• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同滅菌方式對(duì)商品乳外泌體完整性的影響

    2022-07-26 10:45:18尚鵬遠(yuǎn)曹業(yè)東李和平郭心雨王月影鐘凱
    中國(guó)乳品工業(yè) 2022年7期
    關(guān)鍵詞:泌體透射電鏡巴氏

    尚鵬遠(yuǎn),曹業(yè)東,李和平,郭心雨,王月影,鐘凱

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,鄭州 450000)

    0 引言

    外泌體,是直徑在30~150 nm的膜性小囊泡,其內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸分子等物質(zhì)。外泌體通過將其內(nèi)容物傳遞給受體細(xì)胞從而影響受體細(xì)胞的生理功能[1]。外泌體的結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)特征較特殊,例如具有脂雙層膜結(jié)構(gòu),密度為1.10~1.21 g/mL,通常在負(fù)染條件下呈現(xiàn)典型的“杯盤狀”結(jié)構(gòu)[2]。研究表明,外泌體已經(jīng)在許多生物液中鑒定出,例如:血液,唾液和尿液[3-4]。在人類母乳和牛乳中也已鑒定出外泌體,乳汁中的外泌體大多為哺乳動(dòng)物的乳腺上皮細(xì)胞(MEC)所釋放的[5-8]。這些來自母乳的外泌體被母乳接受者系統(tǒng)地吸收,其在嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。它們有助于調(diào)節(jié)新生嬰兒的生長(zhǎng)、組織成熟、代謝和免疫程序[10-11]。因此,外泌體系統(tǒng)或許是為母嬰之間的信息交流而發(fā)展起來的,在哺乳動(dòng)物幼崽出生后對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

    牛乳由于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,成為人類重要的飲食來源,因此牛乳外泌體是我們?nèi)粘I钪薪佑|較多的外源外泌體。由于原料乳不是無菌的,而且可能含有病原體,為了使人們能夠安全飲用牛乳,需要對(duì)牛乳進(jìn)行滅菌[12]。目前,商品乳常用的滅菌方式有巴氏滅菌法和超高溫瞬間滅菌法,巴氏滅菌法是在72~78℃,加熱至少15 s[12];UHT是135℃以上加熱時(shí)間不少于1 s[13]。所有這些工業(yè)處理步驟都會(huì)對(duì)乳中生物活性成分產(chǎn)生影響,進(jìn)而可能會(huì)影響它們的功能[14]。

    研究報(bào)道,牛乳外泌體對(duì)初生幼仔具有免疫調(diào)節(jié),促進(jìn)腸道發(fā)育等功能,還可以作為一些疾病治療藥物的載體[15],目前,尚不清楚熱處理等工業(yè)加工步驟對(duì)牛乳外泌體會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響。因此,選取市場(chǎng)常見的巴氏滅菌乳和UHT乳,超速差速離心法提取外泌體,采用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM),納米顆粒示蹤(nanosight analysis,NTA)法,以及western blotting法檢測(cè)外泌體形態(tài)、粒徑范圍及標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況,探索工業(yè)加工對(duì)牛乳中外泌體的基本特征及生物活性的影響。

    1 材料和方法

    1.1 乳樣采集

    本試驗(yàn)所用商品乳均采購于本地超市,分別購買了3個(gè)品牌的巴氏滅菌乳(n=3)及超高溫滅菌乳(n=3),生產(chǎn)日期相近,儲(chǔ)存方式相同。生牛乳來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)(n=6)。

    1.2 主要試劑

    Phosphate Buffered Saline緩沖液,HyClong;濃鹽酸、氫氧化鈉、雙蒸水、SDS聚丙烯酰胺凝膠試劑(去離子水,30%Arc-Bis,1.5 mol/L Tris-HCL(pH:8.8)、10%AP,TEMED,1 mol/L Tris-HCL,10%SDS)、BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(試劑A:BCA堿性溶液,試劑B:硫酸銅溶液,試劑C:標(biāo)準(zhǔn)BCA蛋白:1 mg/mL),北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;一抗:小鼠Anti-CD63抗體、小鼠Anti-TSG101抗體,abcam;二抗:HRF-Goat Anti-Mouse IgG (H+L),武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);吐溫-20、牛血清白蛋白,Solarbio;Omni-ETLTM超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒,雅酶、ECL Femtolight Substrate、ECL Femtolight Oxidant等。

