雪白睡蓮花總黃酮提取工藝優(yōu)化及其對金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的治療效果

劉丹丹，羅 潔，朱怡萱，陳伊靜，尼加提·麥力克，李 昊，況 玲，賽福丁·阿不拉，張 偉

(新疆農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)是引起奶牛乳腺炎最主要、最常見的病原菌，其發(fā)病率占病原微生物感染總發(fā)病率的10% ～ 40%[1-2]。金黃色葡萄球菌所致的奶牛乳腺炎不僅會導致奶牛的淘汰和死亡率增加，還會造成奶牛的產奶量下降、影響乳制品質量，引發(fā)一系列食品衛(wèi)生安全問題，危害消費者的身體健康，同時制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展[3]。目前，治療金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎首選的藥物仍然是抗生素，但伴隨抗生素的大量、不規(guī)范使用，細菌出現(xiàn)抗藥性、畜產品中藥物殘留等問題日益顯現(xiàn)[4]。因此，探索低毒、環(huán)保、高效的抗菌藥物具有非常重要的意義。

雪白睡蓮花(Nymphaeacandida，N.candida)是睡蓮科睡蓮屬多年生水生植物，主要分布在我國新疆南部。ANTONISAMY等[5]報道睡蓮屬植物具有抗氧化、保肝、抗菌、降血糖和神經保護等作用。PARIMALA等[6]研究發(fā)現(xiàn)延藥睡蓮種子醇提物對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性。MAJI等[7]研究發(fā)現(xiàn)紅睡蓮葉水提物對大腸桿菌有一定的抑菌效果，具有抑制體內細菌感染的潛力。黃酮是其重要活性成分之一，其結構復雜、藥用價值豐富，具有抗菌、消炎、抑制血小板聚集、抗凝及抗血栓形成等作用[8]。本試驗采用響應面法超聲波輔助提取雪白睡蓮花，通過體外抑菌試驗和構建金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型，研究雪白睡蓮花對金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎抑菌抗炎效果，以期為奶牛乳腺炎新藥開發(fā)和臨床治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與實驗動物金黃色葡萄球菌9-14，由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所提供。昆明小鼠(雌性，懷孕2～2.5 周，55～65 g)，60只，SPF級，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(新)2018-0003。

1.2 藥品與試劑雪白睡蓮花購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院。蘆丁(HPLC98%)購自上海源葉生物有限公司。BHI培養(yǎng)基、高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司。小鼠TNF-α、IL-6細胞因子ELISA檢測試劑盒均購自北京誠林有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 雪白睡蓮花總黃酮提取將雪白睡蓮花烘干、粉碎，過40目篩，準確稱取5 g樣品，在預設條件下(乙醇濃度、超聲功率、提取時間、料液比、提取溫度)萃取。萃取液經4 000 r/min低速離心5 min后抽濾，減壓濃縮烘干得雪白睡蓮花總黃酮。

1.4 雪白睡蓮花總黃酮得率的測定

1.4.1雪白睡蓮花總黃酮標準曲線制作 首先精密稱取10 mg蘆丁標準品置于25 mL容量瓶中，用體積分數80%乙醇溶解，定容至刻度線，即得蘆丁標準品儲備液，備用。NaNO2- Al(NO3)3顯色法：分別吸取出0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蘆丁標準品儲備液至試管中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，混勻靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，再次混勻靜置6 min，最后加入質量分數4%氫氧化鈉溶液4 mL，加水定容至10 mL搖勻，靜置15 min，于510 nm 波長下測定不同濃度標準品儲備液的D值，繪制標準曲線。

1.4.2雪白睡蓮花總黃酮得率的測定 精密稱取雪白睡蓮花總黃酮10 mg(按照1.3方法制備)，置于25 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，作為雪白睡蓮花總黃酮待測液。精密量取雪白睡蓮花總黃酮待測液1 mL，按照1.4.1方法測定其D值，重復3次，將測得的D值代入標準曲線方程計算雪白睡蓮花總黃酮的得率。計算公式：雪白睡蓮花總黃酮得率(%)=C×D÷W×100%。其中C，D，W分別代表待測樣品總黃酮的溶液濃度，稀釋因素及樣品量。

