系統(tǒng)性硬化癥相關(guān)間質(zhì)性肺病、特發(fā)性肺纖維化與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型重疊基因的相關(guān)性分析

丁麗麗, 劉軒綺, 孫曉林, 高雅靜, 武志慧, 王永福

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 1. 風(fēng)濕免疫科, 2. 中心實(shí)驗(yàn)室/內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 包頭, 014010)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、遷移、免疫反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。TGF-β通常以前體的形式合成，需要進(jìn)一步激活以觸發(fā)其下游的經(jīng)典或非經(jīng)典途徑[2-3]。研究[4-6]表明, TGF-β可通過(guò)激活經(jīng)典的Smads通路來(lái)促進(jìn)纖維化相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄，包括α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP), 其可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化和ECM沉積，導(dǎo)致組織器官纖維化。TGF-β介導(dǎo)的非經(jīng)典的Smads信號(hào)通路也可以上調(diào)促纖維化因子的表達(dá)，導(dǎo)致ECM過(guò)度產(chǎn)生，參與到纖維化過(guò)程中[7]。系統(tǒng)性硬化癥(SSc)是一種局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟結(jié)締組織纖維化、硬化及萎縮的結(jié)締組織疾病，該病較罕見(jiàn)，女性多見(jiàn)。30%的SSc患者可并發(fā)間質(zhì)性肺病(ILD)。ILD是SSc患者最常見(jiàn)的死亡原因, 10年病死率高達(dá)40%[8-11]。SSc的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，其中TGF-β及相關(guān)細(xì)胞因子啟動(dòng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)SSc纖維化的形成[12]。TGF-β通路可直接作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)2型先天淋巴樣細(xì)胞向促纖維化表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-10 (IL-10)產(chǎn)生減少，膠原合成增加，促進(jìn)SSc纖維化[13]。

TGF-β生成增加不僅能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，還可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)失調(diào)，上調(diào)纖維化標(biāo)志物α-SMA、纖維連接蛋白和波形蛋白的表達(dá)，加重SSc肺纖維化[14]。特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種病因不明的慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺病，診斷IPF后，患者的中位生存期為2～4年[15]。目前研究[16]認(rèn)為肺纖維化是肺泡上皮反復(fù)微損傷的結(jié)果。肺泡上皮細(xì)胞在修復(fù)過(guò)程中，釋放過(guò)多的TGF-β等促纖維化因子[17]。促纖維化介質(zhì)激活并促進(jìn)駐留的成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生過(guò)量的ECM[18]。成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞的聚集和ECM的沉積，破壞了正常的肺結(jié)構(gòu)，阻礙了氣體交換，進(jìn)而加重IPF[19]。雖然上述兩種疾病的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但TGF-β信號(hào)的異常均可誘發(fā)或促進(jìn)系統(tǒng)性硬化癥間質(zhì)性肺病(SSc-ILD)和IPF發(fā)展。本研究分析SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型重疊基因的相關(guān)性，探討TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)通路是否可以作為SSc-ILD和IPF共同的致病途徑，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究利用Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫(kù) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[20]獲取GSE76808、GSE135099基因芯片數(shù)據(jù)，研究類型均為Expression profiling by array, 2個(gè)數(shù)據(jù)源分別在GPL570和GPL13534平臺(tái)上檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理: 通過(guò)R軟件“tidyverse”包將GSE76808、GSE135099原始數(shù)據(jù)中的“ID-REF”轉(zhuǎn)換為“Gene Symbol”。使用R軟件的“l(fā)imma”包篩選出差異性表達(dá)的基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為adj.Pvalue<0.05和|logFC|>1。利用R軟件將差異基因進(jìn)行處理并繪制火山圖。

1.2.2 獲取重疊基因: 對(duì)差異基因交互制作韋恩圖，利用R軟件對(duì)重疊基因進(jìn)行基因本體(GO)功能注釋、京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集及可視化。

1.2.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選分析hub基因: 從String數(shù)據(jù)庫(kù)[21]搜索重疊基因間的相互作用關(guān)系，將PPI關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)Degree值將重疊基因排序，利用“GO”插件篩選出hub基因。通過(guò)在線網(wǎng)站TISIDB(http://cis.hku.hk/TISIDB/)[22]對(duì)hub基因功能和通路富集進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中差異性表達(dá)的基因