    1.3 主要器材

    HT-7700透射電鏡,日本Hitachi;Nanosight NS300,Malvern;超速離心機(jī)(型號(hào)Optima XE-100 Ultracentrifuge,轉(zhuǎn)子型號(hào)SW 40 Ti Rotor),BECKAMAN COULYER;pH儀,中國(guó)TIMEPOWER;高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf;0.22μm針頭式過濾器,中國(guó)biosharp;1、50、20 mL注射器,中國(guó) 曙光健士;BBA124S天平,中國(guó)OLABO;-80℃冰箱,日本SANYO;4℃立式冷藏柜;-20℃低溫保存箱,中國(guó)Haier;微量移液器,德國(guó)Eppendorf;漩渦振蕩器,IKA;恒溫?fù)u床,德國(guó)Eppendorf;電泳槽,轉(zhuǎn)膜儀,GenScript;顯影儀,Amersham Imager 600;酶標(biāo)儀,Thermo等。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 差速超速離心法提取牛乳外泌體

    離心機(jī)預(yù)冷至4℃,3 000g,離心10 min,棄去沉淀;上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,2 000g,離心10 min,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管,重復(fù)一次;HCL和NaOH將樣品pH調(diào)至4.7左右,4℃冰箱靜置1 h;靜置之后,10 000g,離心30 min,棄去沉淀,收集上清,轉(zhuǎn)移至新的離心管中,重復(fù)兩次;將得到的透明乳清用0.22μm過濾器過濾后,進(jìn)行超高速離心,120 000g,4℃,離心70 min,將得到的外泌體富集于一個(gè)離心管,重復(fù)一次;將得到的外泌體用約500μL PBS吹打混勻,-80℃冰箱中冷凍保存。

    1.4.2 透射電鏡觀察(TEM)外泌體形態(tài)

    差速超速離心法分離組分用60~110μL 2%多聚甲醛重懸(4℃可保存一周);然后滴5μL的外泌體懸液至銅網(wǎng)上,室溫靜置20 min;用PBS漂洗,5 min,3次;1%戊二醛固定5 min;雙蒸水漂洗,2 min,10次;4%醋酸雙氧軸負(fù)染5 min;濾紙吸取殘液,室溫晾干;上機(jī)觀察。

    “沒錯(cuò),是丁達(dá)。他沒事,壺天曉和鏡心羽衣也沒事,都在他肚子里裝著呢!”宴西園乘著他的棕色翼龍,低空盤旋著,向丁達(dá)飛去。

    1.4.3 納米顆粒示蹤法(NTA)檢測(cè)外泌體粒徑范圍

    300μL的1×PBS進(jìn)行重懸外泌體,得到外泌體重懸液;然后打開儀器電源、打開NTA 2.1 Analytical Software電腦軟件;向外泌體重懸液加入10 mL的1×PBS溶液,得到二次稀釋液;進(jìn)行樣品測(cè)試前,用純水沖洗樣品池;然后把樣品打入樣品池中,上機(jī)觀察。

    1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

    按照BCA試劑盒說明書對(duì)提取的外泌體濃度進(jìn)行測(cè)定;外泌體溶液中加入5×SDS震蕩混勻;99℃,10 min進(jìn)行變性;樣品進(jìn)行10%聚丙烯凝膠電泳;轉(zhuǎn)膜;BSA封閉;加入一抗孵育,TSG101(1∶2 000),CD63(0.5μg/mL);洗膜;二抗(1∶5 000)孵育;洗膜;顯影。

    2 結(jié)果分析

    2.1 不同滅菌方式商品乳中外泌體的形態(tài)學(xué)觀察

    透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),生牛乳、UHT牛乳及巴氏滅菌乳中的外泌體均邊緣清晰,部分有凹陷,近似球形,都有典型“杯盤”形態(tài),如圖1所示。不同的工業(yè)加工方式對(duì)透射電鏡觀察到的牛乳中外泌體的形態(tài)幾乎沒有影響。

