改良孢子彈射法分離茶餅病病原菌

劉垚果，陳瑤，劉惠芳，陳薇，雷志偉，馬馳宇，楊文*

1.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，貴州 貴陽 550006

茶餅病系低溫高濕型茶樹病害之一，壞損外擔菌屬真菌（Exobasidium vexans） 是其致病菌[1-3]。該病原菌的菌絲體潛伏于病葉的活組織中越冬和越夏，在均溫15～32 °C 和相對濕度高于80%的氣候條件下，病斑表面形成白色粉狀物，即由擔孢子組成的子實層，成為發(fā)病的行多次再侵染初次侵染源。擔孢子成熟后隨雨霧侵入新梢嫩葉出現(xiàn)新病斑，導致病害的流行[4-6]。近年來，茶餅病的季節(jié)流行性暴發(fā)，對我國茶產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的損失，其主要為害茶樹嫩葉、新梢，嚴重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴重的減產(chǎn)高達90%[7-12]。為了更好地防治茶餅病，需開展其室內(nèi)生測、病原菌與茶樹互作、相關(guān)分子研究等，但其基礎(chǔ)是分離純化出可長期培養(yǎng)和保存的茶餅病病菌。

茶餅病的致病菌E.vexans由Massee[13]于1898年首次報道，Gadd等[14]于1948年首次確認E.vexans只產(chǎn)生擔孢子，而并非于1898年Massee所述的分生孢子，同時明確此菌是通過角質(zhì)層而非氣孔進入茶樹葉片體內(nèi)。1950年，Gadd 等[15]認為E.vexans是專性寄生菌，不能被離體培養(yǎng)；但1952年Graafland[16]的研究結(jié)果證明此菌可在麥芽糖瓊脂上培養(yǎng)；此后，Ezuka[17]于1955報道此菌可在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。由于E.vexans在培養(yǎng)基上生長速度慢，在分離純化的過程中容易被其他生長快的雜菌覆蓋，導致分離難度增大，屬難于分離培養(yǎng)的病原物，所以選擇此菌適宜的培養(yǎng)基和分離方法以提高其分離效率至關(guān)重要。Chaliha 等[18]獲得了適宜E. vexans生長的3 種最優(yōu)培養(yǎng)基及其配方，分別為PDA 培養(yǎng)基、查氏（Czapek dox）培養(yǎng)基和V8 Juice 培養(yǎng)基。雖然已有譚榮榮等[2]報道了E.vexans的分離方法，但在實際應用中，分離純化菌株的機率仍然較低。

為了提高茶餅病病菌分離純化菌株的機率，本文對比了組織分離法和孢子彈射法對E.vexans的分離率，并在孢子彈射法的基礎(chǔ)上進行了改良；同時采用形態(tài)學觀察和ⅠTS（Ⅰnternal transcribed spacer）單基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對改良孢子彈射法分離的菌株cbb進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

茶餅病病葉采自湄潭縣黔湄601 品種茶園。茶葉提取物（99%，HPLC）購買于合肥藥谷生物科技有限公司。

1.2 病原菌的分離方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基

參照Chaliha 等[18]的方法，在1 L 超純水中加入200 g 土豆熬煮后過濾，在濾液中加入3 g 葡萄糖、30%茶葉提取物和0.4 g CaCO3，使用0.1 mol NaOH把pH調(diào)到6.5，加入15 g瓊脂加熱溶解，待完全溶解后，再加水至1 L。

1.2.2 不同分離方法

（1）組織分離法：把茶樹病葉的病健交界處用剪刀取長約0.5 cm的組織塊，放入培養(yǎng)皿進行表面消毒（無菌水沖洗2～3 次，75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗2～3 次，超凈工作臺自然風干），風干后接種到PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)2～3 d 后，將長出的菌絲轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA 培養(yǎng)基上純化。

