止咳片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

劉 超，喻貴英，羅 偉，昌秦芬，汪 楊，蔣 靜，謝元碧

（太極集團(tuán)重慶桐君閣藥廠有限公司，重慶 401336）

止咳片為潤(rùn)肺定喘、祛痰止咳的良藥，由百部、前胡、苦杏仁組方，臨床主要用于治療咳嗽、痰多、氣喘，以及小兒百日咳、急慢性氣管炎，療效確切。其藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第四冊(cè)）》（標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)WS3?B ?0700 ?91），但僅含性狀鑒別、理化鑒別、前胡薄層鑒別和檢查項(xiàng)，質(zhì)量控制指標(biāo)少。百部作為止咳片組方中的君藥，其味苦、微甘，性微溫，歸肺經(jīng)，具有潤(rùn)肺止咳、殺蟲(chóng)滅虱的功效。百部藥材為百部科植物直立百部Stemona sessilifolia（Miq.）Miq.、蔓生百部Stemona japonica（BL.）Miq.或?qū)θ~百部Stemona tuberosaLour.的干燥塊根［1］。系統(tǒng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，我國(guó)百部屬植物塊根中的總生物堿含量、百部生物堿含量因其品種、產(chǎn)地的不同而有所差異［2］；直立百部與蔓生百部較相似，兩者均與對(duì)葉百部差異較大［3?5］。為更有效控制止咳片質(zhì)量，本研究中基于文獻(xiàn)［1，6］，進(jìn)一步對(duì)百部進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）圖譜研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ML ?304T 型精密電子天平（梅特勒?托利多儀器＜上海＞有限公司）；KQ ?600DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS ?24 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；ZF ?90 型多功能暗箱式紫外投射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；QYSW ?10A型超純水機(jī)（重慶前沿水處理設(shè)備有限公司）；HP ?1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試藥

止咳片（桐君閣藥廠，編號(hào)為1～10）；對(duì)葉百部對(duì)照藥材（批號(hào)121221 ?201604），直立百部對(duì)照藥材（批號(hào)121588 ?201502），苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)110820 ?201808，含量88.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格為100 mm ×200 mm、厚0.20～0.25 mm）；氫氧化鈉硅膠G 薄層板（自制）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為一級(jí)純化水。蔓生百部藥材、對(duì)葉百部藥材均購(gòu)自西藏本草真源中藥資源有限公司，由重慶太極實(shí)業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司楊修齊副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 圖譜研究

2.1.1 蔓生百部、直立百部

蔓生百部、直立百部對(duì)照藥材溶液制備：取蔓生百部藥材、直立百部對(duì)照藥材粉末各1 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加氨試液4 mL，放置30 min，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙?，?5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液制備：取對(duì)葉百部對(duì)照藥材粉末1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL 錐形瓶中，加氨試液4 mL，放置30 min，再加入異丙醇?甲醇（1∶1，V/V）溶液25 mL，超聲（功率300 W，頻率50 kHz，下同）處理30 min，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，濾渣重復(fù)提取1 次，合并濾液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，?0 mL 容量瓶中，加甲醇定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

色譜條件：色譜柱為Agilent ShimNex WR Phenyl-Hexyl 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%三乙胺溶液?乙腈（68∶32，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

特征峰獲?。喝∩鲜? 種對(duì)照藥材溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜（見(jiàn)圖1）。結(jié)果蔓生百部藥材和直立百部對(duì)照藥材溶液的HPLC 圖譜特征峰清晰，分離良好，而對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液的HPLC圖譜特征峰不明顯。結(jié)果表明，該色譜條件僅適用于蔓生百部及直立百部圖譜的特征峰獲取。

2.1.2 對(duì)葉百部及樣品

1）對(duì)葉百部

色譜條件：色譜柱同2.1.1 項(xiàng)，流動(dòng)相為0.1% 三乙胺溶液（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)90%A →60%A，10～20 min時(shí)60%A →50%A，20～40 min時(shí)50%A →25%A），蒸發(fā)光檢測(cè)器（漂移管溫度105 ℃，氣流量3.0 mL/ min），流速為1.0 mL/ min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

特征峰獲取：取對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液適量，按2.1.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液HPLC 圖譜中3 個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及可變范圍見(jiàn)表1；以峰3（對(duì)葉百部堿）為指標(biāo)成分峰。

表1 對(duì)葉百部3個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及可變范圍Tab.1 Relative retention time and variable range of the three characteristic peaks in Stemona japonica

1.原百部堿A.對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液 B.蔓生百部對(duì)照藥材溶液 C.直立百部對(duì)照藥材溶液圖1 3種對(duì)照藥材高效液相色譜圖1.ProtostemonaA.Reference medicinal materials of Stemona japonica B.Reference medicinal materials of Stemona sessilifolia C.Reference medicinal materials of Stemona tuberosaFig.1 HPLC chromatograms of three reference medicinal materials