    圖1 牛乳外泌體透射電鏡觀察

    2.2 不同滅菌方式對(duì)商品乳中外泌體粒徑范圍的影響

    生牛乳的外泌體粒徑范圍在70~300 nm,如圖2所示,超出了正常外泌體地30~150 nm粒徑范圍,如圖2所示。商品乳的外泌體粒徑范圍都在30~150 nm之間,如圖3所示。不同牛乳外泌體的平均粒徑和濃度如表1所示。從表中可以看出,生牛乳外泌體的平均粒徑要極顯著的大于巴氏滅菌乳和超高溫滅菌乳外泌體的平均粒徑(P<0.0001);兩種滅菌方式的商品乳外泌體的平均粒徑之間沒有差異(P>0.05),如圖4(a)。巴氏滅菌乳和超高溫滅菌乳的外泌體的濃度都要顯著大于生牛乳外泌體的濃度(P<0.05),不同滅菌方式的商品乳的外泌體濃度之間沒有差異(P>0.05),如圖4(b)。由于生牛乳中存在許多微生物,他們可以吸附外泌體,導(dǎo)致外泌體發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象,而經(jīng)過滅菌之后,外泌體團(tuán)散開成為單個(gè)的外泌體,所以生牛乳外泌體與滅菌乳外泌體相比,平均粒徑偏大,濃度偏小。

    圖4 外泌體平均粒徑和濃度分析

    表1 不同品牌商品乳外泌體的平均粒徑和濃度

    圖2 生牛乳外泌體的粒徑分布

    圖3 不同品牌商品乳外泌體的粒徑分布

    2.3 Western blot分析

    圖5 WB條帶圖

    3 結(jié)果與討論

    牛乳是哺乳動(dòng)物幼仔最主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源,牛乳中富含生物活性成分對(duì)新生幼仔的腸道發(fā)育和自身免疫的建立具有重要作用。外泌體是新近發(fā)現(xiàn)的牛乳中有一種具有生物活性的成分,有研究表明,外泌體在新生兒的胃腸道和免疫系統(tǒng)的發(fā)育中同樣發(fā)揮重要作用[16-18]。但是,在流行病學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)成人過多的攝入巴氏滅菌牛乳可能會(huì)增加肥胖[19-20]、Ⅱ型糖尿病[21]、骨質(zhì)疏松癥[22-23]、常見癌癥(直腸癌[24]、乳腺癌[25]等)以及帕金森等疾病[26]的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),其原因很可能是牛乳中富含的外泌體所導(dǎo)致的,因此,有研究者提出,巴氏滅菌牛乳中的外泌體也許是不應(yīng)該到達(dá)人類食物鏈的新的病原體[27]。

    牛乳中的外泌體對(duì)于人類,特別是成人健康的影響是利還是弊目前存在分歧[27]。人們?nèi)粘o嬘玫呐H槎际墙?jīng)過工業(yè)加工的商品乳。商品乳中的外泌體是否受到了工業(yè)加工的影響,是否仍具有生物學(xué)活性目前仍無定論[28-29]。因此,本研究從生牛乳、巴氏滅菌乳、UHT乳中分離的外泌體,比較其基本生物學(xué)特征的的差異,推測(cè)其生物活性可能改變。

    本實(shí)驗(yàn)采用稍加改進(jìn)的差速超速離心法分離牛乳中的外泌體,由于牛奶中含有大量的蛋白,我們利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀法,先將牛奶的pH調(diào)至4.7左右,使乳中含量最多的酪蛋白沉淀,然后對(duì)乳清進(jìn)行差速超速離心從而得到外泌體。

    通過透射電鏡觀察,我們發(fā)現(xiàn)從生牛乳和兩種滅菌方式的商品乳中分離的外泌體形態(tài)上沒有差異,都呈現(xiàn)典型的“杯盤”狀外觀。但是之前有研究者報(bào)道,運(yùn)用冷凍電鏡對(duì)不同滅菌方式的商品乳中的外泌體進(jìn)行觀察,生牛乳中分離的外泌體呈“杯盤”狀,脂質(zhì)雙層清晰;而巴氏滅菌牛乳中分離的外泌體呈不完全球形,膜完整性受到影響;在UHT乳中已經(jīng)觀察不到完整的外泌體[30]。這表明采用不同實(shí)驗(yàn)手段對(duì)外泌體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果將產(chǎn)生影響。