（2）孢子彈射法[2]：采摘病菌子實層處于生長旺盛期的病葉，無菌條件下，將雙面膠貼在培養(yǎng)皿皿蓋內(nèi)壁，用解剖刀切下小塊病塊粘到雙面膠上（子實層一面朝下），每隔1 h 觀察平板上是否出現(xiàn)肉眼可見的1層薄薄的油狀薄膜。一旦出現(xiàn)記錄其彈射時間，并更換無菌皿蓋繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d，等肉眼略微可見的菌落長出，挑取少量菌絲置于新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并觀察菌落培養(yǎng)性狀，與Chaliha 等[18]文獻報道E.vexans培養(yǎng)性狀不同的判定為雜菌，培養(yǎng)14 d 后，挑取無污染菌落的菌絲續(xù)代培養(yǎng)3 次后，性狀保持不變且孢子形態(tài)與Chaliha 等[18]報道的E. vexans一致的為純病原物，按以下公式計算其分離純化效率。

分離純化效率=分離出純病原物病葉數(shù)/分離病葉總數(shù)×100% （1）

（3）改良孢子彈射法：采摘病菌子實層處于生長旺盛期的病葉，保持葉片的完整性，保留葉柄，用無菌脫脂棉對葉片的葉柄處保濕，將雙面膠貼在培養(yǎng)皿皿蓋內(nèi)壁，把處理好的葉片粘到皿蓋上（子實層一面朝下），每隔1 h 觀察平板上是否出現(xiàn)肉眼可見的1 層薄薄的油狀薄膜。記錄其彈射時間，并換無菌蓋子繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d，待肉眼略微可見的菌落長出，挑取少量菌絲置于新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并觀察菌落培養(yǎng)性狀，與Chaliha等[18]報道的E. vexans培養(yǎng)性狀不同的判定為雜菌，培養(yǎng)14 d 后，挑取無污染菌落的菌絲續(xù)代培養(yǎng)3 次后，性狀保持不變且孢子形態(tài)與Chaliha等[18]報道的E.vexans一致的為純病原物，按公式（1）計算其分離純化效率。

本次實驗對采摘不同天數(shù)的病葉進行分離并單獨統(tǒng)計其分離純化效率，每次分離病葉的基數(shù)為30片，并重復3次。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學觀察

將病原菌接種在PDA 平板上25°C 培養(yǎng)30 d，觀察菌落形態(tài)、顏色和生長速率。在顯微鏡（BX-53）下觀察菌絲、孢子形態(tài)。

要杜絕“過得去”的思想。一定要切實提高質(zhì)量意識，嚴格質(zhì)量管理程序，層層負責，層層把關(guān)。每一個檢修項目都要逐個認真檢修確認，對質(zhì)量不達標的限期整改，對造成損失的嚴肅處理，堅決克服只顧眼前、不顧今后，“嘴巴上嚴格，行動上軟塌”的不良傾向。

1.3.2 分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌基因組DNA，并以所提基因組DNA為模板，利用引物ⅠTS5/ⅠTS4對菌株基因組DNA的ⅠTS基因進行PCR 擴增。反應體系（25 μL）：Taq DNA Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物和DNA模板各1 μL。PCR反應條件：95 ℃預變 性5 min；94 ℃變 性30 s，57 ℃退 火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 °C 延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后，送上海生工有限公司測序。

將PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)NCBⅠ中BLAST 比對后，選取序列相似性高的菌株，利用BioEdit對測序序列和下載自NCBⅠ-Gen Bank 的序列進行多位點序列比對，對其進行手動校正，并將序列采用RA×ML構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

nrDNA-ⅠTS片斷擴增/測序所用引物：

ⅠTS5 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'

