利用CRISPR/Cas9在人類黑色素瘤細(xì)胞中編輯MC1R與功能分析

張充，魏子璇，王敏，陳瑤生，何祖勇

利用CRISPR/Cas9在人類黑色素瘤細(xì)胞中編輯與功能分析

張充，魏子璇，王敏，陳瑤生，何祖勇

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006

(melanocortin 1 receptor)基因編碼黑皮質(zhì)素1型受體，它在配體α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)的刺激下，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP (cyclic adenosine monophosaphate)的生成，從而激活PKA (protein kinase A system)信號(hào)通路，促進(jìn)黑色素合成調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子–小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)，以及限速酶–酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控真黑素和褐黑素的合成，影響動(dòng)物的毛色表型。有研究表明，杜洛克豬() MC1R蛋白第6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain 6, TM6)發(fā)生了A243T突變，該突變可能影響MC1R蛋白生物學(xué)功能，被認(rèn)為是導(dǎo)致杜洛克豬紅毛表型的主要因素，然而卻一直未被驗(yàn)證過。因此，本研究以單鏈寡核苷酸(single- stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作為同源重組模板，利用CRISPR/Cas9技術(shù)在人類黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-2中引入基因的c.727G>A (A243T)突變，以分析其對(duì)MC1R功能的影響。結(jié)果表明ssODN發(fā)生同源重組的效率可達(dá)10%。通過對(duì)共轉(zhuǎn)染ssODN和CRISPR/Cas9表達(dá)載體的細(xì)胞進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，獲得6個(gè)單克隆細(xì)胞株，進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果未能篩選到發(fā)生預(yù)期突變的單克隆細(xì)胞株，所有單克隆細(xì)胞株皆在目標(biāo)位點(diǎn)周圍出現(xiàn)突變。對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞群進(jìn)行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其cAMP信號(hào)強(qiáng)度、基因和基因表達(dá)量均顯著低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，表明編輯可影響細(xì)胞的黑色素合成功能。本研究為深入分析突變影響動(dòng)物毛色提供了進(jìn)一步的參考。

；基因定點(diǎn)突變；CRISPR/Cas9；A243T

毛色作為一種易于區(qū)分的性狀，在家豬的遺傳育種工作中起著重要的作用，可用于檢驗(yàn)家豬群體純度、鑒別遺傳穩(wěn)定性以及確定育種的雜交組合等。家豬群體的毛色表型豐富，主要包括野豬的野灰色、中國(guó)部分地方豬的純黑色、杜洛克豬的全紅色、大白和長(zhǎng)白豬的純白色、皮特蘭豬的白底黑斑塊和巴克夏豬的黑底白點(diǎn)型。目前研究表明，控制豬毛色遺傳的基因座位主要有A、B、C、D、E、I、S、Be和He等[1～6]，這些基因座中的基因表達(dá)情況會(huì)影響黑色素的種類以及黑色素在毛皮質(zhì)和髓質(zhì)中沉積的數(shù)量，進(jìn)而影響動(dòng)物毛色。

黑皮質(zhì)素-1受體(melanocortin 1 receptor,)基因是位于E基因座上的等位基因，定位于家豬6號(hào)染色體的短臂末端，由單一的外顯子組成。MC1R蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR)家族成員[4,7]，其天然配體是α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone, ACTH)。當(dāng)MC1R蛋白受體與配體結(jié)合時(shí)，G蛋白α亞基結(jié)合三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)而被活化，活化的α亞基與βγ亞基解離，進(jìn)而激活細(xì)胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)。在Mg2+存在的條件下，三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)被轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙攀弓h(huán)腺苷酸(cAMP)，cAMP與蛋白激酶A (protein kinase A system, PKA)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合導(dǎo)致PKA催化亞基解離，PKA催化亞基進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化基因調(diào)控蛋白使得基因表達(dá)上調(diào)[6]，基因轉(zhuǎn)錄翻譯小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)?；蜣D(zhuǎn)錄翻譯的酪氨酸酶能夠催化酪氨酸形成真黑素和褐黑素，真黑素和褐黑素在細(xì)胞中的含量與分布使動(dòng)物呈現(xiàn)不同的毛色。