    對(duì)不同滅菌方式商品乳外泌體的粒徑范圍和濃度的研究中,我們發(fā)現(xiàn)商品乳的外泌體粒徑都在30~150 nm之間,平均粒徑都在72 nm左右,結(jié)果提示我們不同加工方式對(duì)于牛乳外泌體粒徑范圍沒有影響。但是,本研究中生牛乳外泌體的粒徑范圍在70~300 nm,超出了正常外泌體30~150 nm的范圍,原因可能使因?yàn)樯H橹泻休^多微生物,微生物可以吸附外泌體,使外泌體出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。通過比較巴氏滅菌乳和UHT乳中外泌體的濃度,我們發(fā)現(xiàn)UHT乳外泌體的濃度都要比巴氏滅菌乳外泌體的濃度高,不同品牌的商品乳趨勢(shì)一致,這與粒徑范圍的變化相一致。

    通過檢測(cè)商品乳和生牛乳外泌體進(jìn)行標(biāo)志性蛋白,我們發(fā)現(xiàn)商品乳中外泌體的蛋白信號(hào)與生牛乳外泌體蛋白信號(hào)相比,下降許多。外泌體相關(guān)蛋白的信號(hào)減弱可能是由于檢測(cè)抗體缺乏對(duì)表位的識(shí)別所致。事實(shí)上,一些牛奶蛋白是熱敏性的,加熱會(huì)導(dǎo)致這些蛋白的變性、聚集和糖基化,可能會(huì)阻礙抗體結(jié)合,從而限制了在蛋白質(zhì)印跡分析中的檢測(cè)[30-31]。但是結(jié)果顯示TSG101的信號(hào)強(qiáng)度要明顯比CD63的信號(hào)強(qiáng),推測(cè)可能由于TSG101蛋白的熱穩(wěn)定要比CD63蛋白好。有研究表明,商品乳外泌體中的大部分的含量有所減少[30]。本實(shí)驗(yàn)因提出的商品乳外泌體中的miRNA濃度太低,未能對(duì)miRNA進(jìn)行定量檢測(cè),這也說明了工業(yè)加工將對(duì)乳中外泌體產(chǎn)生影響。

    本研究對(duì)不同滅菌方式的牛乳外泌體進(jìn)行形態(tài),粒徑,數(shù)量和一些標(biāo)志蛋白的檢測(cè),結(jié)果表明,工業(yè)加工對(duì)乳中外泌體的完整性產(chǎn)生影響,進(jìn)而將影響外泌體的生物活性。不同乳制品對(duì)人類健康的影響是復(fù)雜多樣的,需要更進(jìn)一步的深入研究。

