綿羊肺炎支原體P113蛋白C末端基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其小鼠免疫應(yīng)答

楊 鵬，吳 燕 ，岳 筠，陳 靜，李 梅，王 慧，張雙翔*，文 明,3，程振濤,3*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008;3.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,Mo)是引起綿羊及山羊發(fā)生支原體肺炎(MPSG)的主要病原，患病羊主要表現(xiàn)為消瘦、貧血、漿液性、纖維素性肺炎，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，由于其高度接觸傳染性，給疫病的防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[1-4]。據(jù)資料顯示，我國(guó)多個(gè)省份均有MPSG流行，且致病菌多為Mo，疫病的流行給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失[5-8]。目前，關(guān)于MPSG疫苗研究主要集中在弱毒疫苗和滅活疫苗方向，弱毒疫苗存在著毒力增強(qiáng)和增加機(jī)體感染其他疾病等問(wèn)題，在歐洲國(guó)家已經(jīng)停止使用，在我國(guó)主要使用Mo滅活疫苗進(jìn)行疫病的防控，而由于支原體體外培養(yǎng)困難，導(dǎo)致滅活疫苗成本較高，且存在滅活疫苗刺激機(jī)體免疫效果不佳和免疫保護(hù)時(shí)效短等問(wèn)題[9]，因此，新型疫苗的研發(fā)則顯得十分迫切和必要。

近年來(lái)，由于核酸疫苗刺激免疫應(yīng)答能力強(qiáng)、安全、可靠、生產(chǎn)方便、免疫途徑多樣等優(yōu)點(diǎn)因而受到越來(lái)越多的重視[10]，張友等[11]構(gòu)建的羊口瘡病毒F1L、B2L基因核酸疫苗能夠很好的誘導(dǎo)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，周怡等[12]將Mo TBP30基因和Hsp70基因融合構(gòu)建重組質(zhì)粒后，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒能夠增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫功能；越來(lái)越多的研究資料表明核酸疫苗正處于當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近來(lái)隨著貴州省養(yǎng)羊業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，MPSG不斷發(fā)生，科研小組從我省患病山羊成功分離幾株Mo[13]，且通過(guò)對(duì)Mo貴州分離株P(guān)113基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析[14]，發(fā)現(xiàn)Mo P113蛋白C末端具有較強(qiáng)的免疫原性，本研究用已構(gòu)建的pMD19T-P113質(zhì)粒為模板，構(gòu)建重組pVAX1-P113質(zhì)粒并免疫試驗(yàn)小鼠，分析對(duì)重組質(zhì)粒對(duì)小鼠免疫應(yīng)答影響，以期為Mo基因工程疫苗的研制及疫病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Mo貴州株、pMD19T-P113、真核表達(dá)載體pVAX1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)、Mo和Mmc羊源陽(yáng)性/陰性血清、P113和LppA純化蛋白由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；4～5周齡BALB/c小鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑脂質(zhì)體(Lipofecttamine TM3000)購(gòu)自Invitrogen公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 膠回收試劑盒、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit 質(zhì)粒提取試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；兔抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC購(gòu)自博奧森公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ購(gòu)自TaKaRa公司；小鼠白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海巧伊生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Mo P113基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1目的基因擴(kuò)增及純化 參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Mo GZ-QX1株的P113基因序列(登錄號(hào)：KR270152)，結(jié)合真核表達(dá)載體pVAX1多克隆位點(diǎn)，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物Mo-P113-P1/P2，選用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ作為酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)識(shí))，引物濃度10 μmol/L，預(yù)擴(kuò)增片段696 bp，Mo-P113-P1：5′-AAGCTTATGCTCGAATCCAACGACGGAAGT-3′，Mo-P113-P2：5′-CTCGAGCTAGACAGTCCCTGCTGTTGTGG-3′；根據(jù)常規(guī)PCR方法，建立50 μL反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，Mo-P113-P1/P2各2.0 μL，DNA模板4.0 μL，ddH2O 17.0 μL?；旌暇鶆蚝?，按下列反應(yīng)條件進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增：94℃ 3 min；94℃ 45 s，58℃ 40 s，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取7 μL PCR產(chǎn)物應(yīng)用含Gold View核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察目的基因擴(kuò)增情況；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，參照E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的基因膠回收。

1.3.2重組質(zhì)粒pVAX1-P113構(gòu)建 將純化后的目的基因和載體分別運(yùn)用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將目的基因酶切回收產(chǎn)物與載體酶切回收產(chǎn)物運(yùn)用T4連接酶16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，接種于含Kan+(質(zhì)量濃度為 50～100 mg/L)培養(yǎng)基上16～24 h后挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定。

