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    粘菌素發(fā)酵工藝優(yōu)化

    2022-07-27 07:35:38
    鈾礦冶 2022年3期
    關(guān)鍵詞:多粘菌素發(fā)酵罐溶氧

    李 炯

    (河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司,河北 唐山 064000)

    硫酸粘桿菌素E(Colistinsulfate)又名多粘菌素E(PolymyxinE),是由多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素[1-5]。臨床上多粘菌素E主要用于革蘭陰性菌感染的治療,多粘菌素E是最有發(fā)展前途的抗菌素之一[6-15]。

    優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方是提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物收率的重要手段,在實(shí)際生產(chǎn)中影響多粘菌素E發(fā)酵的因素復(fù)雜多變,合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法對(duì)于確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方尤為重要。發(fā)酵過程的控制以及優(yōu)化技術(shù)是發(fā)酵工業(yè)的中游技術(shù)核心,它不僅決定著能否實(shí)現(xiàn)菌種的最大生產(chǎn)能力,而且影響著下游的處理難度[21]。

    發(fā)酵水平的提高,除了依靠培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化外,參數(shù)控制也至關(guān)重要。本研究旨在對(duì)其發(fā)酵的影響因素和提高其發(fā)酵單位的方法進(jìn)行研究,優(yōu)化發(fā)酵過程工藝控制,實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)有設(shè)備條件下發(fā)酵單位的提升,增強(qiáng)產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力。

    1 試驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    儀器:XDW 25/96型恒溫生物搖床,Waters e2695-2489高效液相色譜儀型,PHS-3C型精密酸度計(jì),752型紫外分光光度計(jì),D-37520型高速離心機(jī),VS-1300U型超凈工作臺(tái),MLS-3780型全自動(dòng)高壓滅菌鍋。

    試劑:葡萄糖,F(xiàn)eSO4·7H2O,(NH4)2SO4,CaCO3,KH2PO4等,均為分析純。

    菌種:多粘芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JZ-03-059,為公司自選菌種,保存在甘油冷凍管中。

    1.2 搖瓶發(fā)酵

    活化菌液制備:取冷凍管中的菌液接種到活化培養(yǎng)基中(接種量1%),31 ℃條件下培養(yǎng)13 h。

    種子液制備:取活化菌液接種到種子培養(yǎng)基中(接種量0.2%),31 ℃條件下培養(yǎng)15 h。

    發(fā)酵:將40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基倒入250 mL三角瓶中,再加入種子液(接種量為1%~10%),在溫度(32±0.5)℃、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下,搖瓶培養(yǎng)70~75 h。培養(yǎng)基名稱和配方見表1。

    表1 培養(yǎng)基名稱和配方Table 1 Formulation of the culture medium

    1.3 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程

    發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:葡萄糖35 g/L,豆粉24 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g/L,(NH4)2SO425.0 g/L,CaCO317.8 g/L,KH2PO40.8 g/L,消泡劑2.1 g/L。

    發(fā)酵罐培養(yǎng)條件:裝液量4 L,接種量0.5%~1%,溫度(31.5±0.5)℃,罐壓0.03~0.05 MPa,通氣比1~1.45 vvm(vvm指每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值),發(fā)酵周期為70~75 h。

    7 L發(fā)酵罐流加補(bǔ)料優(yōu)化發(fā)酵工藝:將葡萄糖從基礎(chǔ)料一次投入改為過程流加,其余條件和分批發(fā)酵過程相同。

    1.4 物質(zhì)的提取和檢測(cè)

    殘?zhí)堑臏y(cè)定:取2.5 mL的樣品,加水稀釋至50 mL,搖勻,過濾;取1 mL此混合液到試管中,加1 mL DNS試劑,搖勻,水浴5 min,冷卻后加水10 mL,搖勻,在540 nm處比色,同時(shí)用水做空白,用0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照。其中DNS試劑的配制方法:稱取氫氧化鈉3.2 g,加適量水使之溶解,稱60 g酒石酸鉀鈉溶于其中,至完全溶解后加入3,5-二硝基水楊酸2 g,微熱使之溶解,定容到200 mL,搖勻。

    殘氮的測(cè)定:取適量樣品的離心液至250 mL的錐形瓶中,加入15 mL的水,搖勻后加2滴甲基紅;用0.5 mol/L的硫酸將溶液調(diào)至紅色,用0.02 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至紅色消失;加入5 mL 18%的中性甲醛,搖勻,放置5 min;加酚酞5滴,用氫氧化鈉滴定液滴定至微紅色即為終點(diǎn)。

