電針對(duì)缺氧缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)元自噬及IGF-1/PI3K/Akt通路的影響

曹 娟, 王紅怡, 王麗欣, 陳小寧, 林 秋,楊慶紅, 陳東追, 符玉秀

(1. 海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院, 海南 海口, 571100;2. 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)教研室, 海南 海口, 571100)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是一種因氧氣和流向大腦的腦血流減少導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損而引發(fā)的疾病，是新生兒中常見且嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是導(dǎo)致新生兒死亡的主要原因之一[1]。幸存的嬰兒通常伴有腦癱、智力低下和其他后遺癥，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量[2]。目前，臨床尚缺乏用于治療HIBD的標(biāo)準(zhǔn)和具體措施，因此迫切需要尋找新的神經(jīng)保護(hù)療法來減輕HIBD導(dǎo)致的神經(jīng)損傷。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)與HIBD關(guān)系密切，具有促進(jìn)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞增生分化和營養(yǎng)支持的功能，在腦缺血、缺氧后保護(hù)神經(jīng)元、修復(fù)受損神經(jīng)元及恢復(fù)認(rèn)知功能損害等過程中發(fā)揮重要作用，有望作為腦保護(hù)劑用于臨床缺血缺氧的治療。

自噬參與HIBD的發(fā)生，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)當(dāng)缺氧缺血刺激誘導(dǎo)自噬過度激活時(shí)會(huì)加劇腦損傷，在HIBD后通過抑制自噬激活可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究[6]顯示針刺可通過上調(diào)IGF-1的表達(dá)來改善腦卒中后血管性認(rèn)知障礙，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育，治療小兒腦性癱瘓[7]。電針是在針灸針上接通微量不連續(xù)或連續(xù)的電流，以進(jìn)一步將針刺刺激產(chǎn)生的效應(yīng)傳導(dǎo)至大腦，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)與重塑[8]。電針能提高IGF-1表達(dá)水平，改善腦梗死患者神經(jīng)功能及腦血流動(dòng)力學(xué)[9]。IGF-1主要通過調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，探討電針對(duì)新生大鼠IGF-1的影響及其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague Dawley孕鼠15只，產(chǎn)仔10～12只，購自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2019-0006, 動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為202021 563.65。將孕鼠在單獨(dú)的無菌塑料籠中飼養(yǎng)，在22～23 ℃、55%～60%濕度以及12 h光照與12 h黑暗的周期交替下進(jìn)行，孕鼠可自由進(jìn)食和飲水。使用108只7 d日齡的Sprague Dawley(SD)大鼠幼崽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，體質(zhì)量15～20 g。本研究獲得機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn){2020[倫理]第(3)號(hào))}，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器

IGF-1(瑞士Roche公司，貨號(hào)250-19); LY294002(PI3K抑制劑，北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)YT333); HE染色試劑(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司; 大鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)ZN2874-HXK); 兔抗大鼠PI3K(ab191606)、p-PI3K(ab182651)、AKT(ab18785)、p-AKT(ab38449)、LC3A/B(ab128025)、Beclin-1(ab210498)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488)(ab150077)(綠色)、小鼠抗NeuN(ab279296)、山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?594)(ab150116)(紅色)均購自英國abcam公司。

電針儀(G6805-2A)購自上海華誼醫(yī)療儀器有限公司; 透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司; iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司); 倒置熒光顯微鏡(IX73)購自日本Olympus公司。