    猜你喜歡
    泌體透射電鏡巴氏
    Hepatology International|肝細(xì)胞癌中外泌體miR-200b-3p介導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化的機(jī)制
    阿爾茨海默病患者血液中外泌體miR-223及NLRP3表達(dá)水平及臨床意義
    釋放巴氏新小綏螨可滿足對(duì)蘋果全爪螨的防治需求
    微流控技術(shù)在外泌體分離分析中的研究進(jìn)展
    色譜(2021年9期)2021-09-06 09:47:36
    電子顯微學(xué)專業(yè)課的透射電鏡樣品制備實(shí)習(xí)課
    透射電子顯微鏡在實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究中的應(yīng)用
    山東化工(2020年15期)2020-02-16 01:00:12
    世界首例外泌體靶向緩釋微球生物支架研制成功
    基于大數(shù)據(jù)的透射電鏡開放共享實(shí)踐與探索
    透射電鏡中正空間—倒空間轉(zhuǎn)換教學(xué)探討
    巴氏殺菌水牛奶在不同儲(chǔ)存條件下微生物增長(zhǎng)規(guī)律的研究
    乱人伦中国视频| 免费看不卡的av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久ye,这里只有精品| 22中文网久久字幕| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久精品免费免费高清| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| a级毛色黄片| av国产精品久久久久影院| 精品一区在线观看国产| 九色成人免费人妻av| av免费在线看不卡| av免费观看日本| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| av一本久久久久| 在线观看三级黄色| 各种免费的搞黄视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日本午夜av视频| 久久99蜜桃精品久久| 午夜日本视频在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 人成视频在线观看免费观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲成色77777| 国产又色又爽无遮挡免| 国产色婷婷99| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久久久精品古装| 国产乱来视频区| 国产成人欧美| 亚洲成人一二三区av| 一级黄片播放器| 最近的中文字幕免费完整| 久久青草综合色| 天美传媒精品一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 日韩伦理黄色片| 中文欧美无线码| 大陆偷拍与自拍| 欧美激情国产日韩精品一区| 在线观看免费视频网站a站| 夜夜爽夜夜爽视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 婷婷成人精品国产| 激情视频va一区二区三区| 少妇熟女欧美另类| 免费日韩欧美在线观看| 久久久国产一区二区| www.色视频.com| 亚洲国产av影院在线观看| 熟女电影av网| 久久久久国产网址| 国产又色又爽无遮挡免| 一个人免费看片子| 午夜影院在线不卡| 久久99热6这里只有精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 精品少妇久久久久久888优播| 午夜久久久在线观看| 两性夫妻黄色片 | 国产一区二区在线观看av| 国产精品成人在线| 最近中文字幕2019免费版| 波野结衣二区三区在线| 99国产综合亚洲精品| 伊人亚洲综合成人网| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产极品天堂在线| 69精品国产乱码久久久| 成人国语在线视频| 久久久精品94久久精品| 国产激情久久老熟女| 日韩中字成人| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 最近中文字幕2019免费版| 免费看光身美女| 不卡视频在线观看欧美| 少妇精品久久久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美3d第一页| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品日本国产第一区| 免费黄色在线免费观看| a 毛片基地| 99久久精品国产国产毛片| 热99国产精品久久久久久7| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产av新网站| 日韩精品有码人妻一区| 女人精品久久久久毛片| 国产精品一区二区在线不卡| 在线观看免费高清a一片| 国产在视频线精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久精品94久久精品| 激情五月婷婷亚洲| 看免费av毛片| 久久影院123| xxx大片免费视频| 亚洲精品乱久久久久久| 成人国语在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 色5月婷婷丁香| 亚洲,欧美精品.| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 91久久精品国产一区二区三区| 色哟哟·www| 伦理电影免费视频| 国精品久久久久久国模美| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一本大道久久a久久精品| 51国产日韩欧美| 大片免费播放器 马上看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产av国产精品国产| 色视频在线一区二区三区| av天堂久久9| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 久久影院123| 国产视频首页在线观看| 少妇的逼好多水| 欧美国产精品一级二级三级| 国产视频首页在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久热在线av| 久久热在线av| 免费观看性生交大片5| 久久97久久精品| 亚洲国产精品一区三区| 免费av中文字幕在线| 在线观看国产h片| 最近中文字幕高清免费大全6| 黑人欧美特级aaaaaa片| 性色avwww在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲精品一区蜜桃| 老熟女久久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久热久热在线精品观看| 国产一级毛片在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 999精品在线视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久人妻| 97在线人人人人妻| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 中文欧美无线码| 亚洲国产av新网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品久久久久成人av| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲国产精品999| 欧美精品一区二区大全| 视频区图区小说| 日韩大片免费观看网站| 国国产精品蜜臀av免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 春色校园在线视频观看| 九色亚洲精品在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 日韩电影二区| 久久精品人人爽人人爽视色| 视频在线观看一区二区三区| 日本av免费视频播放| 成人国语在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产精品一区www在线观看| 99久久人妻综合| 久热这里只有精品99| 亚洲精品美女久久av网站| 大香蕉久久网| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美丝袜亚洲另类| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 成年动漫av网址| 蜜桃在线观看..