利用離子色譜（ICS-3000, Diones）進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)方式為電導(dǎo)檢測(cè)，進(jìn)樣量為1 mL，柱溫為30 ℃，檢測(cè)池溫度為35 ℃，淋洗液流速為 1.2 mL/min（陰離子）、1.0 mL/min（陽(yáng)離子），抑制電流為 90 mA（陰離子）、69 mA（陽(yáng)離子）。將沉積物樣品凍干后研磨，稱取30 mg置于銀舟中用Milli-Q水濕潤(rùn)，采用鹽酸熏蒸法去除碳酸鹽，然后將樣品放入烘箱加熱烘干，接著使用元素分析儀（FLASH 2000, Thermo Fish Scientific Inc.）對(duì)沉積物中TOC進(jìn)行測(cè)定[23]。

1.3 產(chǎn)甲烷培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

由于硫酸鹽促進(jìn)硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria, SRB）生長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)甲烷菌生長(zhǎng)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，同時(shí)也有可能發(fā)生甲烷厭氧氧化消耗甲烷，所以在產(chǎn)甲烷活性培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，用去離子水配置不含硫酸鹽的人工培養(yǎng)基（表1）[24]。配置培養(yǎng)基并滅菌后加入微量元素溶液[25]（1 mL L-1）及維生素液[26]（1 mL L-1）。再以高純氮?dú)猓?9.999%）進(jìn)行通氣置換氧氣等氣體后，置于厭氧培養(yǎng)箱（YQX-Ⅱ，上海星巴儀器設(shè)備有限公司）中。培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)加入還原劑L-半胱氨酸鹽（20 mg L-1）和刃天青顯色劑（1 mL L-1）還原并指示環(huán)境的厭氧狀態(tài)。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Composition of the medium

之后，將4℃環(huán)境下保存的沉積物樣品按1∶1比例與培養(yǎng)液混合，轉(zhuǎn)移至120 mL培養(yǎng)瓶中，加入不同底物后，用丁基膠塞和鋁蓋密封。然后將培養(yǎng)瓶移出厭氧培養(yǎng)箱，在原位溫度下（10 ℃）避光靜置培養(yǎng)。設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組分別添加H2/CO2（H2∶CO2為8∶2）、20 mmol甲醇、20 mmol一甲胺、20 mmol三甲胺、20 mmol乙酸鈉、10 mmol 2-溴乙烷磺酸鹽（2-bromoethane sulphonate, BES）以測(cè)定不同底物對(duì)厭氧產(chǎn)甲烷的影響，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行樣。BES是一種甲烷生成的末端抑制劑，以將微生物甲烷生成與物理解吸區(qū)分開來(lái)[27]。

采用氣相色譜儀（SP-3420A，北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司）測(cè)定甲烷產(chǎn)量。使用FID氫火焰離子化檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣口設(shè)定溫度100℃，單次進(jìn)樣 50 μL，檢測(cè)器溫度 150℃，分離柱為50℃，載氣為氦氣（UHP, 99.999%）。檢測(cè)結(jié)果單位為%（v/v），通過(guò)理想氣體狀態(tài)方程得到某一時(shí)刻每克沉積物（干重）所產(chǎn)生的甲烷量（μmol）。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)某時(shí)刻甲烷產(chǎn)生量計(jì)算公式為：

式中，CH為培養(yǎng)瓶上層氣體中甲烷測(cè)定濃度，μL L-1；VH為上層氣體體積，L。

1.4 DNA提取和高通量測(cè)序

取0.25～0.5 g沉積物，使用PowerSoil DNA Isolation Kit（Mo Bio, 美國(guó)）試劑盒按照手冊(cè)提供的操作步驟提取樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量。使用添加Barcode序列的引物A519F（5'-CAGCCGCCGCGGTAA）和A915R（5'-GTGCTCC CCCGCCAATTCCT）對(duì)古菌 16S rRNA基因V4-V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和Illumina高通量測(cè)序。測(cè)序于Illumina Miseq PE300平臺(tái)（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）完成。