1.3 分組、模型制備及處理

從108只新生大鼠中隨機(jī)選取18只為假手術(shù)組，均用3%的異氟烷麻醉，并在整個(gè)手術(shù)過程中以2%的麻醉劑量進(jìn)行維持。除假手術(shù)組外，其他大鼠采用左頸總動(dòng)脈結(jié)扎和低氧處理2 h的方法構(gòu)建新生大鼠HIBD模型[12]。在頸部中線做小切口，分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈; 縫合切口，將幼崽置于加熱的毯子上恢復(fù)1 h, 而后將其放入部分浸沒在37 ℃水浴中的500 mL密封廣口瓶中; 將含8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w送入廣口瓶中2 h; 將大鼠移出并暴露于空氣中，觀察大鼠的自由運(yùn)動(dòng)，然后將其放回各自的母鼠籠中。假手術(shù)組僅分離左頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎和缺氧處理。若大鼠出現(xiàn)乏力、站立不穩(wěn)、左側(cè)肢體癱瘓與提尾時(shí)左側(cè)前爪緊抱等表現(xiàn)，提示HIBD模型構(gòu)建成功。造模成功后存活72只大鼠，死亡18只，考慮到新生大鼠各器官發(fā)育不完善，造模比較艱難，故造模成功率80%屬正?？山邮艿姆秶?/p>

將模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、IGF-1組(0.2 mg/kg)[13]、電針組、電針聯(lián)合LY294002組(電針+PI3K抑制劑0.3 mg/kg)[14], IGF-1組在缺氧缺血后即刻腹腔注射IGF-1(0.2 mg/kg), 電針組在造模后2 h按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)所公認(rèn)的針灸取穴位置，選取神庭(大鼠頭前正中線，額頂骨縫交線前方)、百會(huì)穴(大鼠頭部前正中線，兩耳尖連線中點(diǎn))開始電針治療，應(yīng)用G6805-2A電針儀進(jìn)行電針刺激，電壓峰值4 V, 疏密波，以針體輕輕抖動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，頻率維持在5～10 Hz, 10 min/次, 1次/d; 電針聯(lián)合LY294002組在缺氧缺血后即刻腹腔注射LY294002(0.3 mg/kg), 造模后2 h開始電針治療，操作方法同電針組。電針治療14 d后進(jìn)行取材和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4 取材及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分: 各組大鼠在手術(shù)清醒后和電針治療結(jié)束后進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): 0分為無明顯神經(jīng)功能缺損; 1分為提尾時(shí)不能伸展對(duì)側(cè)前肢; 2分為行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn); 3為行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜; 4分為不能自主活動(dòng)或伴意識(shí)障礙。分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺陷越嚴(yán)重。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)腦組織IGF-1的含量: 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織，稱重后按1∶9的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，研磨后離心，取上清為10%的腦組織勻漿, ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠腦組織勻漿中IGF-1的含量。

1.4.3 腦組織病理學(xué)變化: 每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行麻醉，用4.0%多聚甲醛與2.5%戊二醛的混合溶液灌注，然后斷頭取腦，沿冠狀位切分為2個(gè)部分，一部分經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定，用于透射電鏡; 另一部分經(jīng)4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后行HE染色，觀察腦組織病理學(xué)變化。

1.4.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬情況: 取戊二醛溶液固定的腦組織，采用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次后, 1%鋨酸固定液, 4 ℃固定2 h。梯度酒精脫水，浸透包埋，行超薄切片(60～70 nm厚)，染色，顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)自噬小體的形成情況并拍照。

1.4.5 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)LC3與神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)的共定位表達(dá): 取1.4.3步驟中的腦組織石蠟切片，二甲苯脫蠟, 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后微波修復(fù)15 min, 正常山羊血清封閉20 min, 加入一抗(兔抗LC3和小鼠抗NeuN, 1∶100), 4 ℃孵育過夜，洗去一抗，分別加入熒光二抗(Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔和Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG, 1∶300), 37 ℃避光孵育1 h, PBS沖洗3次，抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察和拍照。

1.4.6 Western blot法檢測(cè)海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá): 每組剩余6只大鼠，取腦，分離海馬組織。按照試劑盒說明書的操作提取海馬組織中的總蛋白, BCA法測(cè)定蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣, SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜, 5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、自噬基因Beclin-1、LC3A/B, 按1∶1 000的比例稀釋; β-actin按1∶2 000的比例稀釋), 4 ℃下孵育過夜, HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h, ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