1.5 單因素試驗

1.5.1乙醇濃度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 稱取5 g雪白睡蓮花粉末，將料液比、超聲功率、提取時間和提取溫度分別固定為1∶30 kg/L、60%、20 min、60℃，考察乙醇濃度梯度分別為60%，70%，80%，90%，100%時對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響，每個梯度設置3個平行試驗。

1.5.2超聲功率對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 稱取5 g雪白睡蓮花粉末，將料液比、提取時間、乙醇濃度和提取溫度分別固定為1∶30 kg/L、20 min、70%、60℃，考察超聲功率梯度分別為50%，60%，70%，80%，90%時對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響，每個梯度設置3個平行試驗。

1.5.3提取時間對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 稱取5 g雪白睡蓮花粉末，將料液比、超聲功率、乙醇濃度和提取溫度分別固定為1∶30 kg/L、60%、70%、60℃，考察提取時間梯度分別為10，15，20，25，30 min時對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響，每個梯度設置3個平行試驗。

1.5.4料液比對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 稱取5 g雪白睡蓮花粉末，將超聲功率、提取時間、乙醇濃度和提取溫度分別固定為60%、20 min、70%、60℃，考察料液比梯度分別為1∶10 kg/L，1∶20 kg/L，1∶30 kg/L，1∶40 kg/L和1∶50 kg/L時對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響，每個梯度設置3個平行試驗。

1.5.5提取溫度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 稱取5 g雪白睡蓮花粉末，將料液比、超聲功率、提取時間和乙醇濃度分別固定為1∶30 kg/L、60%、20 min、70%，考察提取溫度梯度分別為40，50，60，70，80℃時對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響，每個梯度設置3個平行試驗。

1.6 響應曲面法優(yōu)化試驗將單因素試驗結果使用SPSS軟件分析，得到對雪白睡蓮花總黃酮的得率影響最顯著的3個因素，并設定其為自變量，響應值作為因變量，進行3因素3水平試驗設計，得到雪白睡蓮花總黃酮的最優(yōu)提取工藝。設計因素水平見表 1。

表1 響應曲面分析因素水平表

1.7 雪白睡蓮花總黃酮體外抑菌活性研究

1.7.1菌液的制備 將純化保存的金黃色葡萄球菌接種于BHI培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18 ～ 24 h至對數期。采用平板計數法將細菌懸液調至1×104CFU/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2抑菌圈的測定 按照牛津杯法[9]，取4℃保存菌液0.1 mL，均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，將3個牛津杯等距放置于鋪滿菌液的培養(yǎng)基中，杯中加入雪白睡蓮花總黃酮、生理鹽水、慶大霉素各100 μL，每種藥物和菌株做3次重復，以生理鹽水作為空白對照組，以慶大霉素作為陽性對照組。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌效果判定標準：抑菌效果判定標準：R≥15 mm為高敏，10 mm≤R<15 mm為中敏，8 mm≤R<10 mm為低敏，R<8 mm為不敏感，-表示無抑菌圈。

1.7.3最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用倍比稀釋法進行MIC的測定[10]。在無菌96孔板中每孔加入滅菌肉湯100 μL，第1孔中加入滅菌受試藥液100 μL(藥液質量濃度0.1 kg/L)，混勻并取出100 μL 加入第2孔，依次到第9孔后棄去100 μL。第10孔不加藥，第11孔中加受試藥不加細菌，第12孔為空白對照。前10孔中分別加入10 μL菌液混勻，于37℃恒溫培養(yǎng)，觀察結果。

1.7.4最低殺菌濃度(MBC)的測定 選用已經測得MIC的各組，將組內所有未見渾濁的各孔中各取出50 μL，加入瓊脂培養(yǎng)基，用滅菌玻璃涂布棒均勻涂布于培養(yǎng)基中，做3個平行重復，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。以平板上生長的菌落數小于5個菌落的最低藥物濃度作為MBC[11]。

