胃復(fù)春片治療胃癌前病變作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

朱秀芳，邱碩程，楊 蘭，何竹涵，王建欣，，李 超△，楊繼章

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017； 3.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院，北京 102218）

胃癌的發(fā)病率在所有癌癥中位列第5，2020年全球死亡人數(shù)約76 萬，居癌癥總死亡人數(shù)的第4 位［1］，遠(yuǎn)高于全球癌癥死亡平均水平。胃癌的病理發(fā)展可經(jīng)慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生的胃癌前病變多個階段［2］。目前認(rèn)為，針對其病因的一級預(yù)防難度較大。而胃癌前病變具有一定的可逆性［3］，以其治療作為胃癌二級預(yù)防的一部分，在胃癌的治療中具有重要的現(xiàn)實意義。胃癌前病變屬中醫(yī)“胃脘痛”“胃痞”范疇，其病位在胃，其本在脾。脾虛基礎(chǔ)上邪氣乘襲，致氣滯中焦、痰阻胃絡(luò)是引起胃癌前病變的重要因素。健脾扶正兼顧理氣、驅(qū)邪護(hù)正是其治療原則。胃復(fù)春片由紅參、香茶菜、麩炒枳殼組方，有健脾益氣、活血解毒、祛邪功效，能有效抑制或逆轉(zhuǎn)脾虛邪滯所致胃癌前病變的病理進(jìn)展和“胃脘痛”“胃痞”的表證。但受限于中藥成分復(fù)雜，其藥理機(jī)制尚未完全闡明。為此，本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測胃復(fù)春片治療胃癌前病變的活性靶點、信號通路及分子基礎(chǔ)，探討其治療胃癌前病變的作用機(jī)制，為其臨床使用和深入開發(fā)提供理論支持［2］?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 活性成分收集和靶點預(yù)測

活性成分收集：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，2.3 版）收集胃復(fù)春片的活性成分［ADME/T篩選參數(shù)設(shè)定為口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18］，并參考2015 年至2021 年香茶菜相關(guān)文獻(xiàn)［4?9］進(jìn)行活性成分補(bǔ)充。

靶點預(yù)測：利用TCMSP 預(yù)測胃復(fù)春片活性成分靶點，并采用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：// www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測文獻(xiàn)報道的活性成分潛在靶點，納入Possibility ＞0.1 的靶點進(jìn)行補(bǔ)充。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/；更新于2020年12月15日）將蛋白靶點轉(zhuǎn)換為基因靶點。

1.2 胃癌前病變疾病靶點收集

以“precancerous lesions of gastric cancer”“dysplasia of gastric mucosa”“intestinal metaplasia”為關(guān)鍵詞，利用Genecards（https：// www.genecards.org，5.8 版，更新于2022 年1 月28 日），OMIM（https：// omim.org/ ，更新于2021 年12 月），DisGeNET（https：//www.disgenet.org/，更新于2021 年5 月4 日），Drugbank（https：// go.drugbank.com/ ，5.1.8 版，更新于2021 年1 月3 日）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，收集胃癌前病變相關(guān)靶點，并整合去除重復(fù)基因。

1.3 活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)建立

利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建中藥?成分?靶點網(wǎng)絡(luò)。將活性成分靶點與疾病靶點導(dǎo)入Venny（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，2.1 版）平臺制作交集靶點韋恩圖，并將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape 構(gòu)建成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)。上述網(wǎng)絡(luò)節(jié)點大小均以節(jié)點度（Degree）加權(quán)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點導(dǎo)入Cytoscape，利用插件Bisogenet 3.0.0 進(jìn)行分析和可視化，借助network analyzer 工具計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點度≥2倍中位數(shù)為條件篩選主要靶點一級PPI網(wǎng)絡(luò)。以節(jié)點度≥54篩選主要靶點互作（二級PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用cytpNCA 工具對主要PPI 網(wǎng)絡(luò)再次進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計算網(wǎng)絡(luò)的介度（Betweenness）、緊密度（Closeness）、LAC、鄰域連通性參數(shù)（Neighborhood Connectivity），以主要參數(shù)介度、緊密度、節(jié)點度同時位于前10%（即介度≥3 643.482、緊密度≥0.517 169、節(jié)點度≥223.6）篩選，得三級PPI 網(wǎng)絡(luò)，最后以次要參數(shù)LAC、鄰域連通性同時不低于其中位數(shù)（即LAC ≥32.63、鄰域連通性≥50）篩選，得到核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。最后以節(jié)點度對節(jié)點的大小和顏色進(jìn)行加權(quán)處理，對核心PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化，節(jié)點越大，顏色越偏向暖色，則說明其參與蛋白相互作用的環(huán)節(jié)越多。

