CD30在淋巴瘤中的表達及檢測：現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

李小秋，CD30陽性淋巴瘤病理專家組

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

CD30是腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）成員之一，即TNFRSF8，又被稱作Ki-1抗原，最早由德國Karl Lennert等人在1982年發(fā)現(xiàn)，他們研制了作用于經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma，CHL）的腫瘤細胞——霍奇金/里-施細胞（Hodgkin/Reed-Sternberg cell，HRS）的單克隆抗體，并命名檢測到的抗原為Ki-1［1］，該蛋白后來被克隆并鑒定為TNFRSF8［2］。

1 CD30蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

CD30是I型跨膜蛋白，相對分子質(zhì)量為120×103；其編碼基因位于染色體1p36，有2種mRNA轉(zhuǎn)錄本，分別為3.4和2.3 kb。人類CD30分子共有595個氨基酸殘基，包括細胞內(nèi)域（188個氨基酸）、跨膜域和富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域（362個氨基酸）三部分。胞外部分由6個半胱氨酸重復(fù)序列組成，與其他腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族具有顯著同源性。在自身免疫性疾病和CD30陽性淋巴瘤中，CD30細胞外部分易被蛋白水解酶切割成相對分子質(zhì)量為88×103的可溶性片段（sCD30），可分泌至血漿中并被CD30抗體檢測到［3-4］。細胞質(zhì)區(qū)C端由100個氨基酸殘基組成了一段高度保守的序列，包含3個具有獨立功能的亞結(jié)構(gòu)域，分別為D1、D2和D3。其中D2和D3結(jié)構(gòu)域含有腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF）蛋白結(jié)合位點，可與TRAF1、2、3、5蛋白結(jié)合，介導(dǎo)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活；而D1則無需結(jié)合即可激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［1］。CD30還參與促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括其亞家族ERK1和ERK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們在腫瘤細胞中具有多種促進細胞存活和抗凋亡的效應(yīng)［2］。

CD30的配體（CD30L或CD153）是腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族的膜結(jié)合蛋白，其編碼基因位于染色體9q33，由234個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為26×103。該配體存在于活化的T細胞、靜息性B細胞、粒細胞、胸腺上皮細胞的髓質(zhì)和哈氏小體以及多種白血病細胞中［3-4］。CD30與配體結(jié)合后形成三聚體，激活細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如募集TNFR相關(guān)因子（TRAF2和TRAF5），并激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 CD30在不同類型淋巴瘤中的表達特征

CD30主要表達于活化的T細胞、B細胞和NK細胞表面，生理狀態(tài)下表達水平較低；而在疾病狀態(tài)下，例如病毒感染、自身免疫性疾病及多種淋巴瘤中，CD30會呈現(xiàn)較高水平表達［5］。

CD30的過表達對于幾種淋巴瘤的確診至關(guān)重要，例如在CHL和間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）中，近乎100%的腫瘤細胞表達CD30，因而CD30也早已被用作這兩類淋巴瘤的診斷性標志物。此外，CD30在其他淋巴瘤亞型中也具有不同程度的表達（表1），包括彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）、原發(fā)性縱隔（胸腺）大B細胞淋巴瘤［primary mediastinal(thymic) large B-cell lymphoma，PMBL］、蕈樣肉芽腫?。╩ycosis fungoides，MF）、淋巴瘤樣丘疹?。╨ymphomatoid papulosis，LyP）以及其他多種類型的外周T細胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）等［5］。

霍奇金淋巴瘤約占所有淋巴瘤的11%，主要類型為CHL，其中近半數(shù)與EB病毒感染相關(guān)。在CHL中，所有腫瘤細胞均表達CD30，免疫組織化學(xué)染色顯示典型的細胞膜和核旁點狀陽性著色。與CHL不同，以結(jié)節(jié)性淋巴細胞為主的霍奇金淋巴瘤腫瘤細胞通常不表達CD30，但高水平表達CD20［14，19］。

ALCL是一組生物學(xué)行為高度異質(zhì)、侵襲性不等的T細胞腫瘤，約占所有非霍奇金淋巴瘤的2%～8%［20］，又分為原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL（并進一步分為ALK+與ALK-兩組亞型）、原發(fā)性皮膚ALCL以及乳房植入物相關(guān)性ALCL等不同亞型。此類腫瘤的瘤細胞通常也高水平表達CD30抗原，其中，ALK+ALCL還特征性地表達ALK融合蛋白。原發(fā)性皮膚ALCL屬于皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生性疾病之一，后者還包括LyP以及交界性病變，診斷此類疾病，常需與其他CD30陽性的皮膚?。ɡ缯婢』蚱渌鸆D30陽性的炎癥或反應(yīng)性病變）作鑒別［21］。

除了ALCL，CD30在其他多種PTCL亞型中也有不同程度的表達。這包括AITL、PTCL，NOS、EATL以及ENKTCL等。約64%的PTCLNOS病例表達CD30［10］。有研究［22］對340例PTCL-NOS樣本作回顧性分析，以20%細胞陽性作為閾值，32%的病例為CD30陽性。

