泛素連接酶Brl2在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用分析

劉曉琴，常斐然，劉思杰，伍斐，孔道春

泛素連接酶Brl2在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中的作用分析

劉曉琴1，常斐然2，劉思杰2，伍斐2，孔道春2

1. 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，大同 037009 2. 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871

組蛋白H2B單泛素化在基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制及損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在裂殖酵母()中，Brl2作為一個泛素化連接酶，調(diào)節(jié)H2B的119位賴氨酸的單泛素化。目前，有關(guān)Brl2在DNA損傷修復(fù)中的作用研究較少，本研究利用藥物喜樹堿(camptothecin, CPT)處理裂殖酵母產(chǎn)生高毒性的DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)，探索Brl2在DSB修復(fù)過程中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，基因缺失的菌株對CPT高度敏感，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA自發(fā)重組頻率下降。熒光分析表明Brl2和重組修復(fù)蛋白Rad52共定位到DSB處，且Brl2促進Rad52在DSB處的募集。在CPT產(chǎn)生的DSB條件下，Brl2會發(fā)生磷酸化。以上研究發(fā)現(xiàn)揭示了Brl2在DSB修復(fù)過程中起重要作用，為具體闡明Brl2在DNA同源重組及雙鏈斷裂修復(fù)的分子機制奠定了進一步研究的基礎(chǔ)。

組蛋白H2B；Brl2；DNA雙鏈斷裂修復(fù)；喜樹堿；裂殖酵母

DNA作為生物體生命的遺傳物質(zhì)，其完整性維持對細(xì)胞極其重要。外界環(huán)境與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境存在很多對DNA分子損傷和改變的因素，如紫外線、電離輻射、化學(xué)治療藥物、細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基、烷基化因子、以及復(fù)制壓力等。如果DNA損傷沒有得到及時有效地修復(fù)，就可能造成DNA分子可遺傳的永久性序列改變，包括堿基損傷、DNA鏈間和鏈內(nèi)的交聯(lián)、DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)、DNA單鏈斷裂及雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)等[1]。在這些損傷中，DSBs是對細(xì)胞毒性最大的一種DNA損傷[2]。據(jù)統(tǒng)計，人類的一個細(xì)胞每天可發(fā)生10～50次DSBs，而一個DSB如果沒有得到修復(fù)，就可以破壞細(xì)胞基因組完整性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。保守的DSBs修復(fù)途徑包括同源重組(homo-logous recombination, HR)修復(fù)和非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)修復(fù)。HR修復(fù)需要一條姐妹染色單體作為模板，是準(zhǔn)確的修復(fù)方式；而NHEJ是直接將斷裂的兩端連接起來，是一種易錯修復(fù)模式。選擇哪種方式對DSBs進行修復(fù)，受細(xì)胞周期、表觀遺傳和末端切除的方式等多種因素影響[4]。例如，HR修復(fù)主要發(fā)生在細(xì)胞周期的S末期和G2期，而NHEJ修復(fù)可發(fā)生在細(xì)胞周期的任一時期，但在G1期和S早期發(fā)生頻率更高[3]。由核酸酶或電離輻射等產(chǎn)生的DSBs既可以由HR修復(fù)，也可以由NHEJ修復(fù)。DNA復(fù)制叉垮塌導(dǎo)致的DSBs主要由HR進行修復(fù)，因為復(fù)制叉的垮塌產(chǎn)生的是單末端的DSB；只有機體不能進行HR修復(fù)時，S期產(chǎn)生的DSBs才會選擇使用單鏈退火的方式或者NHEJ方式進行不精確地修復(fù)[5,6]。喜樹堿(campto-thecin, CPT)是一種天然的抗腫瘤藥物，它可以通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的再連接反應(yīng)穩(wěn)定其與DNA形成的復(fù)合物，導(dǎo)致DNA單鏈的斷裂。當(dāng)正在合成的復(fù)制叉遇到這些DNA單鏈斷裂時，便會導(dǎo)致DNA復(fù)制叉停滯和單末端DSB產(chǎn)生。CPT誘導(dǎo)的這種單末端的DSB代表了機體內(nèi)常見的一種DSB產(chǎn)生方式，而且這種損傷多經(jīng)HR進行修復(fù)[7]。