1.4 Mo P113 C末端蛋白表達(dá)鑒定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDBK細(xì)胞，分別設(shè)置試驗(yàn)組、空白對(duì)照組、空載體對(duì)照組，參照脂質(zhì)體(Lipofecttamine TM3000)使用說(shuō)明將重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染入MDBK細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h后運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄情況，并用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

1.6 小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn)取末次免疫14 d后各試驗(yàn)組小鼠5只進(jìn)行攻毒，每只小鼠經(jīng)氣管途徑感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Mo菌液1 mL(1×108CCU/mL)，7 d 內(nèi)觀察小鼠的精神、食欲等癥狀作為判定發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組小鼠的發(fā)病情況和免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

2.1.1目的基因的擴(kuò)增結(jié)果 以pMD19T-P113克隆質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出P113基因，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后可見(jiàn)約為696 bp的目的條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.Mo P113基因擴(kuò)增產(chǎn)物；3.空白對(duì)照

2.1.2重組質(zhì)粒篩選結(jié)果 以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定及雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增出現(xiàn)696 bp大小目的條帶，而空白對(duì)照在相應(yīng)位置沒(méi)有目的條帶(圖2)；重組質(zhì)粒雙酶切呈現(xiàn)載體條帶(2 999 bp)和目的條帶(696 bp)，而空載體對(duì)照只有1條載體條帶2 999 bp(圖3)。并將PCR和雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，所獲序列經(jīng)過(guò)比對(duì)與預(yù)期相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.空白對(duì)照；2.重組質(zhì)粒

M.DL5000 DNA Marker；1.PCR對(duì)照；2.空載體對(duì)照；3.重組質(zhì)粒

2.2 重組質(zhì)粒在MDBK細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果

2.2.1目的基因在MDBK細(xì)胞轉(zhuǎn)錄檢測(cè)結(jié)果 取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞提取基因組RNA，并將提取的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)錄情況檢測(cè)，結(jié)果顯示目的基因在細(xì)胞中RT-PCR擴(kuò)增出現(xiàn)696 bp的目的條帶，而空白對(duì)照和空載體對(duì)照在相應(yīng)位置沒(méi)有目的條帶，說(shuō)明目的基因能在MDBK細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.pVAX1-P113轉(zhuǎn)染；3.pVAX1轉(zhuǎn)染；4.空白對(duì)照

2.2.2P113 C末端蛋白表達(dá)結(jié)果 將重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，48 h后取細(xì)胞飛片，應(yīng)用Mo陽(yáng)性血清作為一抗采用IFA方法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖5。重組質(zhì)粒pVAX1-P113轉(zhuǎn)染后的MDBK細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，而在pVAX1對(duì)照組和空白對(duì)照組中未觀察到特異性熒光，說(shuō)明重組質(zhì)?？稍诓溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。

A..空白組；B.pVAX1轉(zhuǎn)染；C.pVAX1-P113轉(zhuǎn)染

2.3 重組質(zhì)粒pVAX1-P113刺激免疫動(dòng)物應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果

2.3.1試驗(yàn)小鼠體液免疫應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果 試驗(yàn)小鼠在免疫重組質(zhì)粒后14 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何臨床異?，F(xiàn)象。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)定時(shí)采集試驗(yàn)組小鼠血清，運(yùn)用ELISA法通過(guò)1.5 μg/孔P113蛋白常溫包被過(guò)夜、1%明膠封閉1 h、加入1∶100稀釋的待檢血清、二抗標(biāo)記1 h、顯色后用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣本D630 nm值。結(jié)果顯示，免疫重組質(zhì)粒后試驗(yàn)組小鼠血清中特異性抗體分泌量明顯增多；自第1 周首免至第7 周時(shí)，重組質(zhì)粒試驗(yàn)組小鼠血清特異性抗體D630 nm值均極顯著高于Elution Buffer對(duì)照組和空載體對(duì)照組(P<0.01)，且第7 周時(shí)重組質(zhì)粒試驗(yàn)組小鼠血清特異性抗體均為陽(yáng)性，而重組質(zhì)粒試驗(yàn)組中以重組質(zhì)粒免疫劑量為100 μg時(shí)免疫效果最佳，提示重組質(zhì)粒能夠刺激機(jī)體體液免疫應(yīng)答，且以劑量為100 μg 時(shí)免疫效果最好(圖6)。

字母相同或ns表示差異不顯著(P>0.05)，字母不相同表示差異極顯著(P<0.01)；樣本D630 nm值≥2.325時(shí)為陽(yáng)性；樣本D630 nm值<2.325時(shí)為陰性

字母相同或ns表示差異不顯著(P>0.05)；小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)；大寫字母不相同表示差異極顯著(P<0.01)