1.5 富集分析

將得到的核心靶點導(dǎo)入Metascape（http：//metascape.org/ gp/ index.html#/ main/ step1，更新于2021 年12 月18 日）進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。其中GO 分析包括細(xì)胞組分（CC）、生物過程（BP）、分子功能（MF），參數(shù)設(shè)置，P＜0.01、最小計數(shù)（Min Overlap）為5、最小富集（Min Enrichment）＞1.5。以Kappa 評分作為層次聚類的相似性指標(biāo)，將相似性＞0.3的子樹條目視為一個簇，以簇內(nèi)統(tǒng)計學(xué)意義最大的項來代表該簇。

1.6 分子對接

將核心靶點與中藥小分子配體相匹配，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點所對應(yīng)的分子配體2D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Chem 3D（20.0.0.41版）軟件，利用其構(gòu)建配體的3D結(jié)構(gòu)并進(jìn)行最小結(jié)合能優(yōu)化，保存為mol2 文件。利用PDB 數(shù)據(jù)庫（http：// www.rcsb.org/）下載核心靶點蛋白受體的3D 結(jié)構(gòu)，通過PyMOL 2.5.2 軟件對靶點蛋白3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水、去配體處理。將處理后的受體導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.7軟件，進(jìn)行加氫處理，保存為pdbqt文件。于AutoDock Tools中設(shè)置配體受體結(jié)合的Grid Box參數(shù)，以AutoDock Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對接，通過PyMOL軟件將結(jié)果可視化并標(biāo)注配體受體的結(jié)合關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 成分分析及成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

共收集活性成分50 個，其中紅參18 個，香茶菜26 個，枳殼6個。匯總得活性成分潛在靶點512個，見表1。中藥?成分?靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1，共包含550 個節(jié)點、1 859條線。

圖1 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Traditional Chinese medicine-components-target networks

表1 胃復(fù)春片活性成分及其靶點Tab.1 Active components and targets of Weifuchun Tablets

2.2 靶點收集及活性成分-靶點-疾病互作網(wǎng)絡(luò)

共獲得胃癌前病變活性靶點2 093 個。韋恩圖發(fā)現(xiàn)208 個共有靶點（見圖2）。成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)圖有246個節(jié)點和347條線（見圖3）。節(jié)點度較大的5個活性成分分別為XCC1，XCC13，ZK2，ZK3，A，面積越大的成分參與的生物功能越多，在胃癌前病變的治療中發(fā)揮的作用越大。

圖2 活性成分-疾病靶點韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of active components-disease targets

圖3 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of components-targets-disease

2.3 胃復(fù)春片治療胃癌前病變PPI 網(wǎng)絡(luò)

依次可得含7 180 個節(jié)點、172 088 條線的一級PPI網(wǎng)絡(luò)，含1 858 個節(jié)點、79 667 條線的二級PPI 網(wǎng)絡(luò)，含133 個節(jié)點、3 162 條線的三級PPI 網(wǎng)絡(luò)，含66 個節(jié)點、1 109 條線的核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)。篩選流程見圖4，節(jié)點度加權(quán)優(yōu)化后核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖5。其中NPM1，

圖4 核心PPI網(wǎng)絡(luò)篩選流程Fig.4 Flow chart of screening PPI network of key targets

