1株牛源致病性蠟樣芽孢桿菌特征分析

雨，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蠟樣芽孢桿菌是蠟樣芽孢桿菌群中一種產(chǎn)芽孢、無莢膜的革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌[1-2]，對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能夠廣泛存在于土壤、河流等自然環(huán)境和人類食物當(dāng)中[3-4]。

蠟樣芽孢桿菌由于能夠?qū)е露喾N疾病而被廣泛關(guān)注[5-7]，其能夠引起全身性和局部感染，在免疫功能缺陷個(gè)體中能夠?qū)е滤劳鯷8]。蠟樣芽孢桿菌最常引起的是以腹瀉和嘔吐為主要癥狀的食源性疾病，分別由腹瀉相關(guān)毒素(HBL、NHE、CYTK)和嘔吐毒素引起[9-11]。關(guān)于蠟樣芽孢桿菌引起食品污染和食物中毒在我國(guó)多有報(bào)道[12-13]，除此之外蠟樣芽孢桿菌還可以引起牛猝死和奶牛乳房炎[14-15]，但由于其引起的猝死癥狀與產(chǎn)氣莢膜梭菌相似，臨床上常被混淆[16]。

為進(jìn)一步了解蠟樣芽孢桿菌疾病在奶牛養(yǎng)殖中的危害并對(duì)蠟樣芽孢桿菌疾病的診斷和防治提供參考。本試驗(yàn)以全基因組測(cè)序、藥敏檢測(cè)以及小鼠感染模型的建立為基礎(chǔ)對(duì)1株分離自猝死荷斯坦奶牛肝臟的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了特征分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2020年末，陜西省華陰縣某規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)零星荷斯坦奶牛猝死。剖檢顯示，猝死荷斯坦奶牛肝臟和腸道發(fā)生明顯病變，初步懷疑為產(chǎn)氣莢膜梭菌感染；無菌采集1頭猝死荷斯坦奶牛肝臟和小腸，送至西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2 主要試劑細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；昆明小鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；細(xì)菌培養(yǎng)96孔板為廣州潔特生物過濾股份有限公司產(chǎn)品；2×Taq PCR StarMix為北京GenStar生物科技有限公司產(chǎn)品；藥品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、CAMHB肉湯、LB肉湯和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)：取猝死荷斯坦奶牛肝臟切面涂布接種于2個(gè)5%綿羊血平板，分別置于37℃溫箱和厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h；接種環(huán)挑取過夜培養(yǎng)的菌落，劃線接種于5%綿羊血平板進(jìn)行細(xì)菌純化，分別置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

產(chǎn)氣莢膜梭菌分離培養(yǎng)：取部分肝臟和腸道內(nèi)容物接種于厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 h進(jìn)行增菌，取菌液進(jìn)行3 000 r/min離心2 min后劃線接種于TSC培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，若出現(xiàn)顏色變黑的菌落則將其平板劃線至5%綿羊血平板進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

菌種鑒定：細(xì)菌培養(yǎng)完成后分別進(jìn)行細(xì)菌菌落形態(tài)觀察、革蘭染色鏡檢、16S rRNA序列PCR擴(kuò)增并送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 分離菌株全基因組測(cè)序?qū)⒎蛛x菌株接種于LB肉湯中過夜培養(yǎng)，無菌條件下取過夜培養(yǎng)菌液3 mL，25℃、12 000 r/min離心2 min，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒流程提取分離菌株DNA并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。

1.5 分離菌株藥敏試驗(yàn)通過微量肉湯稀釋法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板每孔加入50 μL CAMHB肉湯，并將阿莫西林、氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考、磷霉素、壯觀霉素、萬古霉素、慶大霉素、四環(huán)素、乙酰甲喹在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板上進(jìn)行梯度稀釋。5% 綿羊血平板上刮分離菌株菌落，生理鹽水稀釋為麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌液，每60 μL 菌液與5 mL CAMHB混合均勻后，按照每孔50 μL加入96孔細(xì)菌培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)20 h。通過觀察孔內(nèi)菌株生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)所選抗生素對(duì)試驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)。

1.6 小鼠致病性試驗(yàn)自5%綿羊血平板上刮取分離菌株菌落，用無菌生理鹽水稀釋均勻后按照1∶100接種于150 mL LB肉湯中，37℃培養(yǎng)。每1 h取菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋后取50 μL涂布接種于5%綿羊血平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并繪制該菌株在12 h內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。

20只小鼠隨機(jī)均分為5組，將使用生理鹽水2倍梯度濃度稀釋的分離菌株菌液0.2 mL/只腹腔注射攻毒各組小鼠，并對(duì)各梯度稀釋的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，初步確定該菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量所在區(qū)間。另取40只小鼠隨機(jī)均分為5個(gè)試驗(yàn)組，在預(yù)試驗(yàn)得出的區(qū)間內(nèi)按照0.7倍進(jìn)行梯度濃度稀釋后0.2 mL/只腹腔注射攻毒試驗(yàn)組小鼠，統(tǒng)計(jì)各試驗(yàn)組小鼠死亡情況并使用IBM SPSS Statistics 26計(jì)算該菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量。全程取8只小鼠0.2 mL/只腹腔注射生理鹽水，給予與試驗(yàn)組小鼠相同飼養(yǎng)條件作為對(duì)照組。