在攝影領(lǐng)域，我為越南多樣的文化和多彩的風(fēng)光感到驚訝。整個(gè)國(guó)家仿佛是露天攝影棚，人們喜歡攝影。無(wú)論你是風(fēng)光攝影師、街頭攝影師，還是肖像和人文攝影師，這里都是一個(gè)絕佳的拍攝地。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Fastp和FLASH軟件對(duì)Miseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置50 bp的窗口，將尾部質(zhì)量值20以下的堿基序列過(guò)濾。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后的序列進(jìn)行雙端序列拼接（最小重疊堿基長(zhǎng)度為10 bp，且最大錯(cuò)配比例為0.2），并篩除不符合序列。根據(jù)序列首尾Barcode和引物區(qū)分樣品，同時(shí)調(diào)整序列方向。通過(guò)Uparse軟件平臺(tái)按照97%相似性對(duì)所得非重復(fù)序列（不包括單序列）進(jìn)行OTU聚類分析。通過(guò)與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132,http://www.arb-silva.de）進(jìn)行比對(duì)，得到樣本群落物種組成信息。采用Origin 2018軟件繪制甲烷產(chǎn)量圖、產(chǎn)甲烷速率圖及古菌、產(chǎn)甲烷菌豐度圖。本研究基因序列上傳至NCBI Sequence Read Archive數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：PRJNA715082）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物中甲烷、硫酸鹽及總有機(jī)碳含量

沉積物中甲烷、硫酸鹽濃度以及TOC含量如圖2所示。M1站位中，20～24 cm甲烷濃度略低于2～6 cm；在M7站位中，隨著深度的增加，甲烷濃度呈明顯的升高趨勢(shì)。兩站位沉積物硫酸鹽濃度較穩(wěn)定，均略高于海水平均值（28 mmol L-1[28]），隨深度無(wú)明顯變化趨勢(shì)。M7站位TOC含量明顯高于M1站位。

圖2 甲烷、硫酸鹽濃度和TOC含量Fig.2 Methane and sulfate and TOC contents

2.2 古菌群落特征

2.2.1 古菌群落多樣性分析

利用高通量測(cè)序共得到114 755條古菌16S rRNA基因有效序列，每個(gè)樣本序列條數(shù)為13 657～31 748。按97%序列相似性界定OTU，共獲得1 105個(gè)OTU，每個(gè)樣品的OTU為428～741（表2）。群落覆蓋度為＞99%，說(shuō)明測(cè)序深度足以覆蓋樣品中絕大多數(shù)物種信息。M7站位古菌豐富度指數(shù)（Chao1）高于M1站位，說(shuō)明M7站位較M1站位有更多的古菌種類。在5個(gè)沉積物樣品中，M7 2～6 cm沉積物Shannon指數(shù)最低且Simpson指數(shù)最高，說(shuō)明M7 2～6 cm群落多樣性最低。除M7 2～6 cm外，M7站位其他樣品的Shannon指數(shù)均高于M1，且Simpson指數(shù)均低于M1，證明M7站位其他層的群落多樣性高于M1站位。同時(shí)，在M1和M7中，Shannon指數(shù)隨深度逐漸增加，即古菌群落多樣性隨沉積物深度增加而增高。

表2 古菌群落多樣性特征Table 2 Diversity characteristics of archaea community

測(cè)定到的古菌屬于11個(gè)門，其中泉古菌門（Crenarchaeota）、阿斯加德古菌（Asgardaeota）和納古菌門（Nanoarchaeota）為優(yōu)勢(shì)古菌。古菌在綱分類水平上的群落組成見圖3。M1站2～6 cm和20～24 cm優(yōu)勢(shì)古菌均為深古菌綱（Bathyarchaeia）（相對(duì)豐度分別為42.7%和53.4%），M7站2～6 cm優(yōu)勢(shì)古菌為 Nitrososphaeria綱（相對(duì)豐度 57.1%），而20～24 cm和32～36 cm優(yōu)勢(shì)古菌均為深古菌綱（Bathyarchaeia）（相對(duì)豐度分別為53.2%和58.9%）。在兩個(gè)站位中，隨著沉積物深度增加，Bathyarchaeia和 Lokiarchaeia豐度增加，而 Nitrososphaeria和Nanoarchaeia豐度逐漸減小。

圖3 沉積物中綱分類水平上古菌的相對(duì)豐度（相對(duì)豐度＞1%）Fig.3 Relative abundance of the archaea at class level in the sediments of Bohai Sea (relative abundance ＞1%)

