水溶性聚苯胺的制備及其在腫瘤光熱療法中的應用

李國梁,李 浩,王 瑋,陳克正

(青島科技大學 材料科學與工程學院,山東 青島266042)

光熱治療(PTT)是在近紅外激光照射下,通過光熱治療劑將光能轉化為熱能,達到一定溫度后(一般為48 ℃以上)殺死腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤的目的。光熱治療劑是能夠將光能轉化為熱能的物質,使腫瘤區(qū)域急劇升溫,達到熱消融的目的[1-2]。理想的光熱治療劑應該具備在近紅外區(qū)有強烈吸收、良好的生物相容性、較高的光熱轉化效率等特點[3-4]。目前,研究者們已開發(fā)出多種光熱治療劑,如貴金屬類的金納米顆粒[5-7]、碳基材料類的碳納米管[8-9]、半導體類的硫屬銅基納米顆粒[10-12]、有機光熱材料[13]等。

另外,研究較多的有機光熱治療劑主要有聚吡咯等共軛高分子聚合物[13]、近紅外染料類材料[14]、卟啉脂質體[15]等。然而,大部分的有機光熱材料水溶性較差,需要通過聚乙二醇(PEG)等親水性生物分子的修飾以此增強其在水環(huán)境中的分散性,這一過程可能會引入外在的潛在毒性[16-17]?；谝陨峡紤],本工作通過一種仿酶綠色合成工藝合成了水溶性聚苯胺(PANI)并探究其在腫瘤的光熱治療方面的應用。

1 實驗部分

1.1 實驗材料及儀器

雙氧水,分析純(30%),萊陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠;聚苯乙烯磺酸鈉,分析純,上海喜潤化學工業(yè)有限公司;苯胺單體,分析純(98%),阿法埃莎(中國)化學有限公司;聚乙烯吡咯烷酮,分析純,上海埃彼化學試劑有限公司;無水乙醇,分析純(＞99.0%)萊陽經(jīng)濟開發(fā)區(qū)精細化工廠;氯化亞鐵,分析純,天津市博迪化工有限公司;乙二醇,分析純,天津市瑞金特化學品有限公司;次亞磷酸鈉,分析純,上海埃比化學試劑有限公司;二甲亞砜(DMSO),分析純,北京索萊寶科技有限公司;3-(4,5)-雙甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑藍,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司;DMEM 培養(yǎng)基,生化試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;胎牛血清,生化試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;L-谷氨酰胺,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司;青鏈霉素,生化試劑,北京索萊寶科技有限公司。

高壓釜,50 m L 上海安譜科學儀器有限公司;動物血細胞分析儀,XFA6030型,中國普朗醫(yī)療有限公司;活細胞工作站,DMI6000B 型,德國Leica公司;傅里葉紅外光譜儀(FTIR),VERTEX70 型,德國Bruker公司;紫外-可見-近紅外分光光度計,Cary500型,美國Varian公司;紅外功率可調激光發(fā)射器,T808D3W 型,西安銘輝廣電科技有限公司;酶標儀,Model 680型,美國Bio Rad公司;熒光顯微鏡,Eclipse TE2000S型,日本Nikon公司。

實驗涉及的細胞系:人肝癌細胞系Hep G2(實驗室自有),小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3(實驗室自有)。

實驗動物:Balb/c裸鼠(雌性,4～6周齡,20 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司,北京)。相關動物實驗操作程序均是在有動物實驗資質的實驗室完成的,獲得相關實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 磷酸鐵模擬酶的制備

分別用電子天平準確稱取5 g H2O、50 g乙二醇、1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),將去離子水和乙二醇緩慢滴加到盛有PVP的潔凈燒杯中,同時使用磁力攪拌器攪拌溶解;再準確稱取1.689 g FeCl2·H2O和1.317 g的Na H2PO2·H2O 倒入上述攪拌好的溶液中,繼續(xù)攪拌至溶解;然后將溶液轉移到高壓反應釜的聚四氟乙烯內襯中密封,置于恒溫烘箱中在180 ℃下反應6 h;取出反應釜冷卻;打開反應釜對產(chǎn)物進行離心收集并通過去離子水和乙醇洗滌,離心;然后將產(chǎn)物用乙醇分散,置于鼓風干燥箱中60℃干燥,即可得到磷酸鐵模擬酶。

1.3 PANI的制備

準確稱取0.124g聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶解于20 m L緩沖液,于冰水浴中攪拌30 min后,加入0.056 g苯胺單體,攪拌10 h后加入5 mg自制的磷酸鐵模擬酶,再用移液槍準確移取0.6 m L 物質的量濃度為1 mol·L－1的雙氧水溶液,在室溫下反應24 h后,將反應液離心以去除磷酸鐵模擬酶,上清液轉移入截留相對分子質量為8 000～14 000的透析袋中,在p H＝5的鹽酸溶液中透析24 h,更換透析液后再次透析24 h,將透析袋內的溶液于40℃下真空干燥,獲得產(chǎn)物PANI。