當(dāng)細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生DSBs后，磷脂酰肌醇3-激酶信號通路被激活，主要激酶包括ATM激酶(ataxia telangiectasia mutated)、ATR激酶(ataxia telangiec-tasia and Rad3-related protein)和DNA-PKcs，從而停頓細(xì)胞周期、促進DNA修復(fù)或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中，ATM和ATR主要介導(dǎo)HR修復(fù)，DNA-PKcs介導(dǎo)NHEJ修復(fù)。在裂殖酵母()中，ATM的同源蛋白Tel1主要識別DNA斷裂末端，并與DNA核酸酶MRN (Mre11-Rad50-Nbs1)復(fù)合物相互作用，促進MRN-CtIP復(fù)合物對DNA末端的切割。MRN-CtIP復(fù)合物在DNA雙鏈斷裂處進行5′→3′的堿基切除，產(chǎn)生3′-單鏈DNA。在末端堿基切除去掉5′-鏈幾千到幾萬個堿基的過程中，RNA聚合酶III被MRN募集到DNA斷裂處，以3′-鏈為模板進行RNA合成，并形成RNA-DNA雜交鏈以保護3′-鏈不被降解[8]。復(fù)制蛋白A(replication protein A, RPA)結(jié)合到翹起的單鏈DNA結(jié)構(gòu)上，并作為信號募集并激活A(yù)TR的同源蛋白Rad3，激活的Rad3通過磷酸化下游的Cds1激酶(人細(xì)胞中的同源蛋白Chk2)停頓細(xì)胞周期及穩(wěn)定停頓的復(fù)制叉[9,10]。之后，RPA會被Rad52介導(dǎo)的Rad51所取代，形成Rad51核蛋白絲，促進下游的同源序列的尋找及替換[1]。

在裂殖酵母中，Brl2是一個E3連接酶，與Brl1，Shf1和Rhp6組成復(fù)合物HULC (H2B ubiquitin ligase complex)，單泛素化組蛋白H2B的119位的賴氨酸。HULC位于異染色質(zhì)區(qū)域,對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有重要的調(diào)控作用[11]。Brl1和Brl2在芽殖酵母中的同源物是Bre1，人細(xì)胞中的同源物分別為RNF20和RNF40。目前對這些E3連接酶的研究主要集中在它們對H2B的單泛素化(H2Bub1)方面。H2Bub1在真核生物中非常保守，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用研究最為清楚：它能夠調(diào)節(jié)核小體的組裝，促進轉(zhuǎn)錄的延伸。近年來，H2Bub1在DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)中的作用被逐漸挖掘[12]。在哺乳動物細(xì)胞中，電離輻射(ionizing radiation, IR)導(dǎo)致H2Bub1的含量增加。RNF20和RNF40可能作用在DNA損傷的早期來調(diào)控下游的HR及NHEJ通路。在IR誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中，RNF20/RNF40對H2Bub1的作用受激酶ATM和ATR共同調(diào)控[13]。但是，具體的H2Bub1在DNA損傷修復(fù)和復(fù)制中的作用依然有待被闡明。而且，有研究發(fā)現(xiàn)，缺失或敲降RNF20/40的表型與突變H2B 120位的賴氨酸表型并不完全相同，預(yù)示著除了泛素化H2B外，RNF20/40也存在其他的底物。例如，RNF20/40可單泛素化熱休克轉(zhuǎn)錄因子eEF1BδL的381位的賴氨酸，從而調(diào)控一些熱休克相關(guān)基因的表達[14]。

為了更進一步認(rèn)識H2B的泛素化連接酶在DNA損傷修復(fù)中的作用，本研究利用裂殖酵母為研究對象，通過檢測相關(guān)菌株對DNA損傷藥物的敏感性、重組頻率、Brl2與Rad52的共定位、Rad52聚集點數(shù)目及Brl2的磷酸化，發(fā)現(xiàn)Brl2在DSBs修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。當(dāng)DSBs發(fā)生后，Brl2被募集到損傷位點，促進下游的重組修復(fù)蛋白Rad52在DSB處的富集，有利于DNA重組介導(dǎo)的DSBs修復(fù)。在該過程中，Brl2會發(fā)生磷酸化。在DNA重組調(diào)控的過程中，Brl2與Rad3在同一事件方面發(fā)揮作用。但是，在Rad3-Cds1體系缺失的菌株中，Brl2發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，缺失Brl2更有利于Rad3-Cds1缺失菌株在DNA損傷壓力下的存活。