2.2.2 產(chǎn)甲烷菌群落特征

沉積物中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)組成在屬和目的分類水平上的相對(duì)豐度見圖4。所獲得產(chǎn)甲烷菌屬于Ca.Methanofastidiosales、甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）、甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷微球目（Methanomicrobiales）和馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）。包括以下屬：甲烷擬球菌屬-（Methanococcoides）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium）、馬賽甲烷球菌屬（Methanomassiliicoccus）及Candiadatus Syntrophoarchaeum。其中，Methanococcoides以甲基物質(zhì)為底物，Methanosarcina以乙酸、甲基物質(zhì)和H2/CO2為底物，Methanobacterium、Methanobrevibacter、Methanogenium以H2/CO2為底物產(chǎn)甲烷，而Methanomassiliicoccus則利用H2還原甲基類化合物產(chǎn)甲烷[13,29-30]。

圖4 沉積物中目、屬分類水平上產(chǎn)甲烷菌的序列條數(shù)加粗字體為目名，其余為屬名，相同底紋表示同一目分類。Fig.4 The number of sequences of methanogens at levels of order and genus in sediments of Bohai SeaBold font is the order name, and the rest is the genus name.Every shading indicates the same order classification.

在所有樣品中Ca.Methanofastidiosales產(chǎn)甲烷菌均為主要優(yōu)勢(shì)群落，尤其是在M7 2～6 cm樣品中。同時(shí)，甲烷八疊球菌目（Methanosarciniales）為M7 2～6 cm外其他樣品的優(yōu)勢(shì)菌。樣品M1 20～24 cm中，甲烷桿菌目（Methanobacteriales）是重要的產(chǎn)甲烷菌目。而甲烷微球目（Methanomicrobiales）只在M7 20～24 cm樣品中獲得，馬賽甲烷球菌目（Methanomassiliicoccales）只在M1的2～6 cm和20～24 cm層樣品中獲得。

此外，在M1 2～6 cm沉積物中，還存在以乙酸、甲基物質(zhì)和H2/CO2為底物的Methanosarcina，以H2/CO2為底物的Methanobrevibacter；在M1 20～24 cm沉積物中，也存在Methanosarcina和以H2/CO2為底物的Methanobacterium、Methanobrevibacter，同時(shí)還存在Methanomassiliicoccus及利用甲基物產(chǎn)甲烷的Methanococcoides[9,31-32]。M7 2～6 cm沉積物僅含Ca.Methanofastidiosales；在M7 20～24 cm樣品中包括：Methanococcoides、Methanosarcina、Methanobacterium、Methanogenium和Candidatus Syntrophoarchaeum；M7 32～36 cm包括Methanococcoides、Methanobacterium。

2.3 沉積物產(chǎn)甲烷活性

沉積物樣品在不同底物下甲烷產(chǎn)量如圖5所示。在添加BES和乙酸鈉后，所有樣品均不產(chǎn)生甲烷，而在其他底物下有明顯產(chǎn)甲烷現(xiàn)象。其中，沉積物樣品均在以非競(jìng)爭(zhēng)性底物（三甲胺、一甲胺、甲醇）下優(yōu)先產(chǎn)生甲烷，并很快達(dá)到最大產(chǎn)量，H2/CO2底物組則在培養(yǎng)后期開始有少量甲烷產(chǎn)生。此外，樣品中同一站位不同深度沉積物最大產(chǎn)甲烷量隨深度遞減，而同一深度中M7站最大甲烷產(chǎn)量高于M1站。

圖5 渤海沉積物樣品在不同底物厭氧培養(yǎng)過(guò)程中甲烷產(chǎn)量Fig.5 Methane production in the sediments from the Bohai Sea during the anaerobic incubation with different substrates

樣品在不同底物下的平均產(chǎn)甲烷速率采用最大甲烷產(chǎn)量除以其達(dá)到最大產(chǎn)量所消耗時(shí)間來(lái)計(jì)算（圖6）。在M1和M7站中，以三甲胺為底物時(shí)產(chǎn)甲烷速率最高，接著是一甲胺和甲醇，H2/CO2底物組則最低，而乙酸鈉底物組不產(chǎn)甲烷。同等深度同一底物供給下，M7站沉積物產(chǎn)甲烷速率高于M1站；添加相同底物時(shí)，兩站位產(chǎn)甲烷速率隨沉積物深度增加而降低，以三甲胺為底物時(shí)最明顯，其中M1站降低了33.23%，M7站則依次降低了27.01%和29.48%。