有研究表明，紅毛表型的杜洛克與黑灰色表型的野豬相比，其基因含有c.482C>T和c.727G> A兩個(gè)突變位點(diǎn)，從而導(dǎo)致杜洛克基因翻譯后第164位丙氨酸變成纈氨酸(A164V)，第243位丙氨酸變成蘇氨酸(A243T)[3,4](圖1A)。A164V突變發(fā)生在保守位點(diǎn)，但在栗色馬()和黑色馬中都存在[8,9]，因此人們推測(cè)該突變可能不影響基因的關(guān)鍵功能。而A243T突變發(fā)生在MC1R蛋白第6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)高度保守位置，被認(rèn)為是影響基因功能發(fā)揮從而導(dǎo)致杜洛克紅毛表型的關(guān)鍵突變位點(diǎn)[4]，但目前未有相關(guān)功能驗(yàn)證的研究報(bào)道。人類()皮膚黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-2是從惡性黑色素腫瘤中分離出來的黑色素瘤細(xì)胞系，在配體α-MSH誘導(dǎo)下可以表達(dá)MC1R蛋白[10]。本研究在SK-MEL-2細(xì)胞中，使用一條靶向基因第243位密碼子附近區(qū)域的sgRNA (short guide RNA)，引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割，造成DNA雙鏈斷裂(DNA double- stranded breaks, DSBs)，同時(shí)提供含有c.727G>A突變的單鏈寡核苷酸做為同源重組的模板，最終在MC1R蛋白受體中引入A243T點(diǎn)突變，為后續(xù)驗(yàn)證杜洛克紅毛表型的遺傳機(jī)制提供參考。

圖1 杜洛克豬MC1R基因突變位點(diǎn)及靶向人類MC1R基因A243T位點(diǎn)的sgRNA示意圖

A：野豬與杜洛克豬基因?qū)Ρ?；B：靶向人類基因p.A243T(c.727G>A)位點(diǎn)的sgRNA。

1 材料與方法

1.1 材料

人類皮膚黑色素瘤細(xì)胞(SK-MEL-2, HTB-68)由廣州博紹生物科技有限公司代理從ATCC (American Type Culture Collection)購(gòu)入，pX458質(zhì)粒(#72351)購(gòu)自美國(guó)Addgene公司，pMD?18-T質(zhì)粒(#6011)和DH5α大腸桿菌感受態(tài)(#CD201)分別購(gòu)自日本TaKaRa公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物和ssODN由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 sgRNA設(shè)計(jì)和CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

將人類與家豬基因序列進(jìn)行比對(duì)，在對(duì)應(yīng)于杜洛克豬p.A243T (c.727G>A)突變位點(diǎn)(圖1A) 的附近區(qū)域?qū)ふ襊AM序列(5′-NGG-3′)，并且在PAM序列上游選取20 bp序列作為sgRNA結(jié)合序列，共設(shè)計(jì)了4條sgRNA (圖1B，表1)。用雙蒸水將合成好的sgRNA單鏈粉末溶解為100 μmol/L的溶液。配置sgRNA磷酸化和退火的反應(yīng)體系：正義鏈、反義鏈各1 μL，10×T4連接酶緩沖液1 μL，T4 PNK 1 μL，雙蒸水補(bǔ)至10 μL。配置好的體系進(jìn)行磷酸化和退火反應(yīng)，反應(yīng)程序：37℃ 30 min，95℃ 5 min孵育后，每分鐘下降5℃退火，直至25℃。磷酸化退火后的雙鏈片段采用酶切連接一體反應(yīng)體系克隆至pX458質(zhì)粒上，配置酶切連接反應(yīng)體系：pX458 (200 ng/μL) 0.5 μL，退火產(chǎn)物與載體按照200∶1的比例稀釋后加入2 μL，10×BbsⅠ Buffer 2 μL，Ⅰ酶1 μL，T4 Ligase 0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：37℃ 5 min，21℃ 5 min，循環(huán)6次。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，挑取克隆測(cè)序驗(yàn)證。

表1 sgRNA序列

1.3 ssODN設(shè)計(jì)

選擇c.727G>A突變位點(diǎn)左右兩側(cè)各40 nt序列作為同源臂之外，還需將編碼第243位丙氨酸的GCT轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a蘇氨酸的ACT (圖3A)。同時(shí)，為了避免發(fā)生同源重組后的序列被Cas9蛋白再次切割產(chǎn)生堿基插入或刪除，通過同義突變引入188 I酶切位點(diǎn)，既破壞了PAM序列，又便于后續(xù)通過酶切方法檢測(cè)同源重組結(jié)果。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