ⅠTS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

1.4 病原菌致病性測定

將分離純化的病原菌放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，長出孢子后，在其培養(yǎng)皿中加入適量含有0.05%吐溫-80的無菌水，用無菌手術(shù)刀將孢子刮下，經(jīng)無菌紗布過濾后配成含孢子1.0×105個/mL的懸浮液。采摘黔湄601 離體茶樹枝，經(jīng)無菌水沖洗干凈后，置于錐形瓶中，在枝條下面加入無菌水保持其活性。采用噴霧法接種孢子懸液，接種后用加濕器每間隔4 h 保濕2 h，保持相對濕度90%以上，溫度18～22 ℃，無菌水接種為對照。定時觀察病情,記錄發(fā)病葉片數(shù)量。病情穩(wěn)定后測定一次病斑直徑。每次接種100 枝黔湄601 茶樹枝，重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS22軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分離方法的分離純化率

如表1所示，采用傳統(tǒng)的組織分離法，幾乎分離不出孢子形態(tài)與Chaliha 等[18]報道的E.vexans一致的純病原物，無論是采摘第幾天的病葉，分離純化效率均為0，與病葉的新鮮程度無關(guān)。對第一天至第四天采摘的病葉進行分離，傳統(tǒng)孢子彈射法的分離純化效率分別為52%、34%、15%和4%，改良孢子彈射法的分離純化效率分別為78%、58%、24%和10%。相對于傳統(tǒng)孢子彈射法，改良孢子彈射法對當天采摘的病葉的分離純化效率可提高1.5 倍。結(jié)果表明，使用孢子彈射法和改良孢子彈射法，分離純化效率和病葉的新鮮程度有關(guān)，病葉新鮮程度越高，分離純化效率越高。

表1 不同分離方法的分離純化效率 %

2.2 病原菌的形態(tài)學觀察結(jié)果

選擇癥狀典型的發(fā)病病葉（圖1），采用改良孢子彈射法，分離培養(yǎng)并篩選出形態(tài)與Chaliha等[18]報道的E.vexans相似的菌株cbb。cbb 在PDA培養(yǎng)基上生長非常緩慢，培養(yǎng)21 d，其菌落直徑為21～22 mm，平均生長速率為1.00～1.07 mm/d；菌落直徑長至22 mm 左右后，生長趨于停止。該菌在PDA 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)比較完整，菌絲正面色澤呈米黃色，菌絲密度較高，背面呈茶黃色（圖2）。以100 倍顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，擔孢子無色，光滑，長橢圓形至倒卵形，頂端鈍圓，末端略彎曲或不彎曲，大小為（7～16）μm ×（3～5）μm（圖3）。

圖1 茶餅病田間癥狀

圖2 在PDA培養(yǎng)基上的菌株cbb

圖3 擔孢子形態(tài)（×100）

2.3 分子生物學鑒定結(jié)果

PCR 擴增基因組DNA 的ⅠTS 片段，大小為544 bp（圖4），經(jīng)BLAST 比對后選取相似度高的菌株為內(nèi)群，以登錄號EU692762 Exobasidium_sp和AB180336 Exobasidium shiraianum 為外群，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（表2）。結(jié)果顯示，菌株cbb 和登錄號MG847206 的菌株聚為一支，菌株相似度達100%（圖5）。

圖4 PCR擴增凝膠電泳圖（ⅠTS：544 bp）

圖5 基于ⅠTS基因序列的單基因系統(tǒng)進化樹

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的菌名及GenBank登錄號

2.4 致病性測定

分離菌株cbb的室內(nèi)人工回接實驗表明，接種后，最早于第七天呈現(xiàn)茶餅病的初期癥狀，葉片正面為淺黃綠色近圓形的透明斑點，葉片背面病斑不明顯，病斑直徑3～7 mm（圖6），在之后無論怎樣培養(yǎng)，都只表現(xiàn)為初期癥狀，沒有子實層形成，不能出現(xiàn)田間茶餅病發(fā)病的后期癥狀。由于沒有子實層形成，所以采用組織分離法對回接發(fā)病葉片進行分離，再次獲得了該菌，將該菌再次回接到黔湄601后仍只表現(xiàn)出初期癥狀。結(jié)果表明，菌株cbb在室內(nèi)對黔湄601的致病力表現(xiàn)較差?；亟? d 后，菌株cbb 對黔湄601 離體第一至第四張葉片的致病率分別為38%、29%、7%、3%。