1.8 雪白睡蓮花總黃酮體內抑菌抗炎活性研究

1.8.1金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎建立 將分娩3～10 d的小鼠腹腔注射麻藥舒泰0.05 mL/只，麻醉后將小鼠四肢伸展仰臥保定，用75%的酒精對第4對乳腺周圍進行消毒，左手持小鑷子將乳頭固定，右手持微量注射器，從小鼠第4對乳腺基部進針注射細菌懸液(按照1.7.1方法制備)，50 μL/乳腺[12]。小鼠乳腺炎成模的判斷標準：注射細菌24 h后，觀察各試驗組小鼠飲食量變化、乳腺是否腫脹變硬、對外界刺激的反應、被毛顏色及光澤度變化等，如果小鼠出現(xiàn)飲水和進食量減少、乳腺開始腫脹甚至潰爛、被毛泛黃粗糙雜亂、對外界的刺激反應遲鈍，則判為模型構建成功，上述癥狀不明顯則判為未成模[13]。

1.8.2試驗分組和給藥方案 將60只分娩3～10 d小鼠隨機分為4組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組、雪白睡蓮花總黃酮組，每組15只。除空白對照組不做處理外，其余各組進行金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型的構建(具體方法參照1.8.1)。模型組、陽性對照組、雪白睡蓮花總黃酮組分別灌胃生理鹽水、環(huán)丙沙星、雪白睡蓮花總黃酮，每天 2次，0.3 mL/次，連續(xù)給藥7 d，空白對照組不做處理。

1.8.3臨床癥狀觀察 在給藥3，5，7 d，觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、飲食和飲水情況。

1.8.4取樣與樣品處理 在給藥3，5，7 d，分別從每個組中隨機抓取5只小鼠進行脫頸處死，消毒后將小鼠腹部的皮膚剖開，對第4對乳腺組織的病理變化進行觀察。然后迅速摘出其中的一側乳腺組織，于福爾馬林液中固定，時間需超過24 h，之后進行切片染色，觀察病理組織學變化。另一側稱質量后，將其放入提前預冷好的研磨器中，加入10倍PBS緩沖液研磨，取研磨好的勻漿液進行倍比稀釋，從中取50 μL涂布于甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，測定乳腺組織中的細菌數量。將剩余的勻漿液4℃離心10 min，移取上清液進行TNF-α、IL-6的含量檢測，檢測的步驟見說明書。

2 結果

2.1 單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 由圖1可知，雪白睡蓮花總黃酮得率在乙醇濃度為80%時達到頂峰，之后出現(xiàn)明顯的下降趨勢。根據相溶原理，乙醇濃度升高的同時，極性升高，雪白睡蓮花中的總黃酮隨之逐漸溶解出來；乙醇濃度的升高，沸點反而會不斷的降低，同樣的溫度下乙醇濃度越高揮發(fā)的越快，可能會出現(xiàn)樣品與乙醇無法充分接觸，從而使得率呈下降趨勢。經分析后得出該因素對雪白睡蓮花總黃酮得率影響差異顯著，且乙醇濃度為80%時雪白睡蓮花總黃酮得率最高，因此，選擇乙醇濃度為后續(xù)響應面試驗的變量之一，同時設置乙醇濃度梯度為70%，80%，90%。

圖1 不同乙醇濃度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.1.2超聲功率對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 由圖2可知，雪白睡蓮花總黃酮得率在超聲功率為60%時達到頂峰，隨后出現(xiàn)明顯的下降趨勢?？赡苁浅暡C械振動能對植物細胞壁造成破壞，使雪白睡蓮花總黃酮不斷的溶解出來，而機械振動過強時又會使其結構遭到破壞，從而使雪白睡蓮花中總黃酮得率下降。經分析后得出該因素對雪白睡蓮花總黃酮得率影響差異顯著，且超聲功率為60%時雪白睡蓮花總黃酮得率最高，因此，選擇超聲功率為后續(xù)響應面試驗的變量之一，同時設置超聲功率梯度為50%，60%，70%。

圖2 不同超聲功率對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.1.3提取時間對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 由圖3可知，雪白睡蓮花總黃酮得率在提取時間為20 min時達到頂峰，之后出現(xiàn)明顯的下降趨勢?？赡苁请S著提取時間的延長，使部分總黃酮發(fā)生水解而降低了其提取質量，同時隨時間的延長其他雜質也不斷的溶解出來，從而使雪白睡蓮花總黃酮的得率下降。經分析后得出該因素對雪白睡蓮花總黃酮得率影響差異顯著，且時間為20 min時雪白睡蓮花總黃酮得率最高，因此，選擇提取時間為后續(xù)響應面試驗的變量之一，同時設置提取時間梯度為15，20，25 min。