| 女人久久www免费人成看片| 亚洲av电影在线进入| 99re6热这里在线精品视频| 国产熟女欧美一区二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜av观看不卡| 精品久久国产蜜桃| 亚洲综合色惰| 亚洲内射少妇av| 欧美精品av麻豆av| 一区二区三区四区激情视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看人妻少妇| 秋霞在线观看毛片| kizo精华| 香蕉国产在线看| 一边亲一边摸免费视频| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品人妻久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 一边亲一边摸免费视频| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品不卡视频一区二区| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本vs欧美在线观看视频| 青青草视频在线视频观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 乱人伦中国视频| 99国产精品免费福利视频| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品三级大全| 国产在视频线精品| 伊人久久国产一区二区| 熟女av电影| 欧美精品一区二区大全| 97在线视频观看| 国产69精品久久久久777片| 亚洲,欧美,日韩| 日本av免费视频播放| 人人澡人人妻人| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美成人午夜免费资源| 免费看不卡的av| 国产精品无大码| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产成人一精品久久久| 黄色配什么色好看| 国产一区二区三区av在线| 色视频在线一区二区三区| 自线自在国产av| 伦理电影大哥的女人| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品久久午夜乱码| 999精品在线视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲,欧美,日韩| 99香蕉大伊视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲成人av在线免费| 中文欧美无线码| 日日爽夜夜爽网站| 成人二区视频| 国产在线免费精品| 国产黄频视频在线观看| 久久久国产一区二区| 男男h啪啪无遮挡| 秋霞在线观看毛片| 国产色婷婷99| av又黄又爽大尺度在线免费看| 中文字幕最新亚洲高清| 久久午夜福利片| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久久久久久电影| 五月玫瑰六月丁香| 美女内射精品一级片tv| 飞空精品影院首页| 黄色一级大片看看| 国产国语露脸激情在线看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久久久久久久免费av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品一区二区免费观看| 久久韩国三级中文字幕| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲久久久国产精品| 少妇被粗大猛烈的视频| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 在现免费观看毛片| 国产高清三级在线| 国产av码专区亚洲av| 精品一区二区免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 丝袜在线中文字幕| 全区人妻精品视频| 一级片'在线观看视频| av女优亚洲男人天堂| av黄色大香蕉| 永久网站在线| 国产精品三级大全| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 人妻 亚洲 视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美性感艳星| 亚洲av综合色区一区| 熟女av电影| a级毛片在线看网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 婷婷色av中文字幕| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲国产av影院在线观看| 日本av手机在线免费观看| 秋霞在线观看毛片| 精品一品国产午夜福利视频| 免费观看在线日韩| 又大又黄又爽视频免费| 欧美性感艳星| 秋霞在线观看毛片| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲av.av天堂| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 超碰97精品在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 少妇的丰满在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 香蕉精品网在线| 午夜福利,免费看| a级毛片在线看网站| 午夜久久久在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成人手机| 日韩一区二区视频免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 性色avwww在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产极品天堂在线| 91精品国产国语对白视频| h视频一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人a∨麻豆精品| kizo精华| 黑人高潮一二区| 亚洲精品456在线播放app| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费观看a级毛片全部| xxxhd国产人妻xxx| 美女视频免费永久观看网站| 国产毛片在线视频| 免费高清在线观看视频在线观看| √禁漫天堂资源中文www| a级毛片黄视频| 免费人成在线观看视频色| 国产福利在线免费观看视频| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲国产色片| 成年女人在线观看亚洲视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级片'在线观看视频| a 毛片基地| 国产又色又爽无遮挡免| 国产黄频视频在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 美女视频免费永久观看网站| 黄色配什么色好看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲成人手机| 国产色爽女视频免费观看| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲综合色网址| 国产片特级美女逼逼视频| 久久这里有精品视频免费| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 丝袜在线中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 国产国语露脸激情在线看| av国产久精品久网站免费入址| 老女人水多毛片| 亚洲第一区二区三区不卡| 一级片'在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 国产极品天堂在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品色激情综合| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品一二三| 观看av在线不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产69精品久久久久777片| 国产成人一区二区在线| 波多野结衣一区麻豆| 大片免费播放器 马上看| 久久久a久久爽久久v久久| 交换朋友夫妻互换小说| 在线观看国产h片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲av电影在线进入| 久久久国产一区二区| 日韩一区二区三区影片| 少妇高潮的动态图| 十分钟在线观看高清视频www| 在线 av 中文字幕| kizo精华| 免费在线观看黄色视频的| 一本久久精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av国产av综合av卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲美女搞黄在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 夫妻午夜视频| 99热这里只有是精品在线观看| 国产在线免费精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 9热在线视频观看99| 免费在线观看完整版高清| 视频区图区小说| 国内精品宾馆在线| 蜜桃在线观看..