兔源F型多殺性巴氏桿菌環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立

王錦祥，孫世坤，陳巖峰，陳冬金，桑 雷，謝喜平

(福建省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染兔引起的一種傳染性疾病，該病是兔的常發(fā)病和多發(fā)病。臨床上，患兔主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如咳嗽、流漿液性或膿性鼻涕，也可表現(xiàn)為中耳炎和結膜炎等病癥[1-2]。該病常年發(fā)生，所有品種和日齡的兔均易感，是危害兔產業(yè)發(fā)展的重要疾病[1-2]。F型多殺性巴氏桿菌首次分離自火雞[3]，前期研究表明該菌主要感染禽類，且對禽具有強致病性，能引起禽霍亂[4-5]。2004年，JAGLIC等[6]首次證實F型多殺性巴氏桿菌也存在于兔群中，且該菌通過皮下和滴鼻2種途徑攻毒均能引起試驗兔的死亡[7]。2012年，張娜等[8]首次報道在我國山東的兔群中分離到F型多殺性巴氏桿菌，該分離菌對兔的致病性也很強，攻毒后對仔兔的呼吸道能造成嚴重的病理損害，并導致仔兔死亡。此后的研究表明，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌在我國不同地區(qū)的兔群中均有流行，且該菌的感染與兔的呼吸道疾病直接相關[9]。由此可見，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌對兔具有很強的致病性，如果其在兔群中廣泛流行必將阻礙兔產業(yè)的發(fā)展。因此，建立F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測方法，掌握該菌在兔群中的流行情況，有助于實現(xiàn)對該菌的有效防控，對保障兔產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前，用于F型多殺性巴氏桿菌的實驗室檢測方法有細菌分離鑒定[8]、雙重PCR方法[10]和多重PCR方法[11]，還未見LAMP方法的報道。本試驗針對編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因的保守序列設計了外引物和內引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP快速檢測方法，為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)等臨床分離株由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑Brain Heart Infusion購自Oxoid公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(EE161-01)購自北京全式金生物技術有限公司；熒光及可視化LAMP試劑盒(200921W)購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 引物設計與合成根據(jù)GenBank登錄的編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因(AF302467)，利用在線軟件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)設計了2對特異性引物。外引物序列為fcbD-F3：5′-GCCTGTTTGGTCAATCAGAA-35′/fcbD-B3：5′-GTTGTGGTGCCATATCGC-3′；內引物序列為fcbD-FIP：5′-TTGCACAATGGTAAGTAAGTTTTCCACAA-ACTACCCATTTGAAGTC-3′/fcbD-BIP：5′-GGA-TATCAATTGTGTGCAGTCAGATCGAGACA-AAATCATACTTTGC-3′。引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

1.4 LAMP方法的建立按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，提取兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，利用針對F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的特異性LAMP引物建立檢測F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。LAMP方法反應體系為：4×熒光及可視化LAMP MagicMix 5 μL，基因組DNA 1 μL，外引物fcbD-F3/fcbD-B3(10 μmol/L)各0.4 μL，內引物fcbD-FIP/fcbD-BIP(10 μmol/L)各3.2 μL，滅菌ddH2O 6.8 μL，共計20 μL。LAMP方法反應條件為：65℃ 90 min。反應結束后，觀察反應產物的顏色，并將反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 LAMP方法的優(yōu)化將反應體系中混合引物的終濃度保持為3.4 μmol/L不變，將外引物和內引物的濃度比設為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，將反應溫度設為62，63，64，65，66，67，68℃，將反應時間設為30，45，60，75，90，105 min，對LAMP方法進行優(yōu)化，確定最佳的反應條件。

1.6 LAMP方法的特異性試驗按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，分別提取兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA。分別以這些細菌的基因組DNA為模板，同時設置陰性對照，應用建立的LAMP方法進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.7 LAMP方法的敏感性試驗將兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA進行連續(xù)的10倍倍比稀釋，使LAMP反應體系中的DNA模板濃度為1×108～1×100拷貝/μL，應用建立的LAMP方法進行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.8 LAMP方法的重復性試驗取60份已知結果的病死兔肺臟樣品，平均分為3組，每組20份(A型多殺性巴氏桿菌樣品3份、D型多殺性巴氏桿菌樣品3份、F型多殺性巴氏桿菌樣品3份、支氣管敗血波氏桿菌樣品2份、肺炎克雷伯菌樣品2份、大腸桿菌樣品2份、金黃色葡萄球菌樣品2份和陰性樣品3份)。按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA，應用建立的LAMP方法分3批次檢測這些樣品，根據(jù)檢測結果統(tǒng)計批內和批間變異系數(shù)，評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品的檢測取90份來自福建省不同地區(qū)養(yǎng)兔場病死兔的肺臟樣品，按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA。應用本試驗建立的LAMP方法和已報道的雙重PCR方法[10]同時檢測這些樣品，比較兩種檢測方法的結果，評估該LAMP方法的臨床實用性。