CD30在各型B細胞淋巴瘤中的表達狀態(tài)變異較大，總體而言，15%～20%的B細胞淋巴瘤表達CD30［23-24］；其中，DLBCL表達CD30者相對多見，14%～25%病例CD30陽性，特別是EB病毒陽性的DLBCL，常伴有CD30過表達［14，16］。曾有研究［16］提示，在非EB病毒相關(guān)性腫瘤中，CD30陽性的DLBCL可能具有較好的預(yù)后和獨特的基因表達特征。

3 CD30檢測方法及其優(yōu)缺點

淋巴瘤CD30表達的檢測方法主要包括免疫組織化學(xué)法、流式細胞術(shù)（flow cytemetry，F(xiàn)CM）和酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等，可單獨或聯(lián)合使用。目前，臨床多用免疫組織化學(xué)法，有時結(jié)合FCM判斷。FCM的優(yōu)點是靈敏、快速，且能同時分析CD30陽性細胞的其他表型（如細胞譜系），但需用新鮮樣本檢測限制了其廣泛應(yīng)用。相對于FCM，免疫組織化學(xué)法的優(yōu)點在于可以原位檢測抗原的表達情況，即對感興趣的細胞進行形態(tài)學(xué)鑒定和抗原表達水平評估［25］。免疫組織化學(xué)還可對4%甲醛溶液固定、石蠟包埋樣本進行回顧性分析。免疫組織化學(xué)法的不足之處在于通常一次只能檢測單個標志物，雖然已有一些雙標記技術(shù)，但一時還難以做到更多標志物的同時染色。

4 CD30檢測和結(jié)果判讀所面臨的挑戰(zhàn)

盡管CD30的免疫組織化學(xué)檢測已成為淋巴瘤診斷和預(yù)后評估的重要生物標志物，相應(yīng)檢測及結(jié)果判讀時仍面臨諸多挑戰(zhàn)，主要包括部分技術(shù)性缺陷和判讀標準不統(tǒng)一的問題。

4.1 技術(shù)問題所導(dǎo)致的免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量不理想

影響免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量的最常見技術(shù)問題包括標本固定延遲和固定不充分（導(dǎo)致不同程度的抗原丟失和細胞結(jié)構(gòu)破壞）、過度固定且抗原修復(fù)不足（熱修復(fù)時間太短或溫度較低）、一抗?jié)舛冗^低以及整個免疫組織化學(xué)檢測平臺或方法靈敏度較差。其他因素還包括脫鈣對抗原的影響、內(nèi)源性過氧化物酶的存在、內(nèi)源性生物素和親和素的非特異性結(jié)合等。諸多技術(shù)環(huán)節(jié)都會影響到CD30染色質(zhì)量和結(jié)果判讀的準確性，甚至?xí)绊懙讲±韺W(xué)診斷的準確性。

2017年CD30評估報告顯示［26］，在參與評估的病理實驗室中，有17%的實驗室存在CD30染色不充分的問題。免疫組織化學(xué)染色反應(yīng)“不充分”的常見特征是著色弱、假陽性或定位不清，針對這些問題，該研究機構(gòu)提供了一些改善措施和建議：例如，使用優(yōu)質(zhì)CD30抗體，Ber-H2、CON6D/5和JCM182這3種CD30抗體均可獲得滿意的染色效果，其中Ber-H2抗體更是多數(shù)病理學(xué)檢測CD30最常用的抗體；抗原修復(fù)需在堿性緩沖液或改良的低pH值緩沖液中進行，配合使用靈敏度、特異性較好的免疫組織化學(xué)檢測系統(tǒng)；扁桃體組織被推薦為陽性外對照：必須在濾泡間區(qū)活化的B細胞和T細胞以及生發(fā)中心邊緣的活化B細胞上觀察到中度強度以上的陽性染色，才能判斷染色成功。漿細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞有時也會出現(xiàn)陽性著色，這取決于實驗室使用何種一抗。

4.2 CD30染色結(jié)果的判讀

既往研究顯示，即使面對同一張切片，病理學(xué)家評估CD30陽性腫瘤細胞的百分比和染色強度都很難達成共識。關(guān)于CD30 的染色結(jié)果判讀，目前尚無統(tǒng)一標準，常用方法包括基于腫瘤細胞膜和（或）細胞質(zhì)的染色強度與染色區(qū)域的百分比設(shè)定評分標準、或者按照染色強度分為0～3+共4個等級，即H-score［27］。上述評分方法曾用于一些特定的臨床試驗。當前，更普遍被接受的方法是評估中等強度以上陽性著色的腫瘤細胞所占的百分比，這就要求免疫組織化學(xué)染色具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。染色流程的全程質(zhì)控（包括組織固定、抗原修復(fù)、抗體、染色平臺以及外對照的選擇等）尤為重要。對于腫瘤細胞易于識別（如CHL）或者腫瘤成分相對單一、反應(yīng)性細胞較少的病例（如絕大多數(shù)DLBCL和ALCL），應(yīng)當判讀所有腫瘤細胞中CD30陽性細胞所占的比例，而對于細胞構(gòu)成較為復(fù)雜、難以精確辨識腫瘤細胞和反應(yīng)性淋巴細胞的腫瘤（如相當多的PTCL），CD30陽性的淋巴樣細胞總數(shù)占所有淋巴樣細胞的比例亦可作為判讀CD30表達水平的指標［28］。