1 材料與方法

1.1 酵母菌株、培養(yǎng)基和酵母轉(zhuǎn)化

本實驗用到的裂殖酵母菌株及其基因型見表1。菌株的構(gòu)建采用經(jīng)典的同源重組方法[15]。酵母轉(zhuǎn)化利用乙酸鋰和PEG3350[16]。細(xì)胞生長的培養(yǎng)基主要有YES培養(yǎng)基：5 g/L酵母提取物，30 g/L葡萄糖，250 mg/L腺嘌呤，250 mg/L尿嘧啶，250 mg/L組氨酸和250 mg/L亮氨酸；EHLU培養(yǎng)基：在Edinburgh Minimal Medium (EMM)的基礎(chǔ)上補充250 mg/L組氨酸，250 mg/L亮氨酸和250 mg/L尿嘧啶[17]；EHALU培養(yǎng)基：在EMM的基礎(chǔ)上補充250 mg/L腺嘌呤，250 mg/L組氨酸，250 mg/L亮氨酸和250 mg/L尿嘧啶；EHAL培養(yǎng)基在EMM的基礎(chǔ)上補充250 mg/L組氨酸，250 mg/L亮氨酸和250 mg/L腺嘌呤。對應(yīng)的固體培養(yǎng)基的制備為每升液體培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉(上述酵母提取物、葡萄糖和瓊脂粉試劑購自太原瑞研科生物科技有限公司，其他試劑購自美國Sigma公司)。

1.2 梯度稀釋打點實驗

將待測試的酵母細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，取樣并調(diào)節(jié)各個菌體的數(shù)目一致，此為梯度稀釋打點的第1個樣品，之后，對其進行5倍梯度稀釋，共稀釋5次，依次取等體積菌液接種到含有不同藥物的培養(yǎng)板上。紫外線處理時，菌株如上所述接種到不含藥物的培養(yǎng)板上，使用UV儀器對菌株進行一定劑量的直接照射。最后，放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4天后采集圖像。

表1 本研究使用的菌株基因型

1.3 自發(fā)重組頻率的檢測

重組頻率的檢測使用YKM619菌種，該菌種含有兩個ade非串聯(lián)重復(fù)的異位基因(和)，兩個ade基因中間含有一個的標(biāo)志基因。利用變異反應(yīng)實驗(fluctuation tests)進行自發(fā)重組頻率(spontaneous recombinant frequencies)的測定[18]。使用野生型(WT) (YKM619)、()、(9)和()菌株，每個菌種挑取5個單克隆，劃線于YES平板。30℃培養(yǎng)4 d，從板上挑取單克隆至滅菌水中，按每板約105～106個細(xì)胞的數(shù)量將細(xì)胞涂布至EHLU板，記為實驗板。對應(yīng)的細(xì)胞100倍稀釋后，取等量體積菌液涂EHALU板，記為對照板。30℃培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計實驗板上的白色菌落數(shù)目和對照板上的單克隆菌落數(shù)目，計算自發(fā)重組頻率。

1.4 Rad52與Brl2的共定位分析

構(gòu)建C端帶有YFP熒光的Brl2高表達質(zhì)粒REP41-Brl2-YFP，并將其轉(zhuǎn)入DY1012菌種中，涂布于含有5 μg/mL維生素B1 (thiamine, T)的EMM固體板上，30℃生長4 d，將菌落轉(zhuǎn)移到5 μg/mL thiamine的EMM液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對數(shù)期，離心收菌，用滅菌水洗菌體3次后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的不含有thiamine的EMM中，開始誘導(dǎo)表達。30℃培養(yǎng)14 h后收集樣品，3000 r/min離心1 min，蒸餾水洗菌體1次，用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，之后通過Delta Vision Personal DV觀察Rad52-CFP和Brl2-YFP是否發(fā)生共定位。

1.5 Rad52聚集點的采集與分析

在FY18445菌種的基礎(chǔ)上，構(gòu)建的缺失株。挑取新鮮的WT (FY18445)與(-FY18445)單菌落于YES液體培養(yǎng)基中，長至對數(shù)期，分別收取5 OD細(xì)胞，3000 r/min離心1 min，棄上清后蒸餾水洗菌體1次，最后用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，放4℃。同時向?qū)?shù)期的細(xì)胞中加入終濃度為10 μmol/L的藥物CPT，30℃繼續(xù)培養(yǎng)，并收取加藥后0.5 h、1 h、1.5 h和2 h的樣品，樣品處理同上。CPT處理2 h后，收菌，每次用20 mL滅菌水洗菌體，共3次，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的不含藥物的YES培養(yǎng)基中，并收取從CPT藥物中釋放出來的1 h、2 h和3 h的樣品，樣品處理同上。