胰酶消化細(xì)胞后1600 r/min離心3.5 min，用PBS懸浮計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為每100 μL體系有1×106個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后再次離心去上清。加入NeonTM轉(zhuǎn)染試劑盒(Thermo，美國(guó))中的細(xì)胞重懸緩沖液R 100 μL，輕輕吹打均勻后加入10 μg質(zhì)粒和10 μg ssODN，使用NeonTM轉(zhuǎn)染儀，以1450 V、20 ms、2 pulse的參數(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)染完畢，將細(xì)胞加到預(yù)熱的含有10% FBS的RPMI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 流式分選EGFP強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞

電轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，使用Beckman MoFlo Astrios EQs流式細(xì)胞儀分選EGFP陽(yáng)性細(xì)胞。將相同培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞分別用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，先用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，建立分選參數(shù)。用流式細(xì)胞儀分選電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，將EGFP熒光強(qiáng)度最強(qiáng)1%的細(xì)胞群體分選出來，收集到加入適量培養(yǎng)基的24孔板中，37℃培養(yǎng)，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.6 T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)打靶效率

目的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后重新退火形成異源雙鏈DNA，T7核酸內(nèi)切酶1 (T7 endonuclease 1, T7E1)能夠識(shí)別并切割不完全匹配的雙鏈DNA，利用這個(gè)性質(zhì)可以鑒定CRISPR/Cas9編輯形成的突變體，評(píng)估sgRNA打靶效率。PCR產(chǎn)物緩慢降溫退火形成異源雙鏈DNA，500 ng PCR產(chǎn)物加入0.5 μg T7E1酶，37℃孵育30 min。孵育完成后配置10%的PAGE膠，電壓為120 V，電泳時(shí)長(zhǎng)90 min，電泳完成后將PAGE膠在EB中染色15 min。T7E1酶切產(chǎn)物包含擴(kuò)增出來的主要條帶和經(jīng)過酶切后斷裂形成的另外兩條較小的條帶，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，有3條大小不一致的條帶，用ImageJ軟件灰度掃描酶切條帶，根據(jù)公式計(jì)算打靶效率。其中b、c為切割峰面積，a為主峰面積。

1.7 熒光定量PCR與Western blot檢測(cè)

細(xì)胞RNA提取使用TRIzol試劑(Thermo，美國(guó))，用SYBR Green (Thermo，美國(guó))進(jìn)行熒光定量PCR，以、、基因的cDNA序列作為模板，以人的為內(nèi)參，引物序列見表2。

細(xì)胞蛋白提取使用蛋白裂解液RIPA (每毫升RIPA含有10 μL 100×PMSF)吹打細(xì)胞，冰上孵育30 min后，14000×離心5 min取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。定量好的蛋白加入5×SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃、10 min煮沸蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用3% BSA溶液室溫封閉1 h，4℃過夜孵育一抗(abcom 英國(guó))，TBST洗掉一抗孵育二抗(弗德生物杭州)，二抗孵育完畢用TBST洗掉多余二抗，用ECL發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光自顯影儀檢測(cè)蛋白條帶并拍照。

1.8 cAMP值測(cè)定

采用GloSensor cAMP Assay試劑盒(Promega，美國(guó))分析MC1R突變體在配體α-MSH刺激下對(duì)cAMP信號(hào)通路激活能力。其中cAMP含量的測(cè)定主要是依據(jù)人工突變的Photinus pyralis熒光素酶，該熒光素酶在與cAMP結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)光輸出[11]，從而可通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

表2 熒光定量引物序列信息

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGloSensor-22F cAMP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CRISPR/Cas9編輯過的細(xì)胞。當(dāng)6孔板細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行Lipo3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)組125 μL opti-MEM、7.5 μL Lipo3000以及2.5 μg pGloSensor-22F cAMP質(zhì)粒混勻加入單個(gè)孔中，對(duì)照組125 μL opti-MEM和7.5 μL Lipo3000同樣混勻加入單個(gè)孔中。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%時(shí)，將細(xì)胞消化，離心棄上清，加培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使得細(xì)胞濃度為1.5×105cells/mL，將細(xì)胞加入用于多標(biāo)記檢測(cè)的96孔板中，每個(gè)孔加入1.5×104個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。最后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行平衡與檢測(cè)：移除96孔中的培養(yǎng)基，每孔中加入90 μL平衡培養(yǎng)基(88% CO2independent DMEM、10%血清和2% cAMP reagent)，室溫孵育2 h；酶標(biāo)儀測(cè)得每個(gè)孔的穩(wěn)態(tài)值之后，加入α-MSH (0.01 μmol/L)測(cè)定1 h之內(nèi)每個(gè)孔的值，而Forskolin (10 μmol/L)作為陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系穩(wěn)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