圖5 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.5 PPI network of key targets

HSPA5，HNRNPK，YWHAZ，MCM2，HNRNPA1，PABPC1，ILF3，EEF1A1在PPI中發(fā)揮的作用較大。

2.4 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析中，BP 涉及499 個條目、36 個簇，參與包括基因沉默的調(diào)控、mRNA 代謝過程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對DNA 損傷刺激的反應(yīng)、生物節(jié)律過程、病毒過程、mRNA 代謝過程的負(fù)調(diào)控、內(nèi)在凋亡信號通路等過程（圖6 A）；CC 涉及57個條目、16個簇，涵蓋核染色體、核糖核蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、富ficolin ?1顆粒腔等（圖6 B）；MF 涉及87 個條目、21 個簇，包括與細(xì)胞黏附分子、與泛素蛋白連接酶、與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（特異性）、與轉(zhuǎn)錄因子、與組蛋白脫乙?；?、與蛋白激酶等的結(jié)合（圖6 C）。KEGG 通路富集分析中，94 條通路、11 個簇富集有潛在靶點，涉及乙醇成癮（Alcoholism）、細(xì)胞周期（Cell cycle）、前列腺癌（Prostate cancer）、剪接體（Spliceosome）、PI3K ?Akt 信號通路（PI3K ?Akt signaling pathway）、泛素介導(dǎo)的蛋白水解（Ubiquitin mediated proteolysis）等通路（圖6 D）。這些通路與多種癌癥和細(xì)胞異常增殖與表達(dá)有關(guān)。

2.5 分子對接

最終選取ESR1，HSP90AA1，PARP1，VCP，EGFR，TP53，PABPC1，CDK2 這8 個核心靶點作為蛋白受體和其對應(yīng)的14個小分子作為配體，并對其進(jìn)行分子對接。配體與受體間氫鍵以黃色虛線表示，并標(biāo)注連接處的蛋白殘基名稱。配體受體間結(jié)合活性最好的前11 對相互作用結(jié)果見表2，對接結(jié)果見圖7。

圖7 分子對接結(jié)果Fig.7 Results of molecular docking

表2 分子對接配體受體相互作用Tab.2 Interaction of molecular docking ligand receptor

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個連續(xù)惡化的病理過程，目前最經(jīng)濟(jì)有效的方式是在胃癌前病變階段進(jìn)行治療并逆轉(zhuǎn)疾病發(fā)展［10］。而西醫(yī)對此多以對癥治療和抗幽門螺桿菌治療為主，并無特異性化學(xué)藥物治療方案。中醫(yī)治療理念多注重整體觀念及辨證論治，以中醫(yī)理論為依據(jù)采用中醫(yī)藥對胃癌前病變進(jìn)行干預(yù)獲得臨床廣泛認(rèn)可［11?12］。胃復(fù)春片為治療胃癌前病變常見中成藥，雖其療效已獲證實［13］，但受限于復(fù)雜的化學(xué)成分體系，傳統(tǒng)的藥理學(xué)方法很難找到其作用的靶點和通路［14］，臨床應(yīng)用缺乏理論支持。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，能建立起活性成分、靶點分子、生物功能間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從而預(yù)測可能的藥理作用機(jī)制［14］。分子對接技術(shù)借助大數(shù)據(jù)分析，通過高性能計算準(zhǔn)確地模擬小分子配體與蛋白受體間的互作關(guān)系，在藥物設(shè)計領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［15］。本研究中借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接的方法，建立成分?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)，探究胃復(fù)春片治療胃癌前病變的靶點通路關(guān)系，并通過分子對接技術(shù)，進(jìn)一步在分子?蛋白互作層面模擬其結(jié)合活性。