2 結果

2.1 F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的擴增結果顯示，擴增結果可通過肉眼判讀，陽性樣品的產物為藍色，而陰性樣品的產物為淺藍色(圖1)。進一步將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性樣品的擴增產物為特征性的階梯狀條帶，而陰性樣品則無此特征性條帶(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.陰性對照

2.2 LAMP方法的優(yōu)化在LAMP方法建立的基礎上，對該方法的反應條件進行優(yōu)化。結果顯示，反應體系中引物終濃度保持為3.4 μmol/L不變，外引物和內引物的濃度比為1∶6～1∶8時，該LAMP方法擴增效果較優(yōu)，本試驗取中間值即1∶7為該方法的最優(yōu)外引物和內引物的濃度比(圖2)；當反應溫度為65℃時，該LAMP方法擴增效果最優(yōu)(圖3)；當反應時間為30 min時，該LAMP方法有擴增，且該LAMP方法的擴增效果隨擴增時間的增加而增強，因有些臨床樣品中目的基因的含量可能較低，為了使該LAMP方法既有較好的擴增效果(不產生假陰性)又能實現(xiàn)快速檢測的目的，本試驗選取60 min作為最佳反應時間(圖4)。綜上所述，該LAMP方法的最佳反應條件確定為：外引物和內引物的濃度比為1∶7，反應溫度為65℃，反應時間為60 min。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8

M.DL2000 DNA Marker;1～7.62，63，64，65，66，67，68℃

M.DL2000 DNA Marker;1～6.30，45，60，75，90，105 min

2.3 LAMP方法的特異性試驗結果顯示，該LAMP方法僅對兔源F型多殺性巴氏桿菌有擴增，對其他常見兔源病原菌包括，A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌以及陰性對照(滅菌ddH2O)均無擴增(圖5)。結果表明，該LAMP方法特異性強。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.A型多殺性巴氏桿菌;3.D型多殺性巴氏桿菌;4.支氣管敗血波氏桿菌;5.肺炎克雷伯菌;6.大腸桿菌;7.金黃色葡萄球菌;8.陰性對照

2.4 LAMP方法的敏感性試驗結果顯示，該LAMP方法的最低檢出限為1×102拷貝/μL，比雙重PCR方法的高10倍，表明該方法具有良好的敏感性(圖6)。

A,B.LAMP方法檢測結果;C.雙重PCR方法檢測結果 M.DL2000 DNA Marker;1～9.1×108～1×100 拷貝/μL的F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA模板;10.陰性對照

2.5 LAMP方法的重復性試驗結果顯示，3批次的檢測結果均與已知結果完全一致，表明該LAMP方法具有良好的重復性。

2.6 臨床樣品的檢測該LAMP方法檢出兔源F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品6份，陰性樣品84份，檢測結果與雙重PCR方法的檢測結果完全一致，表明該LAMP方法準確性高，該方法臨床實用性好。

3 討論

兔巴氏桿菌病是兔的重要疫病，該病能通過飛沫、污染的飼料和飲水等在兔群中快速傳播，各品種和日齡的兔均易感，危害嚴重[1-2]。已有研究表明，兔巴氏桿菌病主要由A型和D型多殺性巴氏桿菌引起[12-13]。然而，近年來F型多殺性巴氏桿菌感染兔的多發(fā)及該菌對兔表現(xiàn)出的強致病性使兔巴氏桿菌病的病因更加復雜，也使該病的確診更加困難。

LAMP首次建立于2000年，是一種新型的核酸快速擴增方法[14]，該方法與傳統(tǒng)的PCR不同，可以在恒溫條件下實現(xiàn)核酸的擴增，而不需要在變性、退火和延伸3個溫度條件下進行，且該方法的擴增結果可通過簡單的設備(紫外燈)判讀或通過肉眼直接判讀。因此，自LAMP建立以來已廣泛地應用于畜禽疫病的快速檢測[15-17]。多殺性巴氏桿菌血清型眾多，根據(jù)莢膜抗原的不同可將其劃分為5種血清型(A、B、D、E和F)，且各血清型菌株之間無交叉免疫[18]。fcbD基因是F型多殺性巴氏桿菌的特異性基因，其編碼的是F型多殺性巴氏桿菌莢膜成分中的軟骨素[11]。已有研究表明，基于fcbD基因能建立特異的鑒定F型多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的多重PCR方法和檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方法[10-11]。由此可見，以該基因為目的基因能建立特異的檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。

本試驗根據(jù)fcbD基因的保守序列設計了2對引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。該方法對常見兔源病原菌，包括A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無交叉反應，特異性強。此外，該方法還易于推廣應用。由此可見，該方法的建立為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供了依據(jù)。