定量實(shí)驗(yàn)包括至少3個(gè)獨(dú)立重復(fù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。采用檢驗(yàn)或單因素方差分析，再進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA活性篩選

將靶向基因c.727G>A位點(diǎn)附近區(qū)域的4條sgRNA分別克隆到pX458載體中，轉(zhuǎn)染人類黑色素瘤細(xì)胞系SK-MEL-2中，培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，可檢測(cè)到一定比例的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(圖2A)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞儀分選出綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的1%的細(xì)胞群體，提取基因組，PCR擴(kuò)增，通過T7E1酶切實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sgRNA相應(yīng)位點(diǎn)的打靶活性。ImageJ軟件灰度掃描酶切條帶，利用公式計(jì)算得出，sgRNA1、sgRNA2、 sgRNA3、sgRNA4 的活性分別為40.6%、9.1%、50.9%、50.5% (圖2B)，選擇效率最高的sgRNA3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 A243T點(diǎn)突變效率鑒定

根據(jù)sgRNA3切割位點(diǎn)，設(shè)計(jì)攜帶c.727G>A突變的ssODN (圖3A)。將sgRNA3/Cas9表達(dá)載體和ssODN共轉(zhuǎn)染到人類黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-2中，培養(yǎng)24 h后，可以觀察到一定比例的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(圖3B)。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式分析與分選。流式分析結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞比例為43.1%，流式分選出熒光最強(qiáng)的1%的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖3B)。分選出的細(xì)胞一部分以單個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中進(jìn)行單克隆細(xì)胞株篩選，另一部分接種至24孔板中用于分子鑒定與功能分析。24孔板中的細(xì)胞擴(kuò)繁后，取部分細(xì)胞提取基因組，PCR擴(kuò)增靶序列，克隆至T載體，轉(zhuǎn)化后挑選細(xì)菌克隆進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)定的30個(gè)克隆中，發(fā)生第243位編碼位點(diǎn)的堿基插入或刪除突變的有18個(gè)，效率為60%；基因發(fā)生c.727G>A突變的有3個(gè)，效率為10% (圖3C)。96孔板培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到12孔板時(shí)，最終獲得6個(gè)單克隆細(xì)胞株，提取單克隆細(xì)胞株的基因組，PCR擴(kuò)增后連接T載體測(cè)序，沒有篩選出目標(biāo)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰的細(xì)胞株，6個(gè)單克隆細(xì)胞株的基因僅在目標(biāo)位點(diǎn)周圍出現(xiàn)套峰(圖3D)。由于分選在24孔板的細(xì)胞編輯總效率為70%，后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用該混合細(xì)胞群進(jìn)行。

2.3 基因編輯對(duì)MC1R分子表達(dá)水平的影響

擴(kuò)大培養(yǎng)總編輯效率為70%的混合細(xì)胞群，添加配體α-MSH，檢測(cè)混合細(xì)胞群和未編輯細(xì)胞的MC1R蛋白表達(dá)情況?；旌霞?xì)胞群基因的mRNA和蛋白水平均顯著下降(圖4，B和C)，表明在基因第243位密碼子附近發(fā)生核苷酸替換、插入或刪除可能破壞基因的正常表達(dá)。

2.4 編輯MC1R對(duì)cAMP-PKA信號(hào)通路的影響

為測(cè)定編輯后的基因?qū)AMP-PKA信號(hào)通路激活的影響，在混合細(xì)胞群和未編輯的細(xì)胞中添加配體α-MSH，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP含量、轉(zhuǎn)錄因子和催化酶的表達(dá)。采用GloSensor cAMP Assay試劑盒測(cè)定細(xì)胞中cAMP含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在配體α-MSH刺激下，未編輯細(xì)胞中cAMP含量從本底水平呈指數(shù)級(jí)上升，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸達(dá)到平臺(tái)期，并緩慢下降。而發(fā)生基因編輯的細(xì)胞群中，cAMP含量基本維持在本底水平，遠(yuǎn)低于對(duì)照(<0.001) (圖4A)。定量PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，cAMP-PKA通路下游的和表達(dá)量均發(fā)生顯著性下降(圖4，B和C)，表明編輯基因可顯著削弱黑色素細(xì)胞的cAMP-PKA信號(hào)通路激活功能，從而下調(diào)黑色素合成調(diào)控的小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，以及催化黑色素合成的酪氨酸酶的表達(dá)，進(jìn)而影響動(dòng)物的毛色表型。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光圖與sgRNA活性篩選

