廣西眼鏡蛇蛇毒的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

羅瑩，黃智，李亞蘭，廖明

(廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021)

0 引言

廣西地處亞熱帶，氣候與自然環(huán)境都非常適合蛇類生存，毒蛇的種類繁多。近年來，隨著城市綠化生態(tài)的還原以及人工養(yǎng)蛇業(yè)和食蛇餐飲業(yè)的發(fā)展，廣西的蛇傷病例居高不下，每年約有3～4萬人被蛇咬傷[1]。僅據(jù)本校附屬醫(yī)院急診科統(tǒng)計2006-2015年十年的數(shù)據(jù)顯示，平均每年收治的蛇傷患者近100例[2]?？梢姡瑥V西長期以來是蛇傷的重點區(qū)域，蛇傷的臨床診斷和治療已成為廣西醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的突出問題。

眼鏡蛇咬傷是我國南方最常見的蛇傷之一，位居毒蛇咬傷發(fā)病率的第二位[3]，而在廣西則位于毒蛇咬傷的首位[4]。眼鏡蛇的蛇毒為混合毒且組成成分十分復(fù)雜，造成眼鏡蛇咬傷后的病理生理具有多樣性，臨床特征往往體現(xiàn)為傷口腫脹、潰爛壞死，呼吸困難、心力衰竭等等，嚴(yán)重者出現(xiàn)休克甚至死亡。目前，由于缺乏對廣西眼鏡蛇蛇毒所有成分的了解，給治療帶來了不少的困難，因此有必要詳細(xì)對廣西眼鏡蛇蛇毒的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，旨在為廣西眼鏡蛇的蛇傷診治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒購于中國MCE。甲酸、乙腈購 于 德 國Merck公 司；DTT、IAA buffer、Trypsin buffer、 NH4HCO3均購于美國Sigma公司。廣西眼鏡蛇蛇毒凍干粉從廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所獲得。AB Triple TOF 5600/6600質(zhì) 譜 儀（美 國AB SCIEX公司）；1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 蛇毒的定量和SDS-PAGE檢測

取蛇毒凍干粉適量，溶解于高純水，CCK-8試劑盒測蛇毒蛋白質(zhì)的含量。12% SDS-PAGE對蛇毒蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分析。

1.3 蛇毒的FASP酶解

取蛇毒凍干粉適量，溶解于高純水。然后取30μl溶解好的蛇毒溶液，加DTT達(dá)濃度為100mM，100℃5min，室溫下冷卻。接著加入200μLUA緩沖液混勻，經(jīng)30kD超膜過濾，15min離心（14000g），棄濾液(重復(fù)以上步驟1次)。加入100μLIAA緩沖液，1min振蕩（600rpm），室溫下 反 應(yīng)30min（避 光），14000g離 心15min。加入100μLUAbuffer離心14000g15min，重復(fù)2次。加 入100μL25mMNH4HCO3溶 液，14000g離 心15min，重復(fù)該步驟兩次。加入40μLTrypsin緩沖液，振蕩1min（600rpm），37℃放置16-18h，14000g離心15min，收集濾液。肽段用C18Cartridge脫鹽，然后凍干，接著40μL0.1%CH2O2復(fù)溶，OD280進(jìn)行定量。

1.4 LC-MS質(zhì)譜分析

取1 μl酶解后產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS/MS分析（納升級系統(tǒng)Easy nLC,）每個樣品進(jìn)樣一次。采分離過程：A 液：0.1%甲酸,B 液：0.1%甲酸乙腈 (乙腈為84%)。95% A 液平衡色譜柱。樣品上樣到色譜柱Thermo scientific EASY column分離,流速：300 nL/min。相關(guān)設(shè)置: 2小時梯度: 0 min- 110 min, B液從0%-55%;110 min- 115 min, B液從55%-100%;115 min- 120 min, B液維持在100%。質(zhì)譜儀質(zhì)譜分析條件:正離子; 300-1800 m/z母離子掃描;一級質(zhì)譜70,000 at m/z 200 分辨率；每次全掃描后采集20個碎片圖譜進(jìn)行二級質(zhì)譜分析（分辨率:17,500 at m/z 200）。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