2）樣品

溶液制備：取對(duì)葉百部藥材樣品適量，按2.1.1 項(xiàng)下對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液制備方法制得藥材樣品溶液。取樣品粉末2.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，以70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液1。按止咳片工藝和處方制備缺百部的陰品樣品，同供試品溶液1 制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

特征峰獲?。喝∩鲜? 種溶液及2.1.1 項(xiàng)下對(duì)葉百部對(duì)照藥材溶液，按2.1.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明對(duì)照藥材溶液、藥材樣品溶液和樣品溶液的HPLC 圖譜雖基本一致，但該色譜條件不適用于對(duì)葉百部藥材及制劑的質(zhì)量控制。詳見(jiàn)圖2。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇?水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取苦杏仁苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇，制成每1 mL 含98.96 μg 苦杏仁苷對(duì)照品溶液。取樣品20 片，除去包衣，研細(xì)，取0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液2。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下2 種溶液及2.1.2 2）項(xiàng)下陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果理論板數(shù)以苦杏仁苷峰計(jì)不低于5 000，供試品溶液色譜在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，專(zhuān)屬性良好。詳見(jiàn)圖3。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液4，6，8，10，12，15，20 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得苦杏仁苷回歸方程Y=945.488 4X?6.959 9（r=0.999 98，n=7）。結(jié)果表明，苦杏仁苷進(jìn)樣量在0.395 84～1.979 20 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

1.對(duì)葉百部堿A.對(duì)照藥材溶液 B.藥材樣品溶液 C.供試品溶液1 D.陰性對(duì)照品溶液圖2 對(duì)葉百部藥材及制劑的高效液相色譜圖1.TuberostemonineA.Solution of reference medicinal materials B.Sample solution of medicinal materials C.Test solution 1 D.Negative reference substanceFig.2 HPLC chromatograms of medicinal materials and preparations of Stemona tuberosa

1.苦杏仁苷A.對(duì)照品溶液 B.供試品溶液2 C.陰性對(duì)照品溶液圖3 止咳片的高效液相色譜圖1.AmygdalinA.Reference solution B.Test solution 2 C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Zhike Tablets

儀器精密度及中間精密度試驗(yàn)：精密吸取苦杏仁苷對(duì)照品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積，結(jié)果的RSD為0.11%（n=6），表明儀器精密度良好；3 名試驗(yàn)人員分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.07%（n=3），表明中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫下放置0，3.5，7.0，10.5，14.0，17.5，21.0，24.5 h 時(shí)，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為1.73%（n =8），表明室溫下供試品溶液放置24.5 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液6 份，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算苦杏仁苷含量。結(jié)果苦杏仁苷含量的平均值為5.585 mg/g，RSD為0.42%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品粉末約0.25 g，共6份，精密稱(chēng)定，精密加入150.0 μg/ mL 苦杏仁苷對(duì)照品溶液10 mL，混勻，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品各適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算苦杏仁苷含量。結(jié)果苦杏仁苷含量為每片0.34～1.66 mg，平均0.95 mg。詳見(jiàn)表3。隨制劑貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，苦杏仁苷含量逐漸降低，故將制劑的含量限度制定為，每片含苦杏仁以苦杏仁苷計(jì)不得少于0.40 mg。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/片）Tab.3 Results of content determination of amygdalin in the samples（mg/tablet）

3 討論

苦杏仁苷含量測(cè)定研究的預(yù)試驗(yàn)中，考察了207 nm和210 nm 2 種檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm時(shí)峰形更好，苦杏仁苷峰理論板數(shù)更高。對(duì)乙腈?0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V，梯度洗脫），甲醇?水（20∶80，V/V），甲醇?水（18∶82，V/V），甲醇?水（15∶85，V/V）4 種流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明，以甲醇?水（15∶85，V/V）為流動(dòng)相時(shí)分離效果較好，故選取檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相為甲醇?水（15∶85，V/V）。提取溶劑考察了甲醇和70%甲醇，結(jié)果表明70%甲醇提取樣品效果更好，故選擇；對(duì)提取溶劑量、超聲提取功率和提取時(shí)間也進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以25 mL 70%甲醇超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min為宜。

預(yù)試驗(yàn)中對(duì)處方中百部藥材進(jìn)行TLC 鑒別，發(fā)現(xiàn)同一鑒別方法不適用于3 種百部藥材，藥典收載的3 種來(lái)源的百部所含生物堿種類(lèi)差異大，且產(chǎn)地多，同品種不同產(chǎn)地所含的生物堿也不同，很難以同一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒別。建議對(duì)3種基源百部的主產(chǎn)區(qū)樣品分別建立鑒別方法，以便更好地控制制劑質(zhì)量。

綜上所述，該含量檢測(cè)分析方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，耐用性高，可作為止咳片中苦杏仁苷的含量測(cè)定方法。與止咳片原標(biāo)準(zhǔn)相比，本研究中新增了苦杏仁苷含量測(cè)定項(xiàng)目，有助于進(jìn)一步完善止咳片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從而為相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)，以保證其臨床的安全有效使用。