1株南美蟛蜞菊內(nèi)生真菌Aspergillus sp.PQJ-1次級代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究

李文杏，王一諾，馬 濤，張榮浚，惠 陽，陳文豪*

（1.熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室/海南師范大學 化學與化工學院，海南 ?？?571158；2.熱帶藥用植物化學海南省重點實驗室/海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571158）

植物內(nèi)生真菌資源豐富，其次生代謝產(chǎn)物種類繁多，具有促進植物生長、提高植物抗逆性、抑制病原菌、抗癌、降解環(huán)境污染物等功效，被廣泛應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)和環(huán)保方面，前景廣闊[1-2]。

曲霉屬（Aspergillus）真菌次級代謝產(chǎn)物已被廣泛研究。其能夠產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)類型和豐富生物活性的次級代謝產(chǎn)物，為活性天然產(chǎn)物的重要來源之一[3]。例如具有抗腫瘤活性的malformin A、3β，15β-二羥基-（22E，24R）-麥角甾-5，8（14），22-三烯-7-酮[4]；抑制α-葡萄糖苷酶活性的丁內(nèi)酯[5]；具有抗菌活性的clava?tone和clavatol；具有抗植物病原菌的聚酮類、萜類、肽類[6]。以上研究結(jié)果顯示，曲霉屬真菌次級代謝產(chǎn)物具有藥用先導化合物研究開發(fā)的重要前景。

本文研究了1 株南美蟛蜞菊（Sphagneticola trilobata）來源內(nèi)生真菌Aspergillussp.PQJ-1 的次級代謝產(chǎn)物，綜合運用HPLC等色譜分離手段，從中分離得到6個化合物，通過核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等方法分別鑒定為cyclo-D-Trp-L-Pro（1），1H-indole-3-carboxaldehyde（2），isoeugenin（3），flufaran（4），aflatoxinB1（5），sterigmato-cystin（6）?；衔?～6的化學結(jié)構(gòu)式如下：

圖1 化合物1～6的化學結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structures of compounds 1～6

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

MAT-95-MS 質(zhì)譜儀，德國Finnigan 公司；Bruker AV-400MHz 超導核磁共振儀，瑞士Bruker 公司；Agi?lent1260分析型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；EYELAN-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化有限公司；YO?KO-ZK 紫外分析暗箱，武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；Sephadex LH-20 凝膠，安法瑪西亞技術(shù)上海有限公司；柱色譜硅膠，青島海洋化工廠；氘代試劑，艾覽化工科技有限公司；其他常用溶劑，西隴化工股份有限公司。

1.2 菌株的分離及培養(yǎng)

1.2.1 菌株來源

真菌Aspergillussp.PQJ-1來源于南美蟛蜞菊，南美蟛蜞菊于2020年7月采自海南師范大學桂林洋校區(qū)，經(jīng)海南師范大學生命科學院關(guān)亞麗教授鑒定為南美蟛蜞菊（Sphagneticola trilobata）。根據(jù)菌株Aspergillussp.PQJ-1 形態(tài)特征和18S rRNA 基因序列（GenBank 登錄號NO.OM269036）進行鑒定，菌種存放于海南師范大學熱帶藥用資源化學教育部重點實驗室。菌株以PDA為培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.2.2 菌株的培養(yǎng)

菌株Aspergillussp.PQJ-1 用PDA 液體培養(yǎng)基恒溫28 ℃靜置培養(yǎng)35 d，1 000 mL 三角錐形瓶每瓶加入300 mL培養(yǎng)液，120 ℃的高溫滅菌鍋滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻后接種，共發(fā)酵300瓶。

1.3 提取與分離

采用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，萃取3次，減壓濃縮得到乙酸乙酯提取物總浸膏（150 g），將總浸膏用正相硅膠柱色譜進行分離，用三氯甲烷-丙酮（體積比10∶1～0∶10）體系進行梯度洗脫，得到7 個組份（Fr.1-Fr7）。其中Fr.1（13.0 g）經(jīng)反復正相硅膠柱色譜梯度洗脫分離，得到化合物4（1.2 g），最后經(jīng)半制備HPLC以乙腈-水（體積比55∶45，流速3 mL/min）制備得到化合物1（10.2 mg）。Fr.2（18.5 g）經(jīng)反復正向硅膠柱色譜梯度洗脫分離，再經(jīng)半制備HPLC 以乙腈∶水（體積比33∶67，流速3 mL/min）制備得到化合物2（6.3 mg）、化合物3（5.7 mg）、化合物5（7.2 mg）、化合物6（7.5 mg）。

1.4 生物活性測試

1.4.1 抗菌活性

采用96孔板微量稀釋法，測定所有化合物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus autrus subsp）、白色念珠菌（Candida albicans）、大腸桿菌（Escherichia coli）的抗菌活性，環(huán)丙沙星為陽性對照，二甲基亞砜（DMSO）為陰性對照，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察從上到下不長菌的澄清的孔即為該測試樣品的最小抑菌濃度MIC[7]。