原始文件(raw file)采用分析軟件PD-Mascot查庫進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。蛋白數(shù)據(jù)庫為uniprot_Naja_981_20201030.fasta。(http://www.uniprot.org)。其中搜庫參數(shù)設(shè)定: Enzyme為Trypsin；Missed cleavage sites 設(shè)為2；固定修飾為Carbamidomethyl (C)；動態(tài)修飾設(shè)定Oxidation (M)；過濾參數(shù)為FDR≤0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

考染結(jié)果見圖1，蛇毒樣品條帶分離清晰，質(zhì)量滿足質(zhì)譜鑒定的實驗要求。

圖1 廣西眼鏡蛇蛇毒SDS-PAGE電泳考染分析圖

2.2 LC-MS/MS鑒定廣西眼鏡蛇蛇毒蛋白質(zhì)結(jié)果

質(zhì)譜共鑒定到了59個蛋白，包括19大類的蛋白質(zhì)：酸性磷脂酶A2，蛇毒神經(jīng)生長因子，細(xì)胞毒素，神經(jīng)毒素，金屬蛋白酶，蛇毒磷酸二酯酶，磷脂酶A2受體抑制蛋白，富含半胱氨酸蛇毒蛋白，蛇毒5核苷酸酶，氨基酸氧化酶，Thaicobrin蛋白，磷脂酶A2，Nakoroxin蛋白，蛇毒抗菌肽，補體因子，絲氨酸蛋白酶抑制子，SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白4，E3泛素蛋白連接酶，Envoplakin蛋白等。詳細(xì)見表1。質(zhì)譜分析的蛇毒蛋白質(zhì)Basepeak圖譜見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)Basepeak圖譜

表1 LC-MS/MS鑒定廣西眼鏡蛇蛇毒蛋白列表

續(xù)表1

3 討論

廣西屬于全國毒蛇咬傷高發(fā)區(qū)，每年的致死率和傷殘率居高不下，成為突出的公共衛(wèi)生問題。相關(guān)資料顯示，廣西常見毒蛇咬傷中，六成以上是眼鏡蛇傷。蛇毒的生理和病理活性主要與其含有的蛋白質(zhì)或肽段有關(guān)，因蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在復(fù)雜體系中檢測低豐度蛋白質(zhì)的方面具備優(yōu)勢[5-7]，可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面分析蛇毒的蛋白組成。最近幾年相繼有學(xué)者對中國境內(nèi)的蝮蛇、蛇島蝮、莽山洛鐵頭蛇等蛇毒[8-10]蛇毒蛋白組學(xué)研究。在中華眼鏡蛇蛇毒中蛋白質(zhì)組的研究中，Shan（2017）等人采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定到5類蛋白質(zhì)家族共32個蛋白質(zhì)[11]，張經(jīng)碩（2019）等人從篩選到11類蛋白質(zhì)家族共17個蛋白質(zhì)[12]。目前，由于缺乏對廣西眼鏡蛇蛇毒具體蛋白質(zhì)成分的了解，本研究采用液質(zhì)聯(lián)用的串聯(lián)質(zhì)譜LC-MS/MS對廣西眼鏡蛇蛇毒的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，質(zhì)譜共鑒定出19類的蛋白質(zhì)家族，共59個蛋白；分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒素類家族蛋白占了13個，為最多；接著是神經(jīng)毒素家族類為10個和酸性磷酸酶家族類為6個。本實驗獲得的廣西眼鏡蛇蛇毒蛋白質(zhì)的組成，將為蛇毒蛋白純度的檢測、表征和應(yīng)用提供了可靠依據(jù)，可為蛇毒蛋白組分的純化、藥效、結(jié)構(gòu)與功能等研究提供重要的信息，也同時為廣西眼鏡蛇的蛇傷診治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。