圖6 渤海沉積物中添加不同底物的厭氧產(chǎn)甲烷速率Fig.6 Methane production rate in the sediments from the Bohai Sea during the anaerobic incubation with different substrates

2.4 產(chǎn)甲烷活性與產(chǎn)甲烷菌的相互關(guān)系

將環(huán)境樣本所測(cè)得的不同產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度與產(chǎn)甲烷速率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，原位沉積物中未檢測(cè)到乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，這一結(jié)果與產(chǎn)甲烷培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中乙酸鈉底物組無(wú)甲烷產(chǎn)生相一致；其他不同途徑產(chǎn)甲烷菌豐度與產(chǎn)甲烷速率一致性不顯著（圖7）。在M1站位中，20～24 cm樣品所檢測(cè)到的甲基營(yíng)養(yǎng)型及H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度均高于2～6 cm樣品，但是該層沉積物以三甲胺、一甲胺、甲醇及H2/CO2為底物時(shí)，產(chǎn)甲烷速率均低于2～6 cm沉積物。在M7站位中，2～6 cm沉積物中未檢測(cè)到氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，但是該層沉積物在添加H2/CO2時(shí)產(chǎn)甲烷速率明顯高于20～24 cm及32～36 cm沉積物。

圖7 產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度及產(chǎn)甲烷速率Fig.7 Relative abundance of methanogens and methane production rates

3 討論

3.1 甲烷產(chǎn)生底物

底物影響產(chǎn)甲烷途徑和產(chǎn)甲烷潛力，不同底物可以導(dǎo)致不同的產(chǎn)甲烷菌活性和甲烷產(chǎn)生途徑[5,33]。在產(chǎn)甲烷厭氧培養(yǎng)過(guò)程中以H2/CO2、甲醇、一甲胺、三甲胺、乙酸鈉和BES為底物的不同實(shí)驗(yàn)組中，產(chǎn)甲烷規(guī)律表現(xiàn)出一定的差異：①同一站位同一底物下甲烷產(chǎn)生量隨深度增加而降低。Zeleke等[34]對(duì)長(zhǎng)江口泥灘沉積物中產(chǎn)甲烷菌分布特征進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)表層沉積物中產(chǎn)甲烷菌具有更高的豐富度。因此猜測(cè)原位環(huán)境中表層沉積物富含大量有機(jī)質(zhì)，為產(chǎn)甲烷微生物提供了充足的底物，致使上層沉積物具有更大的產(chǎn)甲烷活性。②添加產(chǎn)甲烷菌能夠利用的小分子物質(zhì)，經(jīng)厭氧培養(yǎng)后可產(chǎn)生甲烷，同一樣品，添加不同底物后甲烷產(chǎn)生量不同，以甲基類化合物為底物時(shí)甲烷生成量較高，而以H2/CO2為底物時(shí)生成量較低，添加乙酸鈉底物的樣品和添加BES的樣品經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后均沒有甲烷的生成。表明甲烷的產(chǎn)生是微生物發(fā)揮作用的結(jié)果，而充足的底物是甲烷產(chǎn)生的重要條件，乙酸鈉底物組自身形成空白對(duì)照，證明原位沉積物中有機(jī)質(zhì)未對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有任何影響。由于三甲胺分子所含甲基數(shù)量為一甲胺與甲醇的3倍，因此，其產(chǎn)甲烷速率同樣約為二者的3倍，而一甲胺與甲醇在產(chǎn)甲烷速率上沒有較大差異?？傮w而言，甲基類物質(zhì)為底物時(shí)產(chǎn)甲烷活性明顯大于以H2/CO2為底物，這一點(diǎn)在其他學(xué)者的研究中也有所體現(xiàn)。Zhuang等[35-36]研究發(fā)現(xiàn)，在甲基類物質(zhì)（一甲胺、三甲胺、甲醇等）濃度很低的原位環(huán)境中，產(chǎn)甲烷菌依舊可以利用其產(chǎn)生甲烷。Summons[37]也發(fā)現(xiàn)，在自然界高鹽環(huán)境中，主要以代謝甲基類化合物（一甲胺、三甲胺、甲醇等）產(chǎn)甲烷。