將試驗(yàn)組死亡小鼠與對(duì)照組小鼠進(jìn)行剖檢，對(duì)比觀察試驗(yàn)組死亡小鼠的病理變化；并將病變組織器官進(jìn)行常規(guī)石蠟制片和組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定厭氧和需氧條件下，肝臟切面涂板的5%綿羊血平板上均分離到灰白色、表面粗糙、邊緣不整齊并帶有淡綠色溶血環(huán)的較大菌落(圖1)；TSC培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)符合產(chǎn)氣莢膜梭菌特征的菌落，但同樣分離得到了表面粗糙、邊緣不整齊的較大菌落；革蘭染色鏡檢顯示其為革蘭陽(yáng)性中等大小桿菌、多成對(duì)或鏈狀排列(圖1),16S rRNA序列測(cè)序結(jié)果Blast顯示分離菌株為蠟樣芽孢桿菌。

圖1 分離菌株的菌落特征及革蘭染色鏡檢(10×100)

2.2 全基因組分析經(jīng)CGE (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和 VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)分析，得知該蠟樣芽孢桿菌分離株基因組大小為5.51 Mb，MLST分型屬于ST1150，菌株基因組攜帶有磷霉素耐藥基因fosB以及多種毒素基因(表1)。使用MEGA 7.0以及在線工具iTOL (https://itol.embl.de/)對(duì)該蠟樣芽孢桿菌分離株(BN)與NCBI上記錄的我國(guó)和其他國(guó)家蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行進(jìn)化樹分析表明，相比于國(guó)內(nèi)蠟樣芽孢桿菌菌株，印度和美國(guó)的蠟樣芽孢桿菌菌株與本次分離的蠟樣芽孢桿菌之間具有更近的進(jìn)化關(guān)系，表明本試驗(yàn)所分離蠟樣芽孢桿菌可能是由國(guó)外傳入我國(guó)(圖2)。

表1 蠟樣芽孢桿菌分離株所攜帶毒素基因

圖2 不同地區(qū)蠟樣芽孢桿菌菌株進(jìn)化樹分析

2.3 分離菌株藥敏試驗(yàn)常用抗生素對(duì)該菌株的MIC顯示(表2)，氨芐西林、頭孢他啶、乙酰甲喹、磷霉素和壯觀霉素對(duì)該菌株的MIC較高(>64 mg/L)，乙酰甲喹對(duì)該菌株的MIC處于中等水平(16 mg/L)，萬古霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素對(duì)該菌株的MIC較低(<0.5～2 mg/L)。結(jié)果表明，萬古霉素、四環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素更適合蠟樣芽孢桿菌疾病的臨床用藥。

表2 蠟樣芽孢桿菌分離株對(duì)多種抗生素MIC值 mg/L

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)本試驗(yàn)中，該蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線顯示其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為2～5 h，5 h后活菌數(shù)目穩(wěn)定在7.5×108CFU/mL上下。該菌株12 h培養(yǎng)過程中，菌液D600持續(xù)上升，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液對(duì)應(yīng)D600值在0.1～1.35之間(圖3)。

圖3 蠟樣芽孢桿菌分離株生長(zhǎng)曲線

不同攻毒劑量下小鼠的死亡情況不同(表3)，在95%置信區(qū)間內(nèi)該蠟樣芽孢桿菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量的估計(jì)值為1.247×107CFU，對(duì)應(yīng)的下限和上限分別為 1.023×107，1.507×107CFU(表4)。

表3 不同攻毒劑量下小鼠死亡情況

表4 不同死亡概率對(duì)應(yīng)攻毒劑量及95%置信區(qū)間

攻毒后1 h左右小鼠開始呈現(xiàn)持續(xù)性匍匐爬行姿態(tài)，死亡時(shí)間集中在12 h內(nèi)，死亡小鼠病變主要集中于肺臟、肝臟和腸道(圖4)，表現(xiàn)為肺臟嚴(yán)重出血(圖4D)、肝臟質(zhì)地變脆、顏色變灰白(圖4E)、腸壁水腫并伴有出血(圖4F)，死亡小鼠肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定仍能分離到該蠟樣芽孢桿菌。病理切片觀察可見死亡小鼠腸黏膜脫落、腸絨毛破碎；肝細(xì)胞腫大出現(xiàn)空泡變性、肝細(xì)胞索狀排列結(jié)構(gòu)紊亂、肝血竇變窄等病變(圖5)。

A.～C.對(duì)照組小鼠肺臟、肝臟、腸道；D～F.試驗(yàn)組小鼠肺臟、肝臟、腸道

A.、B.對(duì)照組腸道、肝臟；C、D.試驗(yàn)組腸道、肝臟

3 討論

該蠟樣芽孢桿菌自猝死荷斯坦奶牛肝臟分離，基因組攜帶有多種毒素基因，腹腔注射攻毒1 h左右小鼠開始呈現(xiàn)持續(xù)性的匍匐姿態(tài)，攻毒 1×107CFU 水平時(shí)即可引起小鼠死亡；且死亡小鼠出現(xiàn)與猝死奶牛相似病變并能從肝臟分離到該蠟樣芽孢桿菌?？膳袛嘣摼昃哂休^強(qiáng)的毒力，與荷斯坦奶牛的猝死密切相關(guān)。

死亡小鼠的肝臟、腸道和肺臟均出現(xiàn)明顯病變，生產(chǎn)中綜合肝臟、肺臟和腸道等多種組織器官病變對(duì)蠟樣芽孢桿菌疾病進(jìn)行診斷能夠使診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確。藥敏試驗(yàn)顯示氨芐西林、頭孢他啶、乙