顯微鏡使用Delta Vision Personal DV系統(tǒng)，配備CoolSNAP HQ2制冷的CCD及YFP/CFP的濾片組合，放大倍數(shù)為100倍。圖像用Volocity Demo軟件進行分析。

1.6 Brl2的磷酸化分析

菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，分為2等份，1份為對照組，1份為加藥組。加藥組加入終濃度為10 μmol/L的CPT，30℃繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，收集約20 OD的菌體。用滅菌水洗菌體1次，使用500 μL 20%三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)懸浮菌體，并向其中加入等體積的玻璃珠，之后在振蕩器上混勻6～8 min，離心收集上清。玻璃珠用5%的TCA清洗2次，清洗液與上清合并，3000 r/min室溫離心10 min，棄上清。沉淀用200 μL十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)的蛋白上樣緩沖液(1×)懸浮，并立即加入100 μL 1 mol/L Tris中和TCA的酸性，95℃煮樣5 min后，3000 r/min室溫離心10 min，收取上清，即為全細(xì)胞提取物。樣品通過SDS-PAGE電泳，HA抗體(1∶1000；美國Invitrogen公司)進行定量，之后進行Phos-tag膠電泳(日本和光純藥WAKO)[19]，檢測是否有磷酸化條帶的存在。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 5軟件進行處理，兩兩數(shù)據(jù)間的比較采用檢驗分析，<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 brl2Δ對CPT、MMS和UV敏感

為了探索泛素化連接酶Brl2在細(xì)胞損傷修復(fù)過程中的作用，本研究利用野生型裂殖酵母LD330菌種為背景菌種，通過同源重組的方法，構(gòu)建了基因敲除菌株()。如圖1A所示，細(xì)胞較WT細(xì)胞拉長，分枝，且不容易分離，該結(jié)果與之前的文章報道一致[11]。甲基甲磺酸酯(methyl methane sulfonate, MMS)能夠甲基化DNA上的嘌呤堿基，生成N7-甲基鳥嘌呤和N3-甲基腺嘌呤，導(dǎo)致DNA復(fù)制過程中復(fù)制叉停頓和DNA雙鏈斷裂。紫外線UV對DNA照射后，可以使DNA形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體等DNA損傷，阻止復(fù)制過程中DNA聚合酶的前行，使復(fù)制叉發(fā)生停頓。為了評估Brl2在DNA損傷修復(fù)中的作用，通過梯度稀釋打點分析比較了WT菌株和菌株對CPT、MMS和UV的敏感性。結(jié)果顯示缺失后對DNA損傷藥物CPT、MMS及UV射線非常敏感(圖1B)，說明Brl2蛋白在基因組的穩(wěn)定性維持上發(fā)揮著重要的作用。之后，選用CPT藥物誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂來探索Brl2在DSBs中的修復(fù)作用。為了驗證缺失對DNA損傷因素的敏感性是否依賴于H2B的119位賴氨酸單泛素化的缺失，進一步檢測了和K119R突變體(為H2B的基因名)對藥物CPT的敏感性，與相比，和K11R菌株的生長速度降低，且對CPT的敏感性也更低(圖1C)，暗示Brl2除了泛素化H2B的K119位點外，應(yīng)該調(diào)控了其他底物、其他組蛋白、或者H2B的其他位點的泛素化來促進DSBs的修復(fù)。

圖1 Brl2參與DNA損傷修復(fù)途徑

A：野生型(WT)和菌株細(xì)胞的比較，顯示缺失基因?qū)е录?xì)胞拉長、分枝。B：對不同的DNA損傷因素的敏感性分析。C：對CPT的敏感性不完全依賴于對H2B的119位賴氨酸的單泛素化。B和C所示菌株生長到對數(shù)期時，收取等量的細(xì)胞數(shù)，進行5倍梯度稀釋，取8 μL點到含有不同濃度的藥物平板上。對于UV處理的樣品，當(dāng)樣品點到Y(jié)ES平板后，待菌體全部滲入培養(yǎng)基，使用UV儀進行對應(yīng)強度的照射。平板放30℃培養(yǎng)，3～4 d后拍照。