底物通過(guò)改變產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)影響產(chǎn)甲烷活性的發(fā)揮，而不改變沉積物的原有產(chǎn)甲烷途徑。同時(shí)，高通量測(cè)序結(jié)果證明，兩站位沉積物樣品中只存在甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌和H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌。因此，根據(jù)以上培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)與微生物測(cè)序結(jié)果得出結(jié)論，兩站位沉積物中產(chǎn)甲烷途徑以甲基營(yíng)養(yǎng)型為主，同時(shí)含有H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷。

3.2 硫酸鹽濃度

在硫酸鹽含量較高（＞1 mmol L-1）的海洋沉積物環(huán)境中，硫酸鹽還原菌在與產(chǎn)甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)共同底物（乙酸鹽和H2）過(guò)程中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，因此產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)甲烷過(guò)程受到一定限制，而甲胺、甲醇為非競(jìng)爭(zhēng)性底物，可以被產(chǎn)甲烷菌迅速利用并產(chǎn)生甲烷[38-39]。本研究所測(cè)得間隙水硫酸鹽含量均高于海水平均濃度（28 mmol L-1），因此在原位環(huán)境中，甲基型產(chǎn)甲烷菌占優(yōu)勢(shì)地位，但因?yàn)镾RB很難完全限制產(chǎn)甲烷菌對(duì)H2的利用，因此，沉積物中仍含有較少量的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。在培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，環(huán)境中硫酸鹽被大量消耗，H2/CO2型產(chǎn)甲烷菌豐度隨間隙水中硫酸鹽濃度減小而增加，從而產(chǎn)生甲烷[40-42]。

這一結(jié)論在其他學(xué)者的研究中也有發(fā)現(xiàn)。在對(duì)地中海西部三角洲表層和次表層沉積物中不同基質(zhì)和產(chǎn)甲烷途徑下產(chǎn)甲烷作用的分析中，研究者發(fā)現(xiàn)在最頂部的表層沉積物中，還原甲醇產(chǎn)甲烷作用占甲烷總產(chǎn)量的98%，而在貧硫酸鹽區(qū)，H2/CO2還原產(chǎn)甲烷則是主要途徑，且對(duì)mcrA功能基因測(cè)序分析表明，產(chǎn)甲烷菌群落組成與不同底物下產(chǎn)甲烷活性分布基本一致[43]。而對(duì)墨西哥灣北部Orca盆地高鹽沉積物的研究表明，非競(jìng)爭(zhēng)性甲基化合物（甲醇、三甲胺、二甲基硫醚、二甲基磺酸鹽）底物是生成甲烷的主要途徑，氫營(yíng)養(yǎng)型和乙酸還原型產(chǎn)甲烷途徑則受到了硫酸鹽的限制[35]。

3.3 原位TOC含量與甲烷含量

海洋生態(tài)環(huán)境中，絕大部分甲烷來(lái)源于產(chǎn)甲烷菌對(duì)有機(jī)質(zhì)的厭氧降解，因此，原位沉積物中有機(jī)質(zhì)含量對(duì)產(chǎn)甲烷活性具有重要作用。與多數(shù)研究相反，離岸海域M7站位整體TOC含量大于近岸海域M1站位，這與高立蒙[44]得出的結(jié)論相同。根據(jù)沉積物粒徑和密度分級(jí)，在陸源有機(jī)碳散布與沉積過(guò)程中，水動(dòng)力分選作用發(fā)揮了重要作用[45-46]。在M7站位所處的渤海中部地區(qū)，水動(dòng)力較弱且為旋轉(zhuǎn)流，細(xì)顆粒不斷進(jìn)行沉積，形成渤海中部泥質(zhì)沉積區(qū)。在水動(dòng)力分選作用下，有機(jī)碳賦存于細(xì)顆粒物并沉積，因此有機(jī)質(zhì)含量較高。相反，在M1站位，雖鄰近黃河口，但TOC含量低于M7站，原因可能為黃河懸浮顆粒物中約90%以上來(lái)源于黃土高原，有機(jī)碳本身含量較低（0.2%～0.8%）[47-48]。M7站有機(jī)質(zhì)含量豐富，大分子有機(jī)物不斷分解，為產(chǎn)甲烷菌提供充足的底物。因此，M7站產(chǎn)甲烷菌適應(yīng)性與活性相比于M1站更強(qiáng)，代謝速率更快，具有更大的產(chǎn)甲烷速率與甲烷產(chǎn)量。這也為之后的研究提供思考，即不能簡(jiǎn)單地憑借是否近岸，是否有類似黃河徑流等大量陸源物質(zhì)輸入而判斷站位的有機(jī)質(zhì)含量與相關(guān)微生物的代謝速率。