本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的GSE76808、GSE135099數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組(NC組)相比, SSc-ILD中有279個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，362個(gè)基因表達(dá)下調(diào); 與NC組相比, IPF中存在820個(gè)高表達(dá)的基因, 1 350個(gè)低表達(dá)的基因; 與NC組相比, TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中存在1 562個(gè)上調(diào)的基因, 2 416個(gè)下調(diào)的基因。見(jiàn)圖1。

A: 與NC組相比, SSc-ILD中差異性表達(dá)的基因; B: 與NC組相比, IPF中差異性表達(dá)的基因; C: 與NC組相比, TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中差異性表達(dá)的基因。圖1 SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中差異性表達(dá)的基因

2.2 SSc-ILD差異性表達(dá)的基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型差異性表達(dá)的基因中的重疊基因

將上述篩選出的SSc-ILD中279個(gè)高表達(dá)基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中1 562個(gè)高表達(dá)基因進(jìn)行交互分析，得到41個(gè)上調(diào)的重疊基因; SSc-ILD中362個(gè)低表達(dá)基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的2 416個(gè)低表達(dá)基因交互結(jié)果顯示，有67個(gè)下調(diào)的重疊基因。對(duì)上述重疊基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，重疊的上調(diào)基因可能參與了早期內(nèi)體的形成; 重疊的下調(diào)基因可能在白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝病等方面具有重要的調(diào)節(jié)功能。見(jiàn)圖2。

A、B: 分別為SSc-ILD與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中高表達(dá)、低表達(dá)基因的重疊基因韋恩圖; C、D: 分別為SSc-ILD與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中高表達(dá)、低表達(dá)的重疊基因GO分析結(jié)果。圖2 SSc-ILD差異性表達(dá)的基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型差異性表達(dá)的基因中的重疊基因

2.3 IPF差異性表達(dá)的基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型差異性表達(dá)的基因中的重疊基因

對(duì)篩選出的IPF中820個(gè)上調(diào)的基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的1 562個(gè)上調(diào)基因進(jìn)行交互，獲得391個(gè)高表達(dá)的重疊基因; IPF中下調(diào)的1 350個(gè)基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中的2 416個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行交互，獲得957個(gè)低表達(dá)的重疊基因。對(duì)上述重疊基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，重疊的上調(diào)基因主要富集在中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞脫顆粒、蛋白翻譯后修飾、蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的加工與運(yùn)輸?shù)确矫? 重疊的下調(diào)基因可能在氧化磷酸化、ATP酶活性等方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)圖3。

A、B: 分別為IPF與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型差異表達(dá)基因中的重疊基因韋恩圖; C、D: 分別為IPF與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型中上調(diào)和下調(diào)的重疊基因GO分析結(jié)果。圖3 IPF差異性表達(dá)的基因與TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型差異性表達(dá)的基因中的重疊基因

2.4 SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型之間的重疊基因

分別將SSc-ILD&TGF-β重疊基因與IPF&TGF-β重疊基因進(jìn)行交互，發(fā)現(xiàn)在上調(diào)基因中存在12個(gè)重疊基因，在下調(diào)基因中存在34個(gè)重疊基因。見(jiàn)圖4。

A: SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型之間共同上調(diào)基因的韋恩圖; B: SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型之間共同下調(diào)基因的韋恩圖。圖4 SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型之間的重疊基因韋恩圖

2.5 重疊基因的PPI分析

對(duì)SSc-ILD、IPF、TGF-β誘導(dǎo)的肺纖維化模型之間的重疊基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)12個(gè)基因在蛋白水平?jīng)]有出現(xiàn)相互作用，下調(diào)的34個(gè)基因中存在PPI并得到hub基因ELAVL1。見(jiàn)圖5、表1。

圖5 重疊基因PPI分析結(jié)果

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)分析中前21個(gè)基因

2.6 GO和KEGG對(duì)hub基因功能和通路的分析

GO分析結(jié)果顯示,ELAVL1基因參與RNA剪接、加工、翻譯等多種轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程見(jiàn)表2、表3; KEGG分析結(jié)果顯示,ELAVL1基因僅在腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路中存在富集。