本研究中經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選和靶點預(yù)測，最終得到活性成分50 個，與胃癌前病變相關(guān)靶點208 個，交集靶點主要為胃復(fù)春片中的3，4 ?secoisopimara ?4（18），7，15 ?triene ?3 ?oic acid、chrysosplenol D、hesperetin、naringenin 和β?sitosterol。經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其藥理作用與NPM1，HSPA5，HNRNPK，YWHAZ，MCM2，HNRNPA1，PABPC1，ILF3，EEF1A1等核心靶點有關(guān)。經(jīng)GO 功能和KEGG通路富集分析，胃復(fù)春片治療胃癌前病變時與核染色體、核糖核蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等作用，經(jīng)基因沉默的調(diào)控、mRNA 代謝過程的調(diào)節(jié)、DNA損傷刺激的調(diào)節(jié)等過程與細(xì)胞黏附分子、泛素蛋白連接酶、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域等結(jié)合，通過乙醇成癮、細(xì)胞周期、前列腺癌、PI3K ?Akt 信號通路等通路發(fā)揮療效。此外分子對接結(jié)果顯示，其小分子活性成分能與HIS及GLY等多個核心靶點蛋白殘基單位結(jié)合，有較好的結(jié)合活性，進(jìn)一步證實胃復(fù)春片在分子?蛋白相互作用層面的藥理作用機(jī)制。

PI3K 在包括胃癌、前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中起重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。PI3K/ AKT 信號通路的激活，可促進(jìn)癌癥細(xì)胞增殖、生長和遷移等環(huán)節(jié)，與胃黏膜上皮細(xì)胞異型增生有密不可分的關(guān)系［16］。WANG等［2］曾通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合體外實驗驗證的方法，證明抑制HRAS ?PI3K ?AKT 通路能抑制下游MDM2 及p21等蛋白的表達(dá)，從而抑制異常表達(dá)的細(xì)胞停留在G2/M期。此外，通過抑制剪接體通路、破壞剪接體活性，可抑制Wnt 相關(guān)通路的蛋白表達(dá)。而現(xiàn)有研究表明，包括Wnt/β ?catenin 在內(nèi)的Wnt 相關(guān)通路在胃癌中呈高表達(dá)［17?18］。雖目前尚未有以抑制乙醇作用通路來探究其對胃癌前病變或胃癌的抑制作用，但近年來，乙醇在胃食管癌中的研究結(jié)果表明，乙醇成癮通路的激活或成為胃癌前病變發(fā)展中的一個重要環(huán)節(jié)［19］。

目前，胃復(fù)春片治療胃癌前病變的藥理學(xué)研究多以改善胃黏膜微生態(tài)入手［20］。本研究中利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了胃復(fù)春片在胃癌前病變治療中的潛在靶點和作用通路，并首次結(jié)合分子對接技術(shù)，模擬了活性成分與靶點蛋白的結(jié)合活性，為探究中藥胃復(fù)春片在胃癌前病變治療中的藥理機(jī)制提供了可靠參考。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于系統(tǒng)生物學(xué)大數(shù)據(jù)分析來預(yù)測其可能的藥理機(jī)制，不同的算法和模型均有可能對其準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，故本研究存在一定的局限性，后續(xù)仍需進(jìn)一步進(jìn)行動物實驗加以驗證。

綜上所述，經(jīng)本研究結(jié)果可預(yù)測，胃復(fù)春片在胃癌前病變治療中，以chrysosplenol D，hesperetin 等多種活性成分，作用 于NPM1，HSPA5，HNRNPK，YWHAZ，MCM2，HNRNPA1，PABPC1，ILF3，EEF1A1 等核心靶點，通過PI3K ?Akt 信號通路、乙醇成癮、細(xì)胞周期、前列腺癌、剪接體等通路，實現(xiàn)其調(diào)控細(xì)胞異常增殖、生長、凋亡的功能，從而發(fā)揮治療胃癌前病變的作用。

A.GO ?BP B.GO ?CC C.GO ?MF D.KEGG信號通路圖6 富集分析結(jié)果A.GO ?BP B.GO ?CC C.GO ?MF D.KEGG signaling pathwayFig.6 Results of enrichment analysis