1.4 MTT法體外細胞相容性評價

MTT 法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理是活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶可以將外源性的噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)還原為水不溶性的藍紫色甲臜并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm 波長處測定其光吸收值(OD 值),可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內,MTT 結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

將材料與細胞共培養(yǎng)24 h,隨后將培養(yǎng)板取出倒掉培養(yǎng)液,在培養(yǎng)板的所有孔上加入20μL 的5 mg·m L－1的噻唑藍溶液;培養(yǎng)4 h后,倒掉噻唑藍溶液,用酶標儀測定各孔在490 nm 處的OD 值;向每個孔中加入150μL DMSO,使用恒溫振蕩器低速振蕩10 min,待結晶物質充分溶解后再測定各孔在490 nm 處的OD 值。以兩次吸光度的差值作為細胞相對存活量,通過加入材料和未加材料的培養(yǎng)孔的吸光度之比確定各組的相對細胞存活率。

1.5 光熱療法體外效果評價

用細胞培養(yǎng)液(DMEM 培養(yǎng)基中含10%胎牛血清)在培養(yǎng)面積25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)Hep G2細胞。待細胞密度達到80%～90%時,將Hep G2細胞轉移到96孔培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng);將96孔培養(yǎng)板上分為相同的4 個區(qū)域,設置為control組,PANI-only組,PTT-only組,PANI-PTT 組。將滅菌后的PANI用新鮮的細胞培養(yǎng)液稀釋為100 μg·m L－1,用含有PANI的培養(yǎng)液在37℃,5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中與HepG2細胞共培養(yǎng)6 h;去除多余PANI,用磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗3次。其中PTT-only組和PANI-PTT 組細胞經(jīng)808 nm 激光(2 W·cm－2)照射5 min;光照結束后,立即給4組加入MTT,進行細胞存活率測定。

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1.6 體內光熱抑瘤實驗

四周齡Balb/c雌性裸鼠,放入三級無特定病原體動物(SPF)房飼養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2,細胞生長至對數(shù)生長期時,胰酶常規(guī)消化,離心收集細胞并對細胞進行計數(shù)。采用生理鹽水溶解細胞團,并稀釋細胞濃度至1×108個·m L－1。取200μL即2×107個細胞接種于每只裸鼠的前肢腋下,觀察細胞接種后的生長狀況。

待腫瘤大小接近200 mm3時,將裸鼠分為PBS對照組、PANI-only組、Laser-only組和PANI-PTT組,每組10只模型動物。隔天原位給藥200μL(2 mg·m L－1),給藥3次,隔日測量體重、腫瘤體積和死亡情況。

2 結果與討論

2.1 PANI的成分分析

由圖1可知:3 432 cm－1處的峰,是由－NH2非對稱伸縮振動引起的;1 600 cm－1處的峰,是NQN伸縮振動引起的;1 496 cm－1處的峰,是苯環(huán)伸縮振動引起的;1 411 cm－1處的峰,是QBQ 結構中的C—N 伸縮振動引起的;1 006.29 cm－1和1 034 cm－1處的峰,分別是SO 對稱振動和非對稱振動引起的;831 cm－1處的峰,是1,4取代C—H面外彎曲振動引起的,同時說明產(chǎn)物中單體的連接方式為頭-尾相連;670 cm－1處的峰,是由PSS 上的—SO3引起的。綜上所述,實驗中所用的磷酸鐵模擬酶確實具有催化活性,催化合成的產(chǎn)物為聚苯胺和聚苯乙烯磺酸鈉的復合物。

圖1 所合成聚苯胺的FT-IR圖譜和水溶液照片F(xiàn)ig.1 FT-IR spectrum of PANI and photo of PANI in water solution

在不添加穩(wěn)定劑和表面修飾劑的前提下,當PANI在水溶液中的濃度高達150 mg·m L－1時,仍然能夠在靜置1周后保持澄清且無沉淀產(chǎn)生,由此說明其具有優(yōu)異的水分散性和穩(wěn)定性。

2.2 PANI的體外光熱轉換效率測試

為探討PANI的光熱轉化能力,使用波長為808 nm 近紅外激光對2 m L 不同濃度PANI溶液進行光熱轉換升溫測試,結果見圖2。如圖2(a)所示,當激光功率為1.0 W 時,去離子水的溫度僅升高0.3 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在3.1～7.4 ℃范圍內;當激光功率為1.5 W 時,去離子水的溫度僅升高1.0 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在8.2～18.3 ℃范圍內;當激光功率為2.0 W 時,去離子水的溫度僅升高1.0 ℃,而100～400μg·m L－1的PANI水溶液的溫升在12.2～27.9 ℃范圍內。測試結果表明,PANI水溶液在808 nm 激光照射下的升溫幅度明顯大于去離子水的升溫幅度。當PANI水溶液濃度達到300μg·m L－1時,再升高PANI的濃度(400μg·m L－1),PANI升溫已經(jīng)不隨濃度發(fā)生太大變化,說明PANI的升溫已經(jīng)達到飽和。