A：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后拍照；B：T7E1驗(yàn)證sgRNA效率(紅色箭頭表示酶切條帶)。

3 討論

本研究中靶向基因的sgRNA3效率為50.9%，基因發(fā)生c.727G>A突變的效率為10%，其同源重組效率與本研究團(tuán)隊(duì)前期在其他細(xì)胞系中獲得的效率相當(dāng)[12]，然而此次培養(yǎng)獲得的6個(gè)單克隆細(xì)胞株中卻未鑒定到發(fā)生c.727G>A突變的細(xì)胞株，表明仍需通過優(yōu)化參數(shù)來提高同源重組效率，從而篩選得到預(yù)期突變的單克隆細(xì)胞株。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物基因打靶系統(tǒng)中，ssODN的長(zhǎng)度與重組效率有極高的依賴關(guān)系[13,14]，而本研究中使用的ssODN長(zhǎng)度僅80 nt，可能不是最優(yōu)長(zhǎng)度，今后可通過合成不同長(zhǎng)度的ssODN，篩選重組效率最高的ssODN用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，ssODN與配對(duì)片段相比每增加0.6%的錯(cuò)配堿基，重組效率會(huì)降低20倍[14]，本研究使用的ssODN含有3個(gè)錯(cuò)配堿基造成同源重組效率較低，因此設(shè)計(jì)ssODN時(shí)應(yīng)減少錯(cuò)配堿基個(gè)數(shù)。此外，雙鏈斷裂后真核細(xì)胞中KU70和KU80形成的異二聚體與切割的DNA末端結(jié)合可促進(jìn)非同源末端連接，抑制KU70和DNA連接酶IV的活性可使同源重組的效率提高4～5倍[15]，同時(shí)添加小分子RS1可刺激雙鏈交換[16]，提高重組效率。應(yīng)用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選單細(xì)胞過程中，應(yīng)把前向散射光(forward scatter, FSC)和側(cè)向散射光(side scatter, SSC)參數(shù)發(fā)生變化的細(xì)胞排除，減少狀態(tài)不佳的細(xì)胞。在單細(xì)胞培養(yǎng)過程中，補(bǔ)充谷氨酰胺促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[17]。通過以上方法可以最大限度提高同源重組的效率和篩選到目標(biāo)單克隆細(xì)胞株的效率。

圖3 ssODN結(jié)構(gòu)示意圖、流式分選GFP陽(yáng)性細(xì)胞、編輯效率檢測(cè)以及單克隆細(xì)胞株測(cè)序

A：ssODN和sgRNA示意圖，設(shè)計(jì)ssODN需利用同義突變引入188 I酶切位點(diǎn)；B：細(xì)胞轉(zhuǎn)染與流式分析；C：T-A克隆測(cè)定編輯效率；D：?jiǎn)慰寺〖?xì)胞株基因測(cè)序結(jié)果。

圖4 MC1R基因表達(dá)和cAMP-PKA信號(hào)通路強(qiáng)度檢測(cè)

A：細(xì)胞中cAMP值測(cè)定；B：mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；C：蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)；**:<0.01, ***:<0.001。

腫瘤細(xì)胞染色體拷貝數(shù)通常比較復(fù)雜，個(gè)別染色體有可能發(fā)生從亞二倍體到超四倍體的變異[18]。與豬不同，人類的基因定位在16號(hào)染色體上，測(cè)序結(jié)果顯示6個(gè)單克隆細(xì)胞株的基因并沒有2種以上的編輯結(jié)果(圖3D)，推測(cè)本研究使用的人類黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-2的基因是正常的二拷貝，與野豬和杜洛克豬的基因拷貝數(shù)相同?；蛲蛔兪请[性突變[19]，等位基因的隱性突變導(dǎo)致MC1R蛋白數(shù)量與功能上喪失，沒有足夠數(shù)量的cAMP激活下游信號(hào)通路，酪氨酸酶數(shù)量減少，導(dǎo)致褐黑素?zé)o法完成真黑素的轉(zhuǎn)化，這種突變已在栗色馬、黃色的B6小鼠()、人類的紅發(fā)與白皙皮膚中得到相關(guān)的證明[20]。

