巨噬細(xì)胞缺氧/復(fù)氧及M2型極化對小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制

索森森，李愛琴，原玲玲，李世朋，毋領(lǐng)娟，柴文文，宰嬌嬌，郭 鵬

(焦作市人民醫(yī)院心內(nèi)科，河南 焦作 454000)

缺血性心臟病主要表現(xiàn)為急性ST段抬高型心肌梗死，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病最嚴(yán)重的類型之一，在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出高病死率和高致殘率的特點(diǎn)[1]。缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)可對心肌細(xì)胞造成不可逆的損傷，即心肌IR損傷[2]。目前，心肌IR損傷的確切病理生理學(xué)機(jī)制仍不清楚。心肌梗死后梗死區(qū)域有明顯的白細(xì)胞浸潤，心肌梗死后1 h白細(xì)胞即可釋放促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6，3～5 d后炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡仔迯?fù)反應(yīng)[3]。在心肌梗死早期，雖然炎癥反應(yīng)可發(fā)揮抗心肌損傷的作用，但長期的炎癥反應(yīng)可能會通過促進(jìn)左心室擴(kuò)張和過度瘢痕形成而損害左心室的收縮與舒張功能[4]。因此，及時(shí)糾正促炎與抗炎失衡是保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞的關(guān)鍵。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在不同微環(huán)境中可被誘導(dǎo)極化為促炎型(M1表型)和抗炎型(M2表型)巨噬細(xì)胞，發(fā)揮損害/保護(hù)心肌細(xì)胞作用，決定著炎癥的發(fā)生發(fā)展方向[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑、血管生成及穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境[6-7]?；诖耍狙芯客ㄟ^缺氧/復(fù)氧處理巨噬細(xì)胞模擬心肌IR損傷的發(fā)生環(huán)境，探討心肌IR損傷環(huán)境下IL-10所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2表型極化對心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自中國上海賽默飛世爾科技公司；IL-1β、TNF-α、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor,TGF)-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自中國上海拜力生物科技有限公司，人膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧迪醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀購自上海賽默飛世爾科技公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購自上海拜力生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組小鼠巨噬細(xì)胞和小鼠心肌細(xì)胞均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素雙抗的DMEM中。根據(jù)培養(yǎng)條件，將小鼠巨噬細(xì)胞分為對照組(A組)、缺氧/復(fù)氧組(B組)、IL-10組(C組)，將小鼠心肌細(xì)胞分為對照組(D組)、缺氧/復(fù)氧組(E組)、缺氧/復(fù)氧+IL-10組(F組)。

A組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)21%O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；B組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)3%～5%O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；A組和B組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后置于含體積分?jǐn)?shù)21%O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后分別倒出A組和B組巨噬細(xì)胞上層培養(yǎng)基，1 000 r·min-1離心3 min，取上清液和細(xì)胞備用。C組巨噬細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)21%O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，使用含終質(zhì)量濃度 50 mg·L-1IL-10 新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，然后收集培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞備用[7]。

小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)21%O2、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中；將A組培養(yǎng)基上清液和新鮮完全培養(yǎng)基等體積混合培養(yǎng)D組心肌細(xì)胞，將B組培養(yǎng)基上清液和新鮮完全培養(yǎng)基等體積混合培養(yǎng)E組心肌細(xì)胞，將B組和C組培養(yǎng)基上清液等體積混合培養(yǎng)F組心肌細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD86、精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)、CD206 mRNA相對表達(dá)量取制備好的A組、B組和C組巨噬細(xì)胞，根據(jù)TRIzol試劑盒說明書提取總RNA。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中說明書進(jìn)行操作。將cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系20 μL：TB Green Premix Ex Taq 10.0 μL,上下游引物各0.4 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s,共行40個(gè)循環(huán)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGG-3′；iNOS上游引物序列為5′-AACAGGGAGAAAGCGCAAAA-3′，下游引物序列為5′-CCTCACATACTGTGGACGGG-3′；CD86上游引物序列為5′-ACTTACGGAAGCACCCACGTG-3′，下游引物序列為5′-TTGTAAATGGGCACGGCAGA-3′；Arg-1上游引物序列為5′-AGCCAGGGACTGACTACCTTA-3′，下游引物序列為5′-TTGGGAGGAGAAGGCGTTTGT-3′；CD206上游引物序列為5′-AGTCAGAACAGACTGCGTGGA-3′，下游引物序列為5′-CCAGAGGGATCGCCTGTTCTG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 ELISA法檢測巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量使用IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β ELISA檢測試劑盒和酶標(biāo)儀檢測A組、B組、C組以及B組和C組等體積混合上清液(B+C組上清液)中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白水平，嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。以所測標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程，將A組、B組、C組、B+C組樣品的吸光度值代入直線回歸方程，得出各組IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞凋亡情況收集D組、E組、F組培養(yǎng)24 h的心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109L-1，取100 μL心肌細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心3 min，取沉淀物，預(yù)冷PBS沖洗3次，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合均勻，室溫、避光靜置15 min，加入1×Binding buffer緩沖液195 μL，使用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 A組、B組和C組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1。B組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組巨噬細(xì)胞中Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與C組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 A組、B組和C組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86、Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量比較