表2 GO分析ELAVL1基因

表3 GO分析ELAVL1基因

3 討 論

肺纖維化是多種間質(zhì)性肺病的終末期，會(huì)引起不可逆性肺損傷，其特征是正常肺泡結(jié)構(gòu)被破壞, ECM過(guò)度沉積導(dǎo)致患者肺部氣體交換受阻，呼吸功能不全，甚至死亡。SSc-ILD和IPF患者在人口學(xué)特征和致病因素上有所不同，但這兩種疾病均可導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)纖維化，最終進(jìn)展為呼吸衰竭，其中持續(xù)存在的異常TGF-β信號(hào)在肺纖維化中起著關(guān)鍵作用[23]。SSc-ILD中，先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷。同時(shí), TGF-β信號(hào)的異常激活可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，以及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致ECM過(guò)度積聚，促進(jìn)SSc-ILD[24]。IPF的形成起源于肺泡上皮的慢性損傷和(或)老化，導(dǎo)致異常的傷口愈合反應(yīng)以及持續(xù)產(chǎn)生促炎和促纖維化因子，這最終導(dǎo)致血管周圍和間質(zhì)內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞的活化和分化。TGF-β信號(hào)升高是IPF的重要標(biāo)志，其可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，上調(diào)膠原蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致ECM產(chǎn)生增多[25]。

家族性肺纖維化的存在和罕見(jiàn)的遺傳性疾病中肺纖維化的發(fā)生促使研究人員關(guān)注到宿主遺傳背景在影響SSC-ILD和IPF患者病程和病情發(fā)展中的重要作用[26]。2019年由10 000名歐洲患者組成的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)確定了23個(gè)與SSc相關(guān)的獨(dú)立基因座，使得已知的SSc風(fēng)險(xiǎn)基因座總數(shù)增加到28個(gè)，并且這些SSc風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)相關(guān)的大多數(shù)基因產(chǎn)物與炎癥和自身免疫有關(guān)[27]。此外，與普通人群相比, SSc患者和家庭聚集性強(qiáng)的患者的一級(jí)親屬罹患SSc的風(fēng)險(xiǎn)更高，估計(jì)風(fēng)險(xiǎn)約為1.6%, 表明SSc具有基因遺傳傾向[28]。在IPF中，端粒相關(guān)基因(TERT、TERC、PARN、RTEL1、DKC1、TINF2)、表面活性物質(zhì)編碼基因(SFTPC、SFTPA1、SFTPA2)的罕見(jiàn)變異和20個(gè)獨(dú)立基因座的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)在散發(fā)性IPF疾病風(fēng)險(xiǎn)中增高，占25%～30%, 并且在IPF的發(fā)病機(jī)制中，與這些位點(diǎn)相關(guān)的基因在對(duì)端粒完整性、細(xì)胞黏附、纖維化和宿主防御途徑方面扮演著重要的角色[29-30]?；赥GF-β在纖維化過(guò)程、SSc-ILD和IPF中的作用，以及SSC-ILD和IPF發(fā)生的基因遺傳背景，本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取SSc-ILD、TGF-β和IPF相關(guān)基因數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)上述數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn), SSc-ILD、IPF分別與TGF-β誘導(dǎo)的纖維化模型存在相同的基因。SSc-ILD與TGF-β誘導(dǎo)的纖維化模型共同上調(diào)的基因參與早期內(nèi)體的形成，而共同下調(diào)的基因在調(diào)節(jié)IL-17信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。IPF與TGF-β誘導(dǎo)的纖維化模型共同的上調(diào)基因參與了中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞脫顆粒、蛋白翻譯后修飾、加工與運(yùn)輸?shù)鹊恼{(diào)節(jié); 共同的下調(diào)基因可能在氧化磷酸化、ATP酶活性等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TGF-β信號(hào)可能通過(guò)調(diào)控基因的上述功能分別參與SSC-ILD和IPF的發(fā)病過(guò)程。