在模型制備前，所有大鼠的神經(jīng)功能均正常; 模型制備成功后，與假手術(shù)組相比，HIBD模型組大鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少、左側(cè)肢體癱瘓、提尾時(shí)左側(cè)前爪緊抱等表現(xiàn)，神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 治療結(jié)束后，與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯(lián)合LY294002組神經(jīng)功能改善，神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 分

2.2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織IGF-1的含量降低; 與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯(lián)合LY294002組大鼠腦組織IGF-1的含量增加; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組腦組織IGF-1的含量降低; 上述組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

2.3 各組大鼠腦組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列緊密，未出現(xiàn)明顯的損傷; 模型組大鼠海馬中存在嚴(yán)重的病理損傷, CA1區(qū)可見神經(jīng)元腫脹、細(xì)胞核固縮、排列疏松、神經(jīng)元密度降低; IGF-1組、電針組大鼠上述病理改變明顯減輕，神經(jīng)元密度增加; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織HE染色(放大倍數(shù)200倍)

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)自噬情況

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器形態(tài)及數(shù)量正常，未見自噬小體/溶酶體的形成; 模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，呈空泡樣變的神經(jīng)元較多，可見大量溶酶體和自噬小體形成; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區(qū)可見自噬小體/溶酶體數(shù)量減少，且細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常，可見相對(duì)完整的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組自噬小體/溶酶體數(shù)量增加。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)自噬情況(放大倍數(shù)30 000倍)

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)LC3與NeuN的共定位表達(dá)

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)未見LC3與NeuN共表達(dá)的神經(jīng)元; 模型組海馬中可見大量LC3/NeuN強(qiáng)陽性的LC3神經(jīng)元; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區(qū)LC3/NeuN共表達(dá)的神經(jīng)元明顯減少; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組LC3/NeuN共表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)量增加。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)LC3與NeuN的共定位表達(dá)(放大倍數(shù)200倍)

2.6 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達(dá)降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)升高; 與模型組相比, IGF-1組、電針組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達(dá)升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)降低; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組海馬組織p-Akt/Akt的表達(dá)降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠腦組織PI3K/Akt通路、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

HIBD可能引起永久性的腦損傷，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)殘疾甚至死亡。在缺血的早期階段，海馬神經(jīng)元很容易受損，而壞死、凋亡和自噬是神經(jīng)元死亡的主要途徑。自噬參與了HIBD的發(fā)病機(jī)制，有研究[15]認(rèn)為促進(jìn)自噬或可部分緩解HIBD病情，但當(dāng)缺氧、缺血刺激誘導(dǎo)自噬過度激活時(shí)，則會(huì)加劇腦損傷[16]。本研究結(jié)果顯示, HIBD模型大鼠具有明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，通過觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)HIBD大鼠缺血側(cè)CA1區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，溶酶體和自噬小體數(shù)量顯著增多，免疫熒光共定位結(jié)果進(jìn)一步顯示海馬LC3/NeuN共表達(dá)的神經(jīng)元顯著增多，說明HIBD大鼠海馬神經(jīng)元自噬被激活。研究[17-18]表明自噬的抑制在體內(nèi)和體外的新生兒腦缺氧、缺血模型中可以提供神經(jīng)保護(hù)作用。