2.2 brl2缺失有利于rad3Δ和cds1Δ菌株在CPT壓力下的存活

當(dāng)遇到復(fù)制壓力時，機體會激活Rad3-Cds1調(diào)控的信號通路來維持正在復(fù)制的復(fù)制叉穩(wěn)定，從而有利于后續(xù)的DNA損傷修復(fù)。為了探索CPT誘導(dǎo)下的Brl2與該信號通路的關(guān)系，本研究構(gòu)建了兩個和雙缺失株，并檢測了它們對CPT的敏感性。結(jié)果顯示，對低濃度的CPT非常敏感，但是雙缺失株對CPT的敏感性降低，細(xì)胞的存活率增加(圖2A)。進一步利用酵母的高表達質(zhì)粒pSLF1073，在中高表達Brl2蛋白，可以逆轉(zhuǎn)降低的CPT敏感性(圖2B)，因而證實了敲除Brl2蛋白有利于菌株在CPT壓力下的存活。而且，如圖2C所示，敲除Brl2蛋白有利于菌株在CPT壓力下的存活。上述結(jié)果表明，當(dāng)機體缺失Rad3-Cds1檢驗系統(tǒng)時，Brl2的缺失更有利于細(xì)胞在CPT壓力下的存活，這也暗示Brl2可能是細(xì)胞周期檢驗點Rad3-Cds1通路的靶蛋白，以維持停頓DNA復(fù)制叉的穩(wěn)定。

2.3 Brl2是DNA同源重組的必需因子

如前面結(jié)果顯示，在WT背景下，Brl2有助于細(xì)胞在CPT壓力下的存活，但是在Rad3-Cds1檢驗系統(tǒng)缺失時，Brl2反而不利于細(xì)胞在CPT壓力下的存活。為了探索Brl2在CPT誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)中的正面作用，本研究進一步檢測了不同菌株的DNA重組能力。結(jié)果顯示，敲除或后，菌株的重組能力均下調(diào)且較有顯著下調(diào)，但是雙缺失菌株的重組能力與相當(dāng)(圖3)。此結(jié)果表明，Brl2在DSBs的重組修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，這也暗示Rad3可能是調(diào)控Brl2的DNA同源重組功能的調(diào)控因子之一。

圖2 brl2缺失有利于rad3Δ和cds1Δ菌株抵抗CPT產(chǎn)生的DNA損傷

A：缺失有利于菌株抵抗CPT產(chǎn)生的DNA損傷。B：在菌株中，分別轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pSLF1073和高表達Brl2蛋白的質(zhì)粒pSLF1073-，同時在菌株中，轉(zhuǎn)化pSLF1073作為對照，對應(yīng)細(xì)胞在含有終濃度5 μg/mL的thiamine的EHAL液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇，之后將其接種到EHAL培養(yǎng)基中表達，16.5 h后調(diào)節(jié)菌落數(shù)目一致，進行梯度稀釋打點實驗。C：缺失有利于菌株抵抗CPT產(chǎn)生的DNA損傷。圖中所示菌株均為生長到對數(shù)期時，收取等量的細(xì)胞數(shù)，進行5倍梯度稀釋后，取8 μL點到含有不同濃度的藥物平板上。平板放30℃培養(yǎng)，3～4 d后拍照。

2.4 Brl2有助于Rad52在DSBs處的募集

為了進一步確定Brl2參與DSBs修復(fù)，本研究構(gòu)建了帶有YFP標(biāo)簽的Brl2的表達質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入DY1012菌株中，觀察Brl2是否可以與重要的重組修復(fù)蛋白Rad52共定位。結(jié)果表明，Brl2可以與Rad52共定位(圖4A)，說明Brl2會被募集到DSBs位點上。無論是在WT菌株還是在缺失菌株中，每次實驗取5個單克隆的數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次。*：<0.05；***：<0.001。

圖3 野生型菌株和突變株的自發(fā)重組頻率檢測

隨著CPT作用時間的增加，Rad52聚集點數(shù)量均會逐漸增加。但是，與WT菌株相比，缺失菌株中的Rad52聚集點增加的數(shù)量明顯下調(diào)。當(dāng)去除CPT藥物后，WT菌株中Rad52聚集點逐漸減少，而缺失株中的Rad52聚集點的下調(diào)速率明顯降低(圖4B)。這些結(jié)果指出Brl2蛋白會募集到DSBs位點處，并有利于同源重組因子Rad52在DSBs的募集，從而促進細(xì)胞對DSBs的重組修復(fù)效率。