M7站位較M1站位TOC含量更高，產(chǎn)甲烷菌可利用更多底物進(jìn)行產(chǎn)甲烷活動(dòng)，因此，間隙水甲烷含量更高。由于采集樣品時(shí)間臨近夏季，黃河徑流量較大，近黃河口地區(qū)水動(dòng)力作用活躍，沉積環(huán)境不穩(wěn)定，因此，M1站位甲烷含量沒有體現(xiàn)較大差別。M7站沉積物間隙水甲烷含量隨深度增加有升高趨勢(shì)，這在其他較多研究中都有體現(xiàn)。吳自軍[49]對(duì)珠江口及其臨近海域沉積物間隙水甲烷進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)甲烷濃度在沉積物上部較低且變化幅度小，且隨深度遞增而增加，接近硫酸鹽還原帶底部時(shí)，甲烷含量急劇增大。臧昆鵬[50]對(duì)渤海耗氧海域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)表層沉積物中甲烷含量較低，向深層波動(dòng)上升。分析其原因，環(huán)境中甲烷含量是產(chǎn)甲烷與甲烷氧化共同作用的結(jié)果，除沉積物層外，底層海水是溶解甲烷的匯之一，表層沉積物中的甲烷部分?jǐn)U散至底層海水并被微生物氧化消耗?？赡芤?yàn)镸7站較高的有機(jī)質(zhì)輸入量和較大的沉積速率，限制了微生物對(duì)表層沉積物中有機(jī)質(zhì)的降解，因此部分表層有機(jī)質(zhì)未被分解而被直接埋藏，為深層沉積物環(huán)境產(chǎn)甲烷提供豐富碳源[49]。

3.4 古菌與產(chǎn)甲烷菌

古菌在深層沉積物的生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用，在兩站位沉積物中具有明顯的垂向分布特征。在本研究中，深古菌綱（Bathyarchaeia）為主要優(yōu)勢(shì)古菌。Bathyarchaeia為沉積物中最主要的古菌類群，廣泛分布于深海沉積物、近海沉積物、濱海濕地等各種環(huán)境中[51-53]。在沉積物有機(jī)碳再礦化過(guò)程中，易降解的有機(jī)碳被微生物優(yōu)先利用，難降解的有機(jī)碳不斷被埋藏，而Bathyarchaeia和Lokiarchaeia在埋藏有機(jī)碳的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[54-55]，因此，隨著沉積物深度增加，相對(duì)豐度增加，不斷進(jìn)行代謝，為深層沉積物中產(chǎn)甲烷作用提供底物，在產(chǎn)甲烷環(huán)境中扮演著重要角色。

甲烷的產(chǎn)生與產(chǎn)甲烷菌群落組成密切相關(guān)[5]。產(chǎn)甲烷菌是嚴(yán)格厭氧的古菌，只能利用簡(jiǎn)單化合物生成甲烷，部分產(chǎn)甲烷菌可以同時(shí)利用多種底物產(chǎn)甲烷[56-57]。本研究測(cè)序結(jié)果顯示，Ca.Methanofastidiosales是沉積樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的產(chǎn)甲烷菌，該類群能夠以甲基類化合物為底物產(chǎn)生甲烷，屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[58-59]。這類產(chǎn)甲烷菌很少以優(yōu)勢(shì)菌出現(xiàn)在以往的研究中，是同其他區(qū)域研究結(jié)果明顯不同之處[60-61]。對(duì)原位沉積物的高通量測(cè)序結(jié)果顯示，不同樣品中產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)不同，優(yōu)勢(shì)群落利用底物存在差別，因此具有不同的產(chǎn)甲烷活性。