圖6 離體葉片回接情況

3 小結(jié)與討論

壞損外擔菌（E.vexans）雖然最早被Gadd 和Loos 認為是專性寄生菌，但Graafland 和Ezuka 相繼在不同培養(yǎng)基上成功培養(yǎng)[15-17]。本文通過改良孢子彈射法分離得到1株純病原物cbb，在繼代培養(yǎng)了3代后，其性狀依然保持不變。實驗中發(fā)現(xiàn)，3周內(nèi)該菌株在PDA 培養(yǎng)基上菌落直徑隨著時間延長而增加，超過3 周后生長趨于停止，這可能與后期營養(yǎng)缺乏有關(guān)。該菌在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)比較完整，正面色澤呈米黃色，密度較高，背面呈茶黃色，與李繼業(yè)等[19]報道的E.vexans在PDA 培養(yǎng)基的生長性狀幾乎一致。菌株cbb 的擔孢子無色，光滑，長橢圓形至倒卵形，頂端鈍圓，大小為（7～16）μm ×（3～5）μm。Massee[13]描述的擔孢子為透明，無毛，卵形，長圓形，通常稍不等邊，5 μm×3 μm；Mann[20]將它們描述為極其微小的卵形身體，成對生長在被稱為擔子的特殊部位的末端；Tunstall 等[21]將染色的病原菌放在顯微下觀察到“香腸形狀”。上述關(guān)于E.vexans擔孢子的描述與本研究中的擔孢子觀察結(jié)果相吻合。因此，形態(tài)特征和分子鑒定的結(jié)果表明，本研究分離菌株cbb為E.vexans。

Venkatekam 等[22]根據(jù)茶餅病病害循環(huán)，將其分為7個階段：第一階段，真菌穿透3 d以后，出現(xiàn)直徑小于0.5 mm半透明斑點；第二階段，斑點直徑大于0.5 mm，小于1 mm；第三階段，斑點直徑大于1 mm，小于3 mm；第四階段，斑點直徑大于3 mm，小于6 mm，且斑點有明顯損害；第五階段，損害部葉片背面膨脹凸出，菌絲擴展到海綿組織的細胞間；第六階段，孢子開始形成；第七階段，大量孢子形成。Jayaswall 等[23]將茶餅病發(fā)生時期分為4 個階段，第一階段，孢子侵染后24 h 之內(nèi)；第二階段，孢子萌發(fā)階段，孢子侵染后7 d之內(nèi)；第三階段，吸器形成階段，孢子侵染后14 d 之內(nèi)；第四階段，孢子形成以及二次侵染，大約在孢子侵染后20 d。Nisha 等[24]將茶餅病發(fā)生時期分為4 個階段，其中第一階段，出現(xiàn)直徑0.5～1.0 mm 半透明斑點；第二階段，出現(xiàn)亮斑；第三階段，孢子開始形成；第四階段，產(chǎn)生孢子生殖損傷。趙曉珍等[25]將E.vexans侵染所致茶餅病分為4個階段，第一階段，病斑直徑為3～6 mm；第二階段，病斑處開始膨脹，形成葉片正面平滑光亮，凹陷或凸起；第三階段，擔孢子大量形成，葉背面呈純白色天鵝絨狀；第四階段，病斑內(nèi)組織細胞營養(yǎng)耗盡，寄主抗性反應產(chǎn)生，病斑組織壞死，呈褐色干枯潰瘍狀，病斑擴展受到限制。上述茶餅病病原菌侵染分期研究中，以Nisha等和趙曉珍等的分期較為合理。本研究的菌株cbb 回接7 d 后，感病葉片上只出現(xiàn)Nisha 等所述的第二階段癥狀；而對照組沒有發(fā)病，表明菌株cbb是致病菌。在本試驗條件下后續(xù)未觀察到第三至第四階段癥狀，其原因之一可能是茶餅病發(fā)病需要嚴格的條件（濕度和溫度），室內(nèi)的環(huán)境達不到要求[26]；另一種原因可能是茶餅病發(fā)病的嚴重程度還與其他菌協(xié)同作用有關(guān)。植物病原菌間的相互協(xié)同作用可以影響某一特定植物病害的發(fā)展并導致其嚴重程度[27]。Barman 等[28]研究發(fā)現(xiàn)Pestalotiopsisspp.和Nigrosporasp.一直存在于茶餅病發(fā)病的各個階段，推測此2 種病原菌可能在茶餅病發(fā)病過程中引起額外的發(fā)病機制，進而可能促進了茶餅病的發(fā)病和流行。