圖4 Brl2定位到DSBs處并促進Rad52的募集

A：Brl2與Rad52在DSB處的共定位。C端融合表達YFP蛋白的Brl2在含有Rad52-CFP的菌株中表達16 h以上，收集菌株，通過Delta Vision Personal DV對其進行拍攝。B：WT和菌株生長到對數(shù)期時，加入終濃度為10 μmol/L CPT，作用2 h后，去除CPT藥物，再培養(yǎng)3 h，收取所示時間點的細(xì)胞，使用70%的乙醇固定細(xì)胞，之后通過Delta Vision Personal DV對細(xì)胞進行觀察。ns：無統(tǒng)計學(xué)差異，*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

2.5 Brl2在DNA損傷修復(fù)時會被磷酸化

為了進一步研究Brl2在DNA損傷修復(fù)時是如何被調(diào)控的，本研究在WT菌株的背景下，構(gòu)建了的菌株，通過提取CPT未處理及處理的菌株的全細(xì)胞提取物，利用HA抗體和Phos-tag凝膠對Brl2的磷酸化水平進行了檢測。結(jié)果顯示，在沒有DNA損傷時，Phos-tag膠不能檢測到明顯的Brl2磷酸化，但是，藥物CPT處理后，Brl2可檢測到遷移慢的條帶(圖5)，暗示在CPT誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)過程中，Brl2存在磷酸化狀態(tài)，其功能可能受蛋白激酶的磷酸化所調(diào)控。

3 討論

H2B的120位賴氨酸單泛素化是一個非常保守的組蛋白翻譯后修飾，在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前，很多對其泛素化連接酶的研究主要針對這些泛素化連接酶的底物H2B進行。本研究發(fā)現(xiàn)，在CPT誘導(dǎo)的DSBs損傷修復(fù)過程中，較菌株K119R對CPT更加敏感，暗示了裂殖酵母中的Brl2泛素化連接酶所發(fā)揮的作用并不完全依賴于其底物H2B的K119位的泛素化。因此，以Brl2為研究對象，有利于全面揭示Brl2在DSBs損傷修復(fù)中的作用機制。

圖5 Brl2的磷酸化檢測

菌株生長到對數(shù)期后，分為2等份，1份未處理，另1份加入終濃度為10 μmol/L CPT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，收集菌體，提取全細(xì)胞提取物。使用HA抗體對普通蛋白膠分離的Brl2-3HA蛋白進行定量后，再進行6% Phos-tag膠電泳并檢測CPT未處理和處理的菌株中Brl2-3HA蛋白含量。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)H2Bub1在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮著一定的調(diào)控作用，但是其具體的作用機制仍待進一步闡明。在高等哺乳細(xì)胞中，IR或者輻射模擬藥物新制癌菌素(neocarzinostatin, NCS)可導(dǎo)致RNF20/RNF40定位到DSBs處及H2Bub1整體水平的增加。在這個過程中，ATM磷酸化RNF20/RNF40，促進H2B的單泛素化[20,21]。也有研究表明，單獨抑制ATR和ATM，并不影響IR引起的H2Bub1水平，只有同時抑制ATR和ATM，H2Bub1才會受到調(diào)控[13]。上調(diào)的H2Bub1作為DSB修復(fù)的上游信號，調(diào)節(jié)下游的HR和NHEJ修復(fù)[13,20]。上述結(jié)果表明，ATM在RNF20/40的上游發(fā)揮作用，而ATR可能與ATM存在冗余作用。為進一步探討ATR激酶和H2B泛素化連接酶在DSBs修復(fù)過程中的關(guān)系，本研究利用裂殖酵母為研究模型，以CPT藥物誘導(dǎo)的生理常見DSBs為主要研究對象，比較了和等缺失菌株對DSBs損傷因素的敏感性和自發(fā)重組頻率，并對Brl2的磷酸化情況進行了分析。結(jié)果顯示Brl2缺失對各種DSBs損傷因素均高度敏感，但是在沒有Rad3-Cds1體系時，缺失更有利于菌株抵抗CPT誘導(dǎo)的損傷；雙敲除菌株的自發(fā)重組頻率與相似，較的重組頻率低，未出現(xiàn)和重組頻率的加和效應(yīng)，且CPT可誘導(dǎo)Brl2發(fā)生磷酸化。以上結(jié)果說明，在野生型細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)CPT誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生DSBs時，Rad3和Brl2在HR修復(fù)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并且二者可能對同一事件起作用。但是在檢驗點蛋白Rad3和Cds1缺失的菌株中，Brl2的功能需要下調(diào)以維持基因組的穩(wěn)定性，暗示Brl2可能也在維持停頓DNA復(fù)制叉中起著重要調(diào)控作用。