2.3.2試驗(yàn)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果 按試驗(yàn)設(shè)計(jì)定時(shí)采集試驗(yàn)組小鼠血清，應(yīng)用細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。結(jié)果顯示，試驗(yàn)小鼠免疫重組質(zhì)粒pVAX1-P113后，血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平顯著上升，整體水平呈先升高，于第4 周到達(dá)頂峰后緩慢下降，且重組質(zhì)粒pVAX1-P113試驗(yàn)組血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌量均高于Elution Buffer對(duì)照組和空載體對(duì)照組，同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒免疫劑量不同引起機(jī)體細(xì)胞因子分泌量也不同，重組質(zhì)粒免疫劑量為100 μg時(shí)刺激細(xì)胞因子分泌量顯著高于其他組；提示重組質(zhì)粒pVAX1-P113能增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，且以劑量為100 μg時(shí)免疫效果最好(圖7)。

2.4 小鼠攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各免疫組小鼠在人工感染Mo后，Elution Buffer對(duì)照組、空載體pVAX1對(duì)照組(100 μg)試驗(yàn)小鼠均出現(xiàn)發(fā)病癥狀；而重組質(zhì)粒試驗(yàn)組小鼠發(fā)病數(shù)較Elution Buffer對(duì)照組和空載體pVAX1對(duì)照組少，且重組質(zhì)粒pVAX1-P113(100 μg)組小鼠發(fā)病數(shù)最少，提示重組質(zhì)粒對(duì)Mo感染具有一定的免疫保護(hù)作用，且以重組質(zhì)粒pVAX1-P113(100 μg)組的保護(hù)效果為最佳，免疫保護(hù)率為4/5(表1)。

表1 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

黏附素(adhesin)作為支原體的重要組成部分，通常為蛋白質(zhì)或糖蛋白，與病原致病力具有相關(guān)性，對(duì)支原體在宿主細(xì)胞上定殖起著重要的作用[15-16]，廣泛應(yīng)用于致病機(jī)理、診斷防控研究和作為亞單位疫苗的候選蛋白。林裕勝等[17]基于Mo P80基因建立了PCR診斷方法；還有研究發(fā)現(xiàn)在豬肺炎支原體中為黏附蛋白的P97蛋白能夠有效引起機(jī)體免疫應(yīng)答，揭露了黏附蛋白作為疫苗蛋白的可能性[18]。P113蛋白是一種重要的黏附分子和膜表面免疫原，本研究小組通過(guò)分析Mo貴州株P(guān)113蛋白，發(fā)現(xiàn)其C末端具有極強(qiáng)的免疫原性，結(jié)果與國(guó)內(nèi)報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)黏附蛋白具有抗原性的結(jié)果相似[20-23]；因此本研究以pMD19T-P113質(zhì)粒為模板，pVAX1為真核表達(dá)載體，構(gòu)建了pVAX1-P113重組質(zhì)粒。

IL-2、IL-4和IFN-γ是機(jī)體內(nèi)主要的細(xì)胞因子，其分泌水平可作為檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的指標(biāo)[24]，IL-2和IFN-γ屬于典型的Th1型細(xì)胞因子，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗病毒感染有著重要作用；IL-4屬于典型的Th2型細(xì)胞因子，主要作用為增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的體液免疫反應(yīng)[25-26]，本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠通過(guò)初免+加強(qiáng)免疫的方式后，血清中特異性抗體、IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平相較于空載體對(duì)照組和Elution Buffer對(duì)照組顯著上升，TL-4分泌水平升高可提高機(jī)體免疫水平，IL-4增多可促進(jìn)機(jī)體Th2向Th1分化，以保證Th1的持續(xù)分泌狀態(tài)，從而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫的功能；IL-2和IFN-γ的分泌會(huì)使巨噬細(xì)胞活化及Th1的大量增殖，進(jìn)而影響T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分泌，以達(dá)到提高機(jī)體免疫能力[27]。分析發(fā)現(xiàn)特異性抗體和細(xì)胞因子整體水平呈先升高后降低，這與林伯全等[28]研究發(fā)現(xiàn)SPF雞在感染雞毒支原體F弱毒株后在28 d內(nèi)其血清中IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌量先升高后降低的結(jié)果相似，提示重組質(zhì)?？纱碳C(jī)體體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在重組質(zhì)粒不同劑量對(duì)比中發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒劑量為100 μg時(shí)，刺激機(jī)體應(yīng)答效果高于50，150 μg；對(duì)免疫組小鼠進(jìn)行攻毒后發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒不同滾劑量組均對(duì)小鼠存在免疫保護(hù)力，以重組質(zhì)粒劑量100 μg時(shí)保護(hù)效果最好；提示P113 C末端蛋白可作為新型疫苗研發(fā)的候選蛋白，為Mo基因工程疫苗的研制提供參考依據(jù)。