2.2 A組、B組、C組和B+C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2。B組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組，IL-10、TGF-α蛋白相對表達(dá)量顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中TGF-α蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B+C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量顯著低于B組，IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組與C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 A組、B組、C組和B+C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量比較

2.3 D組、E組和F組心肌細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖1。D組、E組、F組心肌細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為(18.76±1.11)%、(31.72±1.03)%、(20.51±1.02)%。E組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。F組心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 D組、E組和F組心肌細(xì)胞凋亡情況

3 討論

巨噬細(xì)胞作為外周循環(huán)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體受損時(shí)發(fā)揮介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、清除死亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片、損傷修復(fù)等功能[8]。巨噬細(xì)胞在心肌損傷和損傷修復(fù)中發(fā)揮多種作用，靜息狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞可分別向M1表型和M2表型極化，M1型極化的巨噬細(xì)胞可持續(xù)產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，形成促炎環(huán)境，增加心肌梗死面積；M2型極化的巨噬細(xì)胞可清除死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片，抑制胰島素抵抗，促進(jìn)心臟組織的重塑和再生[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死后1～3 d 內(nèi)M1型極化的巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，釋放如TNF-α、IL-1β等促炎因子，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷；5 d后M2型巨噬細(xì)胞在炎癥消退過程中逐漸占主導(dǎo)地位，分泌IL-10、TGF-β等抗炎細(xì)胞因子，促進(jìn)組織修復(fù)、重塑、血管生成及穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境[10-12]。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化方向有可能是治療心肌梗死的潛在靶點(diǎn)。

巨噬細(xì)胞的極化是由靶器官周圍微環(huán)境的生理病理信號調(diào)控的，例如細(xì)胞因子、生長因子以及病原相關(guān)的分子模式等[13]。干擾素-γ、脂多糖和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型極化，M1型巨噬細(xì)胞被激活后產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12)、膜表面蛋白(CD80和CD86)、活性氧和活性氮[14]。CD86、iNOS為M1型巨噬細(xì)胞極化的直接標(biāo)記蛋白；促炎因子IL-1β、TNF-α為M1型巨噬細(xì)胞極化的間接標(biāo)志物，主要參與巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。免疫復(fù)合物、補(bǔ)體、凋亡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，M2型巨噬細(xì)胞的高表達(dá)標(biāo)志物包括膜表面蛋白(CD163、CD206、Arg-1)、抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-10等[15]。 Arg-1、CD206為M2型巨噬細(xì)胞極化的直接標(biāo)記蛋白；抗炎細(xì)胞因子IL-10、TGF-β為M2型巨噬細(xì)胞極化的間接標(biāo)志物，主要發(fā)揮抑制炎癥作用。基于此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組巨噬細(xì)胞中膜表面蛋白iNOS、CD86、Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量，采用ELISA法檢測巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量，以反映缺氧/復(fù)氧及IL-10干預(yù)對巨噬細(xì)胞表型極化的影響。

本研究結(jié)果顯示，B組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量顯著低于A組；B組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組，IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量顯著低于A組，說明缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M1表型極化且釋放大量促炎細(xì)胞因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組與C組巨噬細(xì)胞中iNOS、CD86 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A組與C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C組巨噬細(xì)胞中Arg-1、CD206 mRNA相對表達(dá)量顯著高于A組，C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中TGF-β蛋白相對表達(dá)量顯著高于A組；說明IL-10誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化且釋放大量抗炎細(xì)胞因子。

IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠比較，IL-10基因缺陷小鼠由衰老導(dǎo)致的左心室功能障礙和炎癥反應(yīng)更嚴(yán)重[22]。心肌梗死后使用IL-10治療可降低心肌組織的炎癥反應(yīng)并改善左心室收縮功能[23-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B+C組巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中IL-1β、TNF-α蛋白相對表達(dá)量顯著低于B組，IL-10、TGF-β蛋白相對表達(dá)量顯著高于B組，說明IL-10所誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞釋放了大量抗炎細(xì)胞因子，且抑制了巨噬細(xì)胞缺氧/復(fù)氧所致的炎癥因子表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，E組心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于D組，F(xiàn)組心肌細(xì)胞凋亡率顯著低于E組，說明缺氧/復(fù)氧所致的巨噬細(xì)胞M1型極化促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡，而IL-10誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化抑制了巨噬細(xì)胞缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。原因可能為，IL-10誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子，抑制心臟微環(huán)境炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，IL-10可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化拮抗缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡。未來可將M2型巨噬細(xì)胞極化作為研究心肌I/R損傷的切入點(diǎn)，并繼續(xù)深入探究巨噬細(xì)胞極化在心肌I/R損傷及心功能障礙中的具體作用機(jī)制。