在DSBs修復(fù)過程中，很多研究認(rèn)為，染色質(zhì)需要先松散再進一步募集功能蛋白來行使相應(yīng)的功能[20,22]。結(jié)合H2Bub1能夠調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能[23]，研究者們進一步發(fā)現(xiàn)，DSBs處的H2Bub1有利于下游的修復(fù)相關(guān)蛋白RPA、Rad51、BRCA1及Ku70/ Ku80的募集[22,24]。但這些結(jié)果主要是在IR的作用下進行的。CPT產(chǎn)生的DSBs往往發(fā)生于DNA復(fù)制過程中，DSBs附近的DNA已經(jīng)被解聚，可能并不需要H2Bub1對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控功能，這也許是K119R對CPT不太敏感的一個原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在CPT誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)過程中，缺失導(dǎo)致Rad52不能有效募集，因此，產(chǎn)生的DSBs不能及時被修復(fù)。去除CPT后，野生型菌株中的Rad52聚集點逐漸減少，表明DNA損傷逐漸被修復(fù)，但是在中，Rad52聚集點下調(diào)非常緩慢，DNA損傷得不到及時修復(fù)，從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。

綜上所述，本研究以裂殖酵母為模式生物，探索了Brl2在CPT誘導(dǎo)的DSBs修復(fù)過程中的作用。在CPT誘導(dǎo)的DSBs發(fā)生時，Brl2被募集到損傷部位，發(fā)生磷酸化修飾，進一步募集下游的損傷修復(fù)蛋白Rad52，促進HR修復(fù)完成。在這個過程中，Brl2與激酶Rad3可能對同一事件發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。但是，當(dāng)Rad3-Cds1體系缺失時，Brl2功能下調(diào)更有利于基因組穩(wěn)定性的維持。該研究拓展了H2B泛素化連接酶Brl2在DNA損傷修復(fù)中的作用，同時為進一步闡明其分子作用機制提供了研究思路。

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The functional analysis of the ubiquitin ligase Brl2 in the repair of DNA double-strand breaks

Xiaoqin Liu1, Feiran Chang2, Sijie Liu2, Fei Wu2, Daochun Kong2

Mono-ubiquitination of histone H2B plays a critical role in the regulation of gene transcription, DNA replication, and DNA damage repair. In, Brl2 is an E3 ubiquitin ligase and required for the ubiquitination of H2B at lysine residue 119. Currently, there are few studies related to the function of Brl2 in DNA damage repair. Using camptothecin (CPT) to induce DNA double-strand breaks (DSBs) in, we investigated the effect of Brl2 on DSB repair, and found that-null mutants showed greater sensitivity to CPT when compared with wild-type (WT) cells, as well as having a drastically reduced spontaneous recombinant frequency.The fluorescent analysis demonstrated that Brl2 was co-localized with the recombination factor Rad52 at DSBs. Moreover, Brl2 promoted the recruitment of Rad52 to DSBs. Under CPT-induced DSBs, Brl2 was phosphorylated. These findings indicate that Brl2 plays a critical role in DNA homologous recombination and its mediated repair of DSBs.

histone H2B; Brl2; DSB repair; CPT;

2022-02-14;

2022-04-25;

2022-05-19

山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項目(編號：2020L0497)，山西大同大學(xué)博士科研啟動經(jīng)費(編號：2019-B-20)資助[Supported by the Scientific and Technological Innovation Program of Higher Education Institutions in Shanxi (No. 2020L0497), and Doctoral Research Start-up Funds of Shanxi Datong University (No. 2019-B-20)]

劉曉琴，博士，講師，研究方向：基因組穩(wěn)定性調(diào)控和神經(jīng)退行性疾病機制研究。E-mail: xiaoqinliu@sxdtdx.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-031

(責(zé)任編委: 劉鋼)