    效價(jià)的測(cè)定:取適量樣品,用0.05 mol/L硫酸稀釋,過濾后即可用高效液相色譜檢測(cè)。液相色譜檢測(cè)條件:150 mm×4.6 mm 的C18色譜柱;流動(dòng)相為4.46 g/L硫酸鈉水溶液(磷酸調(diào)pH為2.4)∶乙腈(V/V)=78∶22;檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

    樣品的效價(jià)=(工作對(duì)照品的質(zhì)量×工作對(duì)照品的效價(jià)÷工作對(duì)照品E1、E2峰的峰面積和÷50)×樣品的E1、E2峰的峰面積和×樣品的稀釋倍數(shù)。

    溶氧的測(cè)定:將溶氧電極探頭沒入發(fā)酵罐中在線監(jiān)測(cè)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中通入空氣至溶氧飽和,此時(shí)溶氧為100%,發(fā)酵過程中的溶氧為相對(duì)于飽和溶氧濃度的相對(duì)含量。

    二氧化碳釋放速率計(jì)算:采用串聯(lián)式氣體分析儀(Magellan instruments, Tzndem PRO)在線記錄發(fā)酵罐排氣管道中尾氣的CO2含量,并通過公式(1)[22]計(jì)算二氧化碳釋放速率。

    (1)

    式中:CER——CO2釋放速率,mmol/(L·h);Fa,i——通入空氣在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的所對(duì)應(yīng)的體積流量,m3/h;V——發(fā)酵液所占的體積,m3;φ(CO2)i——通入的空氣中CO2占總空氣的體積分?jǐn)?shù);φ(CO2)o——排出的空氣中CO2占總排氣的體積分?jǐn)?shù)。

    2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

    2.1 發(fā)酵過程控制參數(shù)

    溶氧濃度、攪拌速率是有氧發(fā)酵過程的關(guān)鍵參數(shù),這2個(gè)參數(shù)的變化直接影響產(chǎn)量和成本。多粘芽孢桿菌是好氧微生物,對(duì)溶氧有較高的需求;但其在不同生產(chǎn)階段對(duì)溶氧的需求并不相同,且差別較大。因此,依據(jù)多粘芽孢桿菌的生理特性,合理調(diào)控發(fā)酵過程各個(gè)階段的溶氧濃度,對(duì)于多粘菌素發(fā)酵效價(jià)的提升、能耗的降低來說具有重大意義[23]。在實(shí)際生產(chǎn)過程中,設(shè)備條件一定,可通過調(diào)整攪拌速率和通空氣量來增加氧傳遞系數(shù),同時(shí)增加剪切力。因此研究菌種對(duì)溶氧的需求和對(duì)剪切力的敏感性尤為必要[24]。

    2.1.1 裝液量對(duì)多粘菌素E發(fā)酵的影響

    分別取10、20、30、40、50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL搖瓶?jī)?nèi),接種,發(fā)酵48 h后,對(duì)發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行效價(jià)測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

    圖1 裝液量對(duì)效價(jià)的影響Fig. 1 Effect of loading volume on titer

    從圖1可看出,效價(jià)隨裝液量的增加而增加,當(dāng)裝液量增加至40 mL時(shí),效價(jià)達(dá)到最大值,隨后效價(jià)隨裝液量的增加而減小。在裝液量為40 mL/250 mL時(shí),效價(jià)從最初的4.70×104U/mL上升至6.53×104U/mL。因此可確定裝液量40 mL/250 mL為多粘芽孢桿菌素E產(chǎn)生的最佳裝液量。而裝液量在一定程度上可以代表溶氧水平,因此在后續(xù)發(fā)酵過程中,應(yīng)將溶氧控制在合適的水平。

    2.1.2 剪切力對(duì)多粘菌素E發(fā)酵的影響

    在搖瓶發(fā)酵中,添加玻璃珠數(shù)越多,對(duì)菌體的剪切力越大??梢酝ㄟ^在搖瓶中加入玻璃珠的方式,模擬發(fā)酵罐中由于機(jī)械攪拌帶來的剪切力對(duì)發(fā)酵過程的影響。