根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，M1站位中存在Methanomassiliicoccales，而M7站位不存在。Methanomassiliicoccales是2012年在人類糞便中新分離出來(lái)的產(chǎn)甲烷菌，被列為產(chǎn)甲烷菌的第七個(gè)目[62]。目前，全球?qū)ethanomassiliicoccales的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較少，且多集中在陸地濕地、人和動(dòng)物的胃腸道中，部分海洋沉積物中也有發(fā)現(xiàn)[63-64]。Cozannet[65]對(duì)全球86個(gè)樣品（包括海洋沉積物、深海熱液噴口、海底泥火山、泥炭土壤、湖泊、溫泉、河流沉積物等）進(jìn)行高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，只有22個(gè)樣品中檢測(cè)出了Methanomassiliicoccales。M1站位于黃河入?？诟浇?，且采樣時(shí)間為夏季，黃河徑流量較大，因此考慮為黃河徑流將其帶入。Methanogenium為海洋油氣田沉積物的主要優(yōu)勢(shì)菌屬，且推測(cè)與油氣田形成有關(guān)[18]，在甲烷含量較低的M1站中未檢出。除共同優(yōu)勢(shì)菌屬Ca.Methanofastidiosales外，M1站位和M7站位的第2大主要優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌屬分別為Methanosarcina和Methanococcoides。其中，Methanosarcina是黃河中主要優(yōu)勢(shì)菌屬，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性，是濱海地區(qū)重要的產(chǎn)甲烷菌并廣泛參與碳循環(huán)，因此推測(cè)其由黃河徑流輸入M1站；而Methanococcoides是渤海原有的產(chǎn)甲烷菌，受黃河入海影響較小，在M7站位保持其優(yōu)勢(shì)菌屬地位[4]。

3.5 產(chǎn)甲烷菌與產(chǎn)甲烷活性的相關(guān)性

產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷速率與高通量測(cè)序結(jié)果不具有明顯的相關(guān)性。尤其在M7站2～6 cm沉積物中沒有檢測(cè)到H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌，但是在以H2/CO2為底物時(shí)，該層沉積物相對(duì)于同站位其他層次沉積物卻具有更大的甲烷生成量。推測(cè)產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因?yàn)椋罕狙芯酷槍?duì)古菌的16S rRNA基因進(jìn)行高通量測(cè)序，而原始樣品中產(chǎn)甲烷功能菌群落豐度本身較小，且因?yàn)檩^高的硫酸鹽含量，原位環(huán)境中H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌較少，從而沒有被檢測(cè)出來(lái)。但是H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷菌在培養(yǎng)過(guò)程中豐度逐漸增大，產(chǎn)甲烷作用不斷增強(qiáng)，在培養(yǎng)后期獲得較大的產(chǎn)量。所以，如果在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，分析產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度與產(chǎn)甲烷速率的相關(guān)性，可能更能準(zhǔn)確反映二者之間的相互關(guān)系，這為后續(xù)進(jìn)一步研究提供了思路。

4 結(jié)論

（1）渤海M1、M7站位以甲基營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷為主，同時(shí)具有H2/CO2還原型產(chǎn)甲烷途徑，不存在乙酸發(fā)酵產(chǎn)甲烷途徑。

（2）同一站點(diǎn)隨著深度的增加，甲烷產(chǎn)生量逐漸減少，產(chǎn)甲烷速率相應(yīng)降低。

（3）通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)古菌群落以Crenarchaeota、Asgardaeota和Nanoarchaeota為主。其中，M1 2～6 cm、M1 20～24 cm、M7 20～24 cm、M7 32～36 cm優(yōu)勢(shì)古菌均為Bathyarchaeia綱，M7 2～6 cm優(yōu)勢(shì)古菌為Nitrososphaeria綱。Ca.Methanofastidiosales在各樣品產(chǎn)甲烷菌中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

致謝：感謝中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局青島海洋地質(zhì)研究所的賀行良老師在甲烷含量測(cè)定等方面提供的支持與幫助。