圖3 不同提取時間對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.1.4料液比對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 由圖4可知，雪白睡蓮花總黃酮得率在料液比為1∶30 kg/L 時達到頂峰，之后出現(xiàn)緩慢下降趨勢，但總體上沒有明顯的變化?？赡苁橇弦罕容^小時，由于溶劑與樣品接觸不充分所致，而料液比較大時，其他非黃酮類化合物雜質逐漸溶解出來，從而使得率呈下降趨勢，并且提取時溶劑過多會造成后續(xù)過濾和濃縮等步驟難度。經分析后得出該因素對雪白睡蓮花總黃酮得率影響差異不顯著，因此，雪白睡蓮花總黃酮的最佳料液比為1∶30 kg/L，并且固定為后續(xù)響應面試驗中使用。

圖4 不同料液比對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.1.5提取溫度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響 由圖5可知，雪白睡蓮花總黃酮得率隨著提取溫度增加而增加，在提取溫度為60℃時得率達到頂峰，提取溫度超過60℃后，雪白睡蓮花總黃酮得率出現(xiàn)下降趨勢?？赡苁菧囟冗^高破壞有效成分，從而得率下降。經分析得出該因素對雪白睡蓮花總黃酮得率影響不顯著，因此，雪白睡蓮花總黃酮的最佳提取溫度為60℃，并且固定為后續(xù)響應面試驗中使用。

圖5 不同提取溫度對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.2 雪白睡蓮花總黃酮響應面優(yōu)化分析

2.2.1數據處理及模型擬合 由表2可知，以乙醇濃度(A)、超聲功率(B)和提取時間(C)為自變量，以雪白睡蓮花總黃酮得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平試驗，得到擬合回歸方程為：雪白睡蓮花總黃酮得率(Y)=11.95+0.18A+0.23B-0.25C+0.14AB+0.37AC+0.61BC-0.75A2-0.63B2-0.96C2。

表2 響應面法設計與試驗結果

表3 響應面二次模型的方差分析

2.2.2響應曲面分析 利用Design-Expert 8.0.6進行3D圖形繪制，做出乙醇濃度(A)、超聲功率(B)、提取時間(C)對雪白睡蓮花總黃酮得率影響的響應面分析圖及等高線圖。由圖6可知，隨著超聲功率和乙醇濃度的增大，雪白睡蓮花總黃酮的得率先表現(xiàn)為升高，達到頂峰后又開始慢慢下降，在超聲

圖6 超聲功率與乙醇濃度交互作用對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

功率為60%、乙醇濃度為80%時，雪白睡蓮花總黃酮的得率最高；從等高線圖得出，超聲功率和乙醇濃度等高線圖是一個近圓形，代表這兩個自變量間的交互作用對雪白睡蓮花總黃酮的得率的影響較弱。由圖7可知，隨著提取時間和乙醇濃度的增大，雪白睡蓮花總黃酮的得率先表現(xiàn)為升高，達到頂峰后又開始慢慢下降，在乙醇濃度為80%、提取時間為21 min 時，雪白睡蓮花總黃酮的得率最高；從等高線圖得出，提取時間和乙醇濃度的等高線圖是一個較明顯的橢圓形，代表這兩個自變量間的交互作用對雪白睡蓮花總黃酮的得率的影響較大。由圖8可知，隨著提取時間和乙醇濃度的增大，雪白睡蓮花總黃酮的得率先表現(xiàn)為升高，達到頂峰后又開始慢慢下降，在乙醇濃度為80%、提取時間為21 min時，雪白睡蓮花總黃酮的得率最高；從等高線圖得出，提取時間和乙醇濃度的等高線圖是一個較明顯的橢圓形，代表這兩個自變量間的交互作用對雪白睡蓮花總黃酮的得率的影響較大。

圖7 提取時間與乙醇濃度交互作用對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

圖8 提取時間與超聲功率交互作用對雪白睡蓮花總黃酮得率的影響

2.2.3雪白睡蓮花總黃酮最佳提取工藝條件的驗證 根據二項回歸模型可知，雪白睡蓮花總黃酮的最佳乙醇濃度、提取時間和超聲功率分別為81.25%、19.74 min、61.7%，預測雪白睡蓮花總黃酮得率為11.99%?；谝陨蟽?yōu)化條件，同時綜合實際操作情況，將該工藝做了調整：乙醇濃度、提取時間、超聲功率分別為81%、20 min、60%。按照該工藝進行驗證試驗并重復3次，結果發(fā)現(xiàn)雪白睡蓮花總黃酮實際得率與預測值接近，平均值為12.00%，重復率好且偏差小。