| 人人妻人人澡人人看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产不卡av网站在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 99久久精品国产国产毛片| 欧美97在线视频| 少妇的丰满在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品熟女少妇av免费看| 一级毛片电影观看| 伊人久久国产一区二区| 国产一区二区在线观看日韩| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久热这里只有精品99| 母亲3免费完整高清在线观看 | 两个人免费观看高清视频| 精品福利永久在线观看| 一级a做视频免费观看| 曰老女人黄片| 青春草视频在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 高清av免费在线| av在线app专区| 亚洲国产av影院在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| a级毛片在线看网站| 欧美人与性动交α欧美软件 | 久久99热这里只频精品6学生| 婷婷成人精品国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕av电影在线播放| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 看十八女毛片水多多多| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级毛片我不卡| 在线观看一区二区三区激情| 国产成人精品无人区| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲五月色婷婷综合| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲中文av在线| 亚洲内射少妇av| 一级爰片在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久热久热在线精品观看| 国产黄频视频在线观看| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| av在线观看视频网站免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 韩国精品一区二区三区 | 国产视频首页在线观看| 免费看av在线观看网站| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲精品美女久久av网站| 9色porny在线观看| 两个人免费观看高清视频| 少妇的丰满在线观看| 18禁观看日本| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲精品久久久com| 看免费成人av毛片| 男女高潮啪啪啪动态图| 日本91视频免费播放| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产69精品久久久久777片| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产精品999| 一边亲一边摸免费视频| 十八禁高潮呻吟视频| 91国产中文字幕| 熟女人妻精品中文字幕| 满18在线观看网站| 欧美人与性动交α欧美软件 | 国产免费视频播放在线视频| 伦精品一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 精品一品国产午夜福利视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产精品偷伦视频观看了| 一二三四在线观看免费中文在 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 香蕉精品网在线| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品一区www在线观看| 在线天堂最新版资源| 在线观看免费高清a一片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 在线观看人妻少妇| 亚洲伊人久久精品综合| 男人舔女人的私密视频| 午夜av观看不卡| 18+在线观看网站| 777米奇影视久久| 欧美97在线视频| 夫妻午夜视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 久久婷婷青草| 欧美精品av麻豆av| 午夜免费观看性视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久精品国产a三级三级三级| 99香蕉大伊视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品一区二区免费观看| 自线自在国产av| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 飞空精品影院首页| 午夜av观看不卡| 欧美3d第一页| 大香蕉久久成人网| 18禁动态无遮挡网站| 日本wwww免费看| 久久人人97超碰香蕉20202| 99热国产这里只有精品6| 自线自在国产av| 26uuu在线亚洲综合色| 丝瓜视频免费看黄片| 中国三级夫妇交换| 国产在线一区二区三区精| 日韩制服骚丝袜av| 国产日韩欧美亚洲二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人精品一,二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美97在线视频| 一级片'在线观看视频| 精品一区二区三卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久av美女十八| 久久久久视频综合| 免费少妇av软件| 国产精品免费大片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲最大av| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久人妻精品一区果冻| 午夜福利,免费看| 观看美女的网站| 久久久久精品人妻al黑| 久久 成人 亚洲| 国产精品.久久久| 99久久综合免费| 亚洲成人av在线免费| 美国免费a级毛片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 又黄又粗又硬又大视频| 熟女电影av网| 又黄又粗又硬又大视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品熟女久久久久浪| 男女下面插进去视频免费观看 | 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品第一国产精品| 不卡视频在线观看欧美| 国产av国产精品国产| 久久精品人人爽人人爽视色| 9191精品国产免费久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品一区www在线观看| 1024视频免费在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日本色播在线视频| 自线自在国产av| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产高清三级在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产成人av激情在线播放| 免费大片黄手机在线观看| 99久久综合免费|