2 實驗結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，分子式：C16H17N3O2;ESI-MSm/z：284.3[M+H]+。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.59（H，dd，J=0.4，5.2 Hz，H-5），7.40（1H，d，J=5.6 Hz，H-8），7.24（1H，m，H-7），7.14（1H，m，H-6），7.12（1H，d，J= 1.2 Hz，H-2），4.36（1H，dd，J= 2.4，8.0 Hz，H-11），4.07（1H，t，J= 4.8 Hz，H-14），3.77（1H，ddd，J= 0.4，2.4，10.0 Hz，H-10b），3.64（1H，m，H-17a），3.58（1H，m，H-17b），2.97（1H，dd，J= 7.2，10.0 Hz，H-10a），2.32（1H，m，H-19a），2.02（1H，m，H-19b），2.01（1H，m，H-18a），1.91（1H，m，H-18b）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）：δ169.8（C-13），166.0（C-16），137.1（C-9），127.2（C-4），123.7（C-2），123.3（C-7），120.5（C-6），119.0（C-5），112.0（C-8），110.5（C-30），59.7（C-14），55.0（C-11），45.9（C-17），28.8（C-19），27.3（C-10），23.1（C-18）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[8]數(shù)據(jù)一致，因此確定化合物1為cyclo-D-Trp-L-Pro。

化合物2：淺黃色粉末，分子式：C9H7NO; ESI-MSm/z：146.2[M+H]+。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：δ9.93（1H，s，H-10），8.28（1H，s，H-2），8.10（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），7.52（1H，d，J= 8.0 Hz，H-7），7.26（2H，m，H-5 and H-6）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）：δ185.0（C-10），138.5（C-2），137.1（C-8），124.2（C-9），123.5（C-6），122.1（C-5），120.8（C-4），118.2（C-3），112.5（C-7）。數(shù)據(jù)與參考文獻[9]一致，因此確定化合物2為1H-Indole-3-carboxaldehyde。

化合物3：淡黃色油狀物，分子式：C11H10O4，ESI-MSm/z：205.0[M-H]-。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：δ6.56（1H，d，J=2.4 Hz，H-8），6.51（1H，d，J=2.4 Hz，H-6），5.57（1H，s，H-3），3.91（1H，s，OCH3），2.52（3H，s，2-CH3）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）：δ169.4（C-4），161.8（C-5），160.9（C-7），156.2（C-9），138.1（C-2），116.2（C-8），105.8（C-10），100.5（C-6），86.5（C-3），56.5（OCH3），23.0（CH3）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[10]一致，因此確定化合物3為isoeugenin。

化合物4：無色針狀晶體，分子式：C6H6O4，ESI-MSm/z：143.1[M+H]+。1H NMR（Acetone-d6，400 MHz）：δ7.96（1H，s，H-2），6.43（1H，s，H-4），4.44（2H，s，H-7）。13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）：δ174.6（C-6），169.7（C-5），146.8（C-3），138.5（C-2），109.7（C-4），61.1（C-7）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[11]一致，因此確定化合物4為flufaran。

化合物5：淺黃色粉末，分子式：C17H12O6，ESI-MSm/z：313.1[M+H]+。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：δ6.93（1H，d，J=8.0 Hz，H-11），6.75（1H，s，H-9），6.73（1H，s，H-10），5.40（1H，t，J=2.4 Hz，H-7），4.75（1H，dd，J= 6.8，2.0 Hz，H-12），3.93（3H，s，H-17），3.25（2H，t，J= 4.0 Hz，H-3），2.47（2H，t，J=5.2 Hz，H-2）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）：δ200.9（C-1），177.4（C-15），164.9（C-4），161.3（C-8），154.3（C-6），152.0（C-14），145.7（C-10），116.4（C-16），113.4（C-11），107.1（C-13），103.3（C-5），102.4（C-7），91.3（C-9），57.0（C-17），46.9（C-12），34.8（C-2），28.7（C-3）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[12]一致，因此確定化合物5為aflatoxin B1。

化合物6：淺黃色粉末，分子式：C18H12O6，ESI-MSm/z：325.1[M+H]+。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：δ13.22（1H，s，OH-3），7.50（1H，t，J=8.4 Hz，H-5），6.84（2H，d，J=7.6 Hz，H-6，14），6.76（1H，d，J=8.4 Hz，H-4），6.50（1H，t，J=2.4 Hz，H-15），6.44（1H，s，H-11），5.45（1H，t，J=2.8 Hz，H-16），4.82（1H，dt，J=2.0，7.2 Hz，H-17），4.00（3H，s，CH3-18）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）：δ181.6（C-1），164.8（C-10），163.5（C-12），162.4（C-3），155.1（C-7），154.2（C-8），145.5（C-17），135.9（C-5），113.4（C-14），111.4（C-4），109.1（C-2），106.7（C-6），106.1（C-9），106.0（C-13），102.6（C-16），90.6（C-11），56.9（C-18），48.2（C-15）。以上數(shù)據(jù)與參考文獻[13]一致，因此確定化合物6為sterigmatocystin。

2.2 抗菌活性實驗結(jié)果

對化合物1～6進行了抗菌活性測試，發(fā)現(xiàn)化合物1、5、6對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌顯示微弱抗菌活性，MIC 值分別為25、25 和12.5μg/mL，陽性對照環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）的MIC 值為1.56μg/mL；化合物1、2、4～6對白色念珠菌活性與陽性對照效果相當。

表1 化合物1～6抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of compounds 1～6 （μg/mL）

3 結(jié)論

本文運用色譜、波譜等技術(shù)，從1株南美蟛蜞菊來源內(nèi)生真菌Aspergillussp.PQJ-1中分離鑒定了6個化合物，包括1個二酮哌嗪類化合物（1），1個吲哚類化合物（2），2個甾體囊素類化合物（5、6），2個其他類化合物（3、4），并對所有化合物進行抗菌活性篩選，化合物1、2、4～6對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、白色念珠菌顯示一定抗菌活性。本研究首次對南美蟛蜞菊內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物進行研究，為充分開發(fā)利用該入侵植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物提供了科學依據(jù)。