本研究分選獲得基因編輯細(xì)胞群中c.727G>A突變的占10%，在第243位氨基酸編碼區(qū)發(fā)生Indel突變占60%，總編輯效率為70%，該基因編輯混合細(xì)胞群適用于分析MC1R蛋白功能缺失對(duì)下游分子的影響。MC1R蛋白是A類G蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員[4]，第243位疏水性的丙氨酸位于第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)結(jié)束與第6個(gè)α螺旋開始的交界處。當(dāng)其被親水性的蘇氨酸替代時(shí)，α螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響第5和第6個(gè)跨膜螺旋間的胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，該胞內(nèi)環(huán)上含有G蛋白結(jié)合位點(diǎn)，這可能影響MC1R與G蛋白的結(jié)合?；虻?43位編碼區(qū)核苷酸的刪除，導(dǎo)致MC1R蛋白翻譯提前終止，形成截短型的突變體。這兩種突變形式都影響了MC1R蛋白受體胞內(nèi)與G蛋白結(jié)合，配體α-MSH刺激下，突變的MC1R蛋白受體不能使G蛋白活化，從而影響細(xì)胞內(nèi)cAMP生成和下游信號(hào)通路的激活[4,21,22](圖5)。酪氨酸酶濃度較低時(shí)，不能催化多巴醌生成真黑素，而是在谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的作用下生成褐黑素[23]，褐黑素為溶于堿的圓形紅色顆粒，能使皮膚或毛發(fā)表現(xiàn)為紅色或黃色。

圖5 MC1R突變體對(duì)cAMP-PKA通路影響

左：未編輯的細(xì)胞；右：基因編輯的細(xì)胞。

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Editingin human melanoma cells by CRISPR/Cas9 and functional analysis

Chong Zhang, Zixuan Wei, Min Wang, Yaosheng Chen, Zuyong He

(melanocortin 1 receptor) encodes the melanocortin-1 receptor, which can activate intracellular cAMP synthesis under the stimulation of the α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) ligand. Increased cAMP then activates the protein kinase A (PKA) pathway, resulting in the up-regulation of the expression of the microphthalmia-associated transcription factor (MITF) which is a critical regulatory factor of melanin synthesis, and tyrosinase (TYR), the rate-limiting enzyme of melanin synthesis tyrosinase (TYR), and ultimately affects production of eumelanin and pheomelanin, and the coat color phenotype of mammalian species. Previous reports have indicated that the mutation A243T in the transmembrane domain 6 (TM6) of MC1R protein might disrupt the function of MC1R, contributing to the red phenotype in Duroc pig. However, functional analysis of the A243T mutation in MC1R has not yet been carried out. In this study, we attempted to used single-stranded oligo-deoxyribonucleotides (ssODN) as donor templates to introduce the c.727G>A (A243T) mutation intoin human melanoma cell line SK-MEL-2 by CRISPR/Cas9 to analyze its effects on MC1R functions. We found the occurrence of ssODN recombination reached to 10%. Unfortunately, Sanger sequencingin six single-cell clones revealed that none carried the c.727G>A mutation, but all carried undesired mutations surrounding the target site. Cells transfected with CRISPR/Cas9 plasmids and ssODN presented significantly attenuated cAMP activation, and down-regulatedandexpression, indicating that the editingcould affect the melanin synthesis function in cells. This study provides a basis for further investigation the mechanism ofmutation on animal coat color.

;site-directed mutagenesis; CRISPR/Cas9; A243T

2022-03-07;

2022-05-11;

2022-06-07

廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2018B020203003)，廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2019A1515011134)資助[Supported by the Key R&D Program of Guangdong Province (No. 2018B020203003), and the Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2019A1515011134)]

張充，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: zhangch359@mail2.sysu.edu.cn

何祖勇，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物遺傳與育種。E-mail: zuyonghe@foxmail.com

10.16288/j.yczz.22-037

(責(zé)任編委: 谷峰)