本研究將SSc-ILD&TGF-β重疊基因與IPF&TGF-β重疊基因進(jìn)行交互，發(fā)現(xiàn)存在12個(gè)重疊高表達(dá)基因; 在下調(diào)基因中存在34個(gè)重疊基因。上述重疊基因的PPI分析發(fā)現(xiàn)，在重疊的12個(gè)高表達(dá)基因中不存在蛋白互作，但在34個(gè)低表達(dá)基因中存在蛋白互作，并獲得hub基因ELAVL1。ELAVL1基因可以編碼胚胎致死性異常視覺(jué)(ELAV)家族中的人抗原R(HuR), 即ELAVL1蛋白，其是一種RNA結(jié)合蛋白(RBP)。HuR廣泛表達(dá)于多種組織中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后機(jī)制參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種分子的表達(dá)[31]。在靜息細(xì)胞中, HuR主要定位于細(xì)胞核，當(dāng)受到紫外線輻射、營(yíng)養(yǎng)耗竭或免疫激活等應(yīng)激條件的刺激時(shí), HuR結(jié)合并將靶mRNA運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)，起到調(diào)節(jié)靶mRNA的穩(wěn)定性和(或)翻譯的作用[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn), HuR能夠調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和干擾素-γ)、促炎介質(zhì)INOS和趨化因子MCP-1mRNA的表達(dá)，這些因素大多參與了肝纖維化的發(fā)病過(guò)程。TGF-β通過(guò)影響HuR對(duì)mRNA穩(wěn)定性和翻譯率的調(diào)節(jié)在肝纖維化發(fā)展中的基因表達(dá)調(diào)控方面起著重要作用。本研究GO功能分析同樣發(fā)現(xiàn),ELAVL1基因參與調(diào)節(jié)RNA剪接、加工、翻譯等多種轉(zhuǎn)錄后修飾; 同時(shí),ELAVL1能夠與雙鏈DNA、mRNA結(jié)合，發(fā)揮至關(guān)重要的分子功能，表明ELAVL1基因可能通過(guò)編碼ELAVL1蛋白(HuR)參與SSC-ILD和IPF多種纖維化分子mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

在IPF中，人肺成纖維細(xì)胞經(jīng)TGF-β處理后, HuR由胞核向胞漿轉(zhuǎn)位明顯增加。在肺纖維化小鼠模型中，肺組織細(xì)胞的胞漿HuR顯著高于對(duì)照組。HuR可能通過(guò)促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化以及增加易感個(gè)體ECM的產(chǎn)生參與肺纖維化[34]。本研究TGF-β誘導(dǎo)的纖維化模型、IPF和SSc-ILD中均出現(xiàn)差異性表達(dá)的ELAVL1基因，表明TGF-β可能通過(guò)誘導(dǎo)IPF與SSc-ILD肺成纖維細(xì)胞中的HuR從胞核向胞漿移動(dòng)，調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致ECM產(chǎn)生異常，參與兩種疾病的發(fā)展。AMPK是多條代謝途徑的中樞調(diào)節(jié)因子，作為TGF-β/Smads通路的上游信號(hào)分子，對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖、分化和ECM的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)是必不可少的[35]。血管緊張素Ⅱ可誘導(dǎo)心肌纖維化并伴有TGF-β過(guò)度表達(dá)、Smad2/3高磷酸化和Smad4表達(dá)上調(diào)。黃芩苷可通過(guò)激活A(yù)MPK, 抑制TGF-β/Smads通路，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖和ECM積聚，緩解心肌纖維化[36]。本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),ELAVL1基因富集在AMPK信號(hào)通路中。一項(xiàng)探究HuR是否參與氣道平滑肌增殖的研究[37]指出, HuR是唯一一個(gè)在真核細(xì)胞中普遍表達(dá)的蛋白; HuR的表達(dá)或活性可能受到多種上游刺激的影響，如炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子、活性氧蔟(ROS)和缺氧。另外，激活A(yù)MPK可有效抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)的HuR胞漿易位，揭示了ELAVL1蛋白與AMPK信號(hào)通路之間的潛在聯(lián)系。因此，作者推測(cè)在SSc-ILD和IPF中, AMPK信號(hào)異?？赡軐?dǎo)致TGF-β產(chǎn)生增多，過(guò)度產(chǎn)生的TGF-β可能通過(guò)誘導(dǎo)HuR由胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，進(jìn)而參與肺纖維化的調(diào)節(jié)。但確切的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步開(kāi)展大樣本的研究，對(duì)本研究中的關(guān)鍵結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，為闡明SSc-ILD和IPF共同的發(fā)病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。