2.3 雪白睡蓮花總黃酮體外抑菌活性研究由表4，5可知，雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌為高敏，抑菌圈直徑為(24.07±0.72) mm；雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為3.125，6.250 g/L，表明雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球在體外有明顯的抑制作用。

表4 雪白睡蓮花總黃酮抑菌圈結果

表5 雪白睡蓮花總黃酮的MIC和MBC結果 g/L

2.4 雪白睡蓮花總黃酮體內抑菌抗炎活性研究

2.4.1小鼠臨床癥狀觀察 在給藥過程中，空白對照組小鼠采食、飲水正常，精神良好；模型組小鼠精神萎靡不振，運動、采食和飲水減少，乳腺腫脹潰爛；雪白睡蓮花總黃酮組和陽性對照組小鼠精神狀態(tài)、飲水和采食逐漸恢復，乳腺腫脹程度較模型組變化較小，潰爛程度較輕。

2.4.2乳腺組織內金黃色葡萄球菌數量變化 如表6可見，分別在給藥3，5，7 d，與空白對照組對比，模型組小鼠乳腺組織中金黃色葡萄球菌數量呈現(xiàn)出極顯著升高(P<0.01)；與模型組對比，陽性對照組、雪白睡蓮花總黃酮組小鼠的乳腺組織中金黃色葡萄球菌數量呈現(xiàn)出顯著下降趨勢(P<0.05)；在3，5 d，與陽性對照組對比，雪白睡蓮花總黃酮組小鼠的乳腺組織中金黃色葡萄球菌數量差異不顯著(P>0.05)。

表6 乳腺組織中細菌計數結果

2.4.3乳腺組織病理組織學變化 空白對照組：在給藥3，5，7 d，乳腺腺泡結構完整，乳腺組織中無紅細胞和炎癥細胞(圖9A、B、C)；模型組：在給藥3，5，7 d，乳腺腺泡結構不完整，崩解壞死，乳腺組織中出現(xiàn)大量紅細胞和炎癥細胞，乳腺結構坍塌(圖9D、E、F)；陽性對照組：在給藥3 d，乳腺組織結構相對完整，乳腺組織出現(xiàn)大量紅細胞和炎癥細胞(圖9G)，在給藥5，7 d，乳腺組織結構相對完整接近空白對照組，乳腺組織中紅細胞和炎癥細胞明顯減少(圖9H、I)；雪白睡蓮花總黃酮組：在給藥3 d，乳腺組織結構不完整，乳腺組織中有大量的炎癥細胞，乳腺結構坍塌，腺泡崩解(圖9J)；在給藥5 d，乳腺組織結構破損不完整，組織中有紅細胞和炎癥細胞仍較多(圖9K)；在給藥7 d，乳腺組織結構比較完整，乳腺組織中紅細胞和炎癥細胞較少(圖9L)。

2.4.4乳腺組織TNF-α、IL-6含量的測定 如表7，在治療過程中，雪白睡蓮花總黃酮組和陽性對照組小鼠的乳腺組織中TNF-α、IL-6含量均呈現(xiàn)出下降趨勢。與空白對照組對比，模型組小鼠的乳腺組織中TNF-α、IL-6的含量表現(xiàn)出極顯著的升高(P<0.01)；與模型組對比，陽性對照組、雪白睡蓮花總黃酮組小鼠的乳腺組織中TNF-α、IL-6含量呈現(xiàn)出顯著下降趨勢(P<0.05)；與陽性對照組對比，雪白睡蓮花總黃酮組小鼠的乳腺組織中TNF-α含量差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