比較光熱轉換材料的光熱轉換能力,需要通過光熱轉換效率來比較,本研究利用公式式(1)～(5)對PANI的光熱轉換效率進行了測試和計算。其中,η為聚吡咯的光熱轉換效率,Tmax為聚吡咯溶液或水的最大溫度,Tsurr為環(huán)境溫度,A808為聚吡咯溶液在808 nm 處的吸光度,Qdis為環(huán)境所散發(fā)的熱量,C為水的比熱容,T為聚吡咯溶液或水在測溫時的實時溫度,m為溶液質量,t為時間,I為激光功率。

2 m L PANI水溶液在808 nm 激光照射下的升溫降溫曲線見圖2(b),UV-Vis-NIR 的吸收光見圖2(c)?？梢运愠鯬ANI 的光熱轉換效率達到39.6%,具有良好的光熱轉換效率。

2.3 PANI的生物相容性評價

PANI的生物相容性評價結果如圖3所示,PANI濃度在低于1μg·m L－1時,細胞存活率高于90%,在低于10μg·m L－1時,細胞相對存活率高于80%,當PANI質量濃度為100μg·m L－1時,兩種細胞的相對存活率高于75%。從腫瘤細胞和正常細胞的比較來看,PANI對兩種細胞的生長抑制沒有顯著性差異。

圖3 聚苯胺對不同細胞的細胞毒性Fig.3 Cell viability of different kinds of cells after being incubated with various concentrations of PANI

2.4 定量評價PANI的光熱細胞毒性

采用MTT 法評價PANI的光熱細胞毒性,結果如圖4所示。

圖4 PANI的光熱細胞毒性Fig.4 Photothermal cytotoxicity of PANI

與PANI共培養(yǎng)的細胞經(jīng)照射后細胞存活率為40%,而未添加材料的細胞存活率近80%。盡管實驗使用的PANI濃度只有100μg·m L－1,在激光照射(808 nm,2 W·cm－2)5 min后,能夠非常有效地抑制腫瘤細胞的增殖。

2.5 PANI裸鼠腫瘤模型體內抑瘤效果評價

圖5 為光熱治療后Balb/c裸鼠的體重監(jiān)測。從圖5可以發(fā)現(xiàn),經(jīng)過3周的治療,各組模型小鼠的體重變化波動不明顯,沒有顯著性的差異,說明相關實驗沒有對小鼠產(chǎn)生明顯的刺激,其進食和代謝正常進行。

圖5 光熱治療后Balb/c裸鼠的體重監(jiān)測Fig.5 Body weight change of Balb/c mice after PTT

經(jīng)常3周多的治療,抑瘤曲線變化明顯,如圖6所示。PBS對照組的腫瘤呈現(xiàn)指數(shù)增長,3周后腫瘤相當于接種時腫瘤的36倍;PANI-only組和Laser-only組的腫瘤生長也非常迅速,最終的腫瘤大小接近初始腫瘤的32倍,并未抑制住腫瘤的生長。PANI-PTT 組的腫瘤生長較為緩慢,2周時腫瘤體積約為初始體積的4倍,而3周時的腫瘤體積約為初始體積的3.8倍。實驗可以發(fā)現(xiàn)PANI介導的光熱治療能有效抑制腫瘤生長,體現(xiàn)出良好的光熱治療性能。

圖6 腫瘤體積的生長曲線Fig.6 Curves of tumor volume growth

在進行一次完整的激光照射實驗后,繼續(xù)對模型小鼠的存活情況進行2周的記錄,結果如圖7所示。PBS對照組在第4 周時模型小鼠開始陸續(xù)死亡,在第35 d時全部死亡;PANI-only組和Laseronly組的模型小鼠也死亡較快,在第35 d的存活率分別為33%和15%,而PANI-PTT 組在第5周時存活率仍高達83%。以上體內治療結果證明PANI能作為一種新型的光熱治療劑用于腫瘤的治療。

圖7 Balb/c裸鼠生存率隨時間變化曲線Fig.7 Survival curves of Balb/c nude mice

3 結 論

1)所合成的聚苯胺(PANI)具有良好的水溶性,當其在水溶液中的濃度高達150 mg·m L－1時,在靜置1周后仍然保持澄清且無沉淀產(chǎn)生。

2)實驗合成的PANI在近紅外區(qū)域有較強吸收,能將光能高效的轉化為熱能,具有優(yōu)秀的光熱轉換性能。實驗結果顯示,PANI的光熱轉換效率高達39.6%。

3)MTT 實驗結果顯示:PANI具有較低的生物毒性,證明PANI具有優(yōu)秀的生物相容性。MTT實驗和模型小鼠活體實驗等體內外抑瘤實驗結果均顯示PANI具有良好的抑瘤效果,作為光熱治療劑能快速殺滅癌細胞和消融腫瘤,在2周內未見腫瘤復發(fā),PANI-PTT 組的小鼠存活率為83%。