    通過在搖瓶中加入6 mm的不同數(shù)量的玻璃珠(0、15、45、77顆),產(chǎn)生不同剪切力進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果如圖2所示??梢钥闯觯S著玻璃珠數(shù)的增加(即剪切力的增大),效價(jià)逐漸降低;當(dāng)達(dá)到45顆玻璃珠時(shí),效價(jià)下降94%。在多粘菌素E發(fā)酵過程中,菌體對(duì)剪切力很敏感。

    圖2 剪切力對(duì)效價(jià)的影響Fig. 2 Effect of the number of glass beads on titer

    2.2 7 L玻璃罐分批發(fā)酵過程研究

    多粘芽孢桿菌JZ-03-043凍存菌液經(jīng)種瓶培養(yǎng)后,接入7 L發(fā)酵罐,在通氣比1∶1 vvm的條件下,分別在200、300、450、530、700、1 000 rpm起始轉(zhuǎn)速下,測(cè)定發(fā)酵過程中的溶氧、效價(jià),并觀察菌體形態(tài)。根據(jù)多尺度過程優(yōu)化原理[25-26],采用串聯(lián)式氣體分析儀進(jìn)行尾氣分析,確定發(fā)酵過程的臨界氧濃度,并通過7 L罐分批發(fā)酵加以驗(yàn)證。

    2.2.1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)效價(jià)和相對(duì)溶氧的影響

    在7 L發(fā)酵罐間歇發(fā)酵過程中(28 h),調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速,研究轉(zhuǎn)速對(duì)效價(jià)和相對(duì)溶氧的影響,結(jié)果如圖3所示??梢钥闯?,隨著攪拌轉(zhuǎn)速的提高,相對(duì)溶氧逐漸提高,效價(jià)則呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì);攪拌轉(zhuǎn)速為530 rpm時(shí),效價(jià)達(dá)18.8×104U/mL,相對(duì)溶氧在23%左右,基本滿足多粘芽孢桿菌生長(zhǎng)需要;繼續(xù)增大攪拌轉(zhuǎn)速,效價(jià)下降,此時(shí)剪切力的抑制作用成為主導(dǎo),高于提高溶氧產(chǎn)生的促進(jìn)作用。為確保攪拌剪切力處于菌體生長(zhǎng)可承受的范圍內(nèi),確定攪拌轉(zhuǎn)速以530 rpm為宜。

    圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)效價(jià)和溶氧的影響Fig. 3 Effect of stirring speed on titer and dissolved oxygen

    2.2.2 發(fā)酵周期對(duì)相對(duì)溶氧、CER、效價(jià)的影響

    發(fā)酵周期對(duì)相對(duì)溶氧、CER、效價(jià)的影響如圖4所示??梢钥闯?,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,相對(duì)溶氧逐漸降低,CER、效價(jià)逐漸升高,說明這時(shí)菌體在大量生長(zhǎng),是菌體的快速生長(zhǎng)期,并開始合成多粘菌素E;溶氧低于20%后繼續(xù)下降,同時(shí)CER也在下降,即出現(xiàn)順峰現(xiàn)象;而后溶氧緩慢上升,CER曲線也開始上升。根據(jù)多尺度過程優(yōu)化理論和供氧需氧平衡,確定臨界相對(duì)溶氧濃度以20%為宜。

    圖4 發(fā)酵周期對(duì)溶氧、CER、效價(jià)的影響Fig. 4 Effect of the fermentation cycle on dissolved oxygen, CER and titer

    為了保持相對(duì)溶氧在臨界氧濃度以上,通過控制攪拌轉(zhuǎn)速來控制發(fā)酵過程的相對(duì)溶氧水平。當(dāng)全程控制相對(duì)溶氧在20%以上時(shí),發(fā)酵周期對(duì)相對(duì)溶氧、CER、效價(jià)的影響如圖5所示??梢钥闯?,在溶氧低于20%時(shí),增加轉(zhuǎn)速,沒有出現(xiàn)圖4中的“順峰”現(xiàn)象,CER曲線逐漸上升,發(fā)酵單位明顯增高。結(jié)果顯示增加攪拌轉(zhuǎn)速?zèng)]有對(duì)菌體生長(zhǎng)和多粘菌素發(fā)酵產(chǎn)生明顯影響,即當(dāng)菌體大量生長(zhǎng)后,菌體對(duì)剪切力的敏感程度大大降低。