針刺對(duì)HIBD的療效肯定[7-8]。研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，針刺可通過改善腦血流量、調(diào)節(jié)自噬、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達(dá)、刺激神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化等發(fā)揮對(duì)損傷腦組織的保護(hù)作用。電針是在針灸針上接通微量電流，可加強(qiáng)針刺刺激產(chǎn)生的效應(yīng)，在鎮(zhèn)痛、緩解肢體痙攣、改善運(yùn)動(dòng)障礙等方面療效顯著，具有不良反應(yīng)少、可重復(fù)性好、療效佳等優(yōu)點(diǎn)。黃金等[21]發(fā)現(xiàn)，電針可上調(diào)大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)PI3K、AKT、Beclin-1的表達(dá)，改善腦卒中后認(rèn)知障礙; 孫曉偉等[22]發(fā)現(xiàn)電針在再灌注中晚期可降低LC3A/B蛋白表達(dá)，抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬的過度激活，從而拮抗神經(jīng)元的進(jìn)一步損傷; 黃倩茹等[23]發(fā)現(xiàn)電針可促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷大鼠的發(fā)育; 上述研究均說明電針可能通過調(diào)節(jié)自噬來減輕腦缺血缺氧后的神經(jīng)元損傷。本研究結(jié)果顯示，電針干預(yù)后大鼠神經(jīng)功能缺損情況明顯減輕; HE染色和免疫熒光共定位結(jié)果顯示電針可減少海馬神經(jīng)元丟失，減少自噬小體和LC3陽性表達(dá)的神經(jīng)元的數(shù)量，減輕海馬組織損傷; 上述結(jié)果說明電針可能通過抑制自噬減輕新生大鼠HIBD。

IGF-1是一種活性單鏈多肽分子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可以透過血腦屏障，是維持神經(jīng)元存活的神經(jīng)因子之一，能對(duì)各種神經(jīng)損傷產(chǎn)生反應(yīng)，激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。UMRAN R M等[24]研究表明，新生兒在子宮內(nèi)或出生時(shí)發(fā)生缺血缺氧時(shí), IGF-1水平較低，與HIBD的預(yù)后相關(guān); 增加神經(jīng)細(xì)胞對(duì)IGF-1的分泌作用可能減輕HIBD[3-4]。實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明早期補(bǔ)充IGF-1可以減少缺氧/缺血事件后的腦損傷[25-26]。本研究結(jié)果也顯示，與正常新生大鼠相比, HIBD大鼠腦組織中IGF-1水平顯著降低，而給予IGF-1和電針干預(yù)后, IGF-1的水平明顯增加，海馬神經(jīng)元損傷減輕，說明電針可能是通過上調(diào)IGF-1的表達(dá)而減輕新生大鼠HIBD。PI3K/Akt信號(hào)通路是其發(fā)揮作用的主要通路, Akt是PI3K途徑的中心介質(zhì), IGF-1與其受體結(jié)合后，可通過PI3K激活A(yù)kt的磷酸化，進(jìn)一步磷酸化下游的mTOR及其他靶蛋白，從而介導(dǎo)炎癥、自噬和凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)，并對(duì)新生大鼠腦缺氧缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。WANG X W等[5]發(fā)現(xiàn)IGF-1通過IGF-1R/PI3K-Akt-mTOR途徑抑制帕金森病動(dòng)物和細(xì)胞模型中的過度自噬; ZHAO B等[27]發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血性腦病中, IGF-1可改善缺氧引起的磷酸化Akt的下調(diào)，保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的凋亡。本研究結(jié)果顯示，給予IGF-1和電針干預(yù)后, HIBD大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達(dá)顯著升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)顯著降低；使用PI3K的抑制劑LY294002能顯著降低IGF-1的水平，減弱電針對(duì)海馬組織IGF-1/PI3K/Akt通路的激活和海馬神經(jīng)元自噬的抑制作用; 上述結(jié)果提示電針可能通過激活I(lǐng)GF-1/PI3K/Akt通路來抑制HIBD大鼠海馬神經(jīng)元過度自噬。

綜上所述，電針可能通過激活I(lǐng)GF-1/PI3K/Akt通路而抑制海馬神經(jīng)元過度自噬，減輕新生大鼠HIBD。由于自噬的雙重作用，在腦缺氧缺血的不同時(shí)期，電針可能發(fā)揮不同的作用，其在腦缺氧、缺血的早期對(duì)自噬的影響有待進(jìn)一步的研究。