國內(nèi)外對E.vexans室內(nèi)的生物測試報道較少，印度Chaliha等[29]報道了交聯(lián)Cu:ZnS-木質(zhì)纖維素納米復合材料對E.vexans抗菌活性的測定；韋思梅等[30]篩選出酸瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對茶餅病菌具有拮抗作用。而田間的試驗報道較多，如陳雪芬等[31]推薦在茶餅病初期施用75%十三嗎啉乳油可以用于防治茶餅病；魏朝霞等[32]報道了99%綠穎、2%武夷霉素、10%多抗霉素和松針水提液對茶餅病均有一定的防效；冉隆珣等[33]報道了武夷菌素500～800倍范圍內(nèi)對茶餅病的防治效果最好。室內(nèi)的生物測試實驗報道較少的原因可能是E.vexans在培養(yǎng)基上生長緩慢，屬較難分離培養(yǎng)的病原物，室內(nèi)的分離純化效率低，容易被生長快的雜菌所覆蓋。

本文采用Chaliha等[18]優(yōu)化的PDA培養(yǎng)基，以傳統(tǒng)孢子彈射法為基礎(chǔ)，對葉柄處保濕進行了優(yōu)化，達到強化孢子彈射能力的目的，使培養(yǎng)基上油霧狀孢子層形成時間由3～5 h縮短到1～2 h，降低了被其他雜菌污染的幾率。通過對不同保存時間的茶餅病病葉分離純化率進行比較，結(jié)果表明及時對茶餅病鮮葉進行分離也是該病原菌成功分離的關(guān)鍵之一。茶餅病的孢子在培養(yǎng)基上生長緩慢，使用組織分離法，病葉直接接觸培養(yǎng)基，導致生長較快的雜菌容易抑制它的生長，很難分離出純化的茶餅病病菌，因此建議不用組織分離法分離E.vexans。

結(jié)合本研究結(jié)果，改良孢子彈射法分離茶餅病病菌的要點如下：（1）采摘處于第三階段癥狀的病葉，保持葉片的完整性，用滅菌脫脂棉對葉片的葉柄處進行保濕處理；（2）把保濕處理的完整葉片正面粘上雙面膠，然后將其貼在培養(yǎng)皿皿蓋內(nèi)壁上進行彈射；（3）在彈射1～2 h 內(nèi)，當平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見油霧狀薄膜時，立即換上無菌皿蓋，并繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d；（4）待肉眼微見的菌落長出時，挑取少量菌絲置于新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；（5）培養(yǎng)14 d 后，選擇菌落無污染的培養(yǎng)物，挑取少量菌絲塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進一步純化培養(yǎng)。采用上述改良的孢子彈射法，可以有效分離純化出可續(xù)代培養(yǎng)的E.vexans，為此菌后續(xù)的室內(nèi)生物測試、致病性研究、分子生物學研究等提供純培養(yǎng)物。