    圖5 發(fā)酵周期對(duì)相對(duì)溶氧、CER、效價(jià)的影響(相對(duì)溶氧20%以上)Fig. 5 Effect of the fermentation cycle on dissolved oxygen,CER and titer(dissolved oxygen is above 20%)

    2.2.3 發(fā)酵過程中殘?zhí)呛蜌埖?/p>

    發(fā)酵過程中殘?zhí)呛蜌埖€如圖6所示??梢钥闯?,隨著糖耗增加,效價(jià)增長(zhǎng)幅度也在增加;但當(dāng)殘?zhí)堑陀?.0 g/100 mL時(shí),效價(jià)漲幅明顯減慢。此外,整個(gè)發(fā)酵過程中氨氮基本處于430~450 mg/100 mL范圍內(nèi)。

    圖6 發(fā)酵過程中殘?zhí)?、殘氮和效價(jià)Fig. 6 Residual sugar, residual nitrogen and titer during fermentation

    2.3 7 L發(fā)酵罐流加補(bǔ)料優(yōu)化發(fā)酵工藝

    在7 L玻璃罐、分批式發(fā)酵基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)料工藝改進(jìn),并選擇適當(dāng)?shù)难a(bǔ)料策略及補(bǔ)料時(shí)機(jī)以提高產(chǎn)品效價(jià)。通過研究確定攪拌轉(zhuǎn)速、溶氧控制水平和補(bǔ)料控制指標(biāo)等參數(shù),為進(jìn)行放大生產(chǎn)積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    根據(jù)2個(gè)最大化理論(曲線面積下菌體濃度最大和曲線面積下發(fā)酵體積最大),在保證供氧與需氧平衡、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗與供給平衡、菌體比生長(zhǎng)速率與稀釋率平衡的基礎(chǔ)上,應(yīng)用補(bǔ)料工藝能夠有效提升發(fā)酵水平。補(bǔ)料帶來的稀釋作用既能解除底物、產(chǎn)物抑制以及產(chǎn)物分解阻遏效應(yīng);也能避免間歇發(fā)酵時(shí),因一次性補(bǔ)加量過大使得細(xì)胞生長(zhǎng)迅速而引起的不利影響[27]。流加補(bǔ)料發(fā)酵還能延長(zhǎng)微生物處于穩(wěn)定期的時(shí)間,有利于產(chǎn)物的積累。結(jié)合多尺度過程優(yōu)化原理與方法,通過對(duì)發(fā)酵尾氣進(jìn)行分析來優(yōu)化補(bǔ)料過程[28]。

    由于多粘菌素E補(bǔ)料發(fā)酵主要是將葡萄糖從基礎(chǔ)料一次投入改為過程流加,因此需要控制過程中的殘?zhí)撬讲趴扇〉煤玫男Ч?。補(bǔ)料發(fā)酵過程中殘?zhí)撬脚c發(fā)酵效價(jià)的關(guān)系如圖7所示??梢钥闯?,殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL以下時(shí),隨著殘?zhí)强刂扑教岣?,發(fā)酵單位、效價(jià)漲幅均提高;而殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL以上時(shí),隨著殘?zhí)强刂扑教岣撸l(fā)酵單位、效價(jià)漲幅則逐漸降低;殘?zhí)强刂圃?.1 g/100 mL時(shí),發(fā)酵單位、效價(jià)漲幅均為最低;當(dāng)殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL時(shí),發(fā)酵效價(jià)漲幅達(dá)到了37.5×104U/mL,為最高。所以,殘?zhí)强刂圃?.5 g/100 mL為宜。

    圖7 補(bǔ)料發(fā)酵過程中殘?zhí)强刂扑脚c效價(jià)的關(guān)系Fig. 7 The relationship between residual sugar levels and titer during filling fermentation

    3 結(jié)論

    粘菌素E的發(fā)酵不需要太高的溶氧,但溶氧過低時(shí)影響發(fā)酵效價(jià),且對(duì)剪切力較為敏感。在7 L發(fā)酵罐、相對(duì)溶氧高于20%、殘?zhí)窃?.5 g/100 mL條件下發(fā)酵,效價(jià)最高,達(dá)到37.5×104U/mL。本研究實(shí)現(xiàn)了粘菌素E的高產(chǎn),并對(duì)微生物發(fā)酵工藝的改良具有指導(dǎo)意義。

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