響應面法是在一系列已有數據結果基礎上綜合試驗設計、構建生物變量曲面模型的方法，具有穩(wěn)定、有效、操作簡便及預測準確等優(yōu)點[14]。本試驗用單因素試驗分析了乙醇濃度、超聲功率、提取時間、料液比、提取溫度5個單因素，確定出乙醇濃度、超聲功率、提取時間是對雪白睡蓮花總黃酮得率影響最顯著的3個因素。在此基礎上，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行3因素3水平的BBD試驗設計，優(yōu)化雪白睡蓮花總黃酮提取工藝，經優(yōu)化后得出雪白睡蓮花總黃酮最佳提取條件為：乙醇濃度81%，提取時間20 min，超聲功率60%，料液比1∶30 kg/L，提取溫度60℃。在此條件下，雪白睡蓮花總黃酮實際得率達到12.00%，與模型預測值接近。表明該模型預測性能較好，可以為工業(yè)提取提供參考。

奶牛乳腺炎是一種發(fā)病原因比較復雜的乳腺疾病，主要由細菌、真菌、病毒、支原體等病原體感染導致，金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌[15-16]。據報道，金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎不僅會導致奶牛淘汰和死亡的幾率增加，還會導致患病奶牛的產奶量及其所產奶汁中的營養(yǎng)物質含量降低，有害物質含量增加，對食品安全造成危害，損害食用者的身體健康，同時制約著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的綠色發(fā)展[17-18]，為此尋找有效防治金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎及其致病機制的藥物或方法，相關動物模型是其開展研究必不可少的重要工具。然而使用奶牛、奶山羊作為動物病理模型進行研究，存在成本過高、實驗操作困難等弊端，而小鼠以其成本低、操作簡單、個體差異小、方便標準化管理等優(yōu)勢，使用小鼠來構建動物的病理模型已被國內外學者廣泛認可[19]。因此本試驗選用小鼠為試驗動物，建立金黃色葡萄球菌性乳腺炎動物模型，開展雪白睡蓮花總黃酮體內抑菌抗炎研究。

在乳腺炎發(fā)生過程中，機體的免疫應答中重要的環(huán)節(jié)是調高機體中的炎癥細胞因子[20]。其中，TNF-α和IL-6均是此過程中主要的炎癥細胞因子。TNF-α是發(fā)生炎癥時最早出現(xiàn)的細胞因子，其不僅可以增強巨噬細胞的敏感性，還能加劇炎癥介質癥狀，使炎癥細胞快速的向炎癥發(fā)生部位移動，導致炎癥反應更加嚴重；IL-6不僅可以增強殺傷細胞的活力，還可以促進免疫細胞T細胞和B細胞的產生，能加快炎癥細胞進入感染部位的速度[3,21-22]。徐進等[23]研究姜黃素對金黃色葡萄球菌性乳腺炎小鼠血清中的細胞因子含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著抑制小鼠血清中TNF-α、IL-8和IL-6的含量，并可改善模型小鼠的炎癥情況。王瑩[24]構建金黃色葡萄球菌性乳腺炎小鼠乳腺炎模型，研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物可顯著降低模型小鼠血清和組織中的細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β含量，明顯抑制炎癥細胞向乳腺組織中移動，且可改善乳腺細胞變性壞死的程度。因此，選取乳腺組織炎癥因子TNF-α、IL-6，并結合乳腺病理變化，綜合驗證雪白睡蓮花總黃酮的抗炎能力。

本試驗在最佳提取工藝條件下提取雪白睡蓮花總黃酮，采用體外抑菌試驗和構建金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎模型，分析雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌與抗炎雙重作用。雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(24.07±0.72) mm；雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為3.125，6.250 g/L，表明雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球在體外有明顯的抑制作用；在給藥周期內(7 d)，與模型組比較，雪白睡蓮花總黃酮組小鼠精神狀態(tài)、飲食和飲水逐漸恢復；同時觀察乳腺組織病理變化，可見明顯的炎癥細胞和紅細胞減少；乳腺組織中金黃色葡萄球菌的數量、TNF-α及IL-6的含量極顯著下降(P<0.01)。結果表明，雪白睡蓮花總黃酮在治療金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎時，能夠降低炎癥因子TNF-α、IL-6的含量，減輕其對乳腺組織的損傷，具有顯著的抑菌抗炎作用。

綜上，雪白睡蓮花總黃酮對金黃色葡萄球菌性小鼠乳腺炎具有較好的抑菌抗炎效果，本試驗為新疆地方藥材雪白睡蓮花總黃酮的進一步研究以及臨床治療奶牛乳腺炎疾病新天然藥物的開發(fā)提供了依據。