此外，對CD30的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀，還取決于組織處理和染色方法的優(yōu)劣，影響因素包括但不局限于：細胞自溶會出現(xiàn)非特異性染色；壞死和凋亡細胞在內(nèi)源性過氧化物酶的作用下，也常會出現(xiàn)假陽性；不同的組織，其免疫組織化學(xué)染色結(jié)果存在差異，即使同一張切片，也會因操作者或染色平臺的不同而出現(xiàn)染色結(jié)果的差異。此外，不同的病理學(xué)家對CD30染色結(jié)果的判讀也有差異，我們的實踐經(jīng)驗表明，可以通過制訂判讀規(guī)范來減少觀察者之間的差異，提高結(jié)果判讀的可重復(fù)性。此外，應(yīng)用計算機圖像分析技術(shù)能兼顧陽性細胞的數(shù)量和染色強度變異，或許有助于更加精確地定量評估CD30的表達水平。

4.3 CD30陽性閾值的設(shè)定

靶向CD30的免疫治療已在CHL和ALCL中取得顯著療效，但其能否為其他類型CD30陽性淋巴瘤患者帶來臨床獲益，也是人們關(guān)注的熱點之一，客觀評估CD30的表達特征有助于臨床醫(yī)師作出治療決策并評判療效。CHL和ALCL幾乎所有腫瘤細胞均高水平表達CD30［5］，因此，對于CHL或ALCL病例，將CD30檢測結(jié)果定性報告為陽性就已足夠。隨后的多項T細胞淋巴瘤臨床研究將腫瘤細胞CD30陽性閾值界定于1%～20%［22］。最近，在聯(lián)合使用靶向CD30的維布妥昔單抗和CHP方案（環(huán)磷酰胺、多柔比星、潑尼松）治療CD 30陽性的PTCL的Ⅲ期大樣本臨床研究中，使用10%細胞陽性作為CD30的陽性閾值［29］（表2）。

表2 淋巴瘤維布妥昔治療臨床研究中設(shè)定的CD30陽性細胞閾值Tab.2 CD30 positive cell thresholds set in the clinical study of lymphoma treated with vibtuxib

在DLBCL的臨床研究中，有研究［15］回顧并分析了167例DLBCL樣本，使用20%細胞CD30陽性作為陽性閾值，則有21%的病例為陽性病例，其中半數(shù)病例陽性細胞比例大于80%，為靶向CD30治療提供了可能。Jacobsen等［36］使用1%細胞作為陽性閾值，發(fā)現(xiàn)DLBCL對維布妥昔單抗反應(yīng)率為44%，其中，完全性緩解率17%，中位緩解時間為16.6個月，且維布妥昔單抗治療反應(yīng)與CD30表達水平之間并無關(guān)聯(lián)。一項評估PBML使用納武利尤單抗聯(lián)合維布妥昔單抗治療的研究［34］也用1%以上的腫瘤細胞或反應(yīng)性淋巴細胞表達CD 30來界定陽性病例。

不難發(fā)現(xiàn)，不同的研究界定CD30陽性閾值具有較大的差異，研究結(jié)果也不盡相同，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是多方面的，但不排除部分是由于CD30檢測方法和判讀標準不一致所導(dǎo)致的差異。有鑒于此，病理實驗室有必要加強CD30染色質(zhì)控并統(tǒng)一陽性結(jié)果判讀標準，提供精確的陽性細胞比例（而非僅僅是“陽性”或“陰性”的定性診斷）供臨床醫(yī)師參考來進行治療決策。

靶向CD30的藥物為CHL和ALCL患者帶來了療效獲益，除了維布妥昔單抗聯(lián)合化療，還有多項臨床研究探索該藥聯(lián)合免疫檢查點抑制劑或其他靶向治療藥物的療效。此外，以CD30為靶點的雙特異性抗體類藥物和嵌合抗原受體T細胞/NK細胞免疫療法（CAR-T/CAR-NK）療法也相繼開展研究，這也使得CD30靶標檢測適應(yīng)證不斷擴大。需要強調(diào)的是，通過免疫組織化學(xué)法對淋巴瘤CD30表達水平進行標準化和可重復(fù)性的評估，是篩選適合靶向治療患者的重要前提條件，我們有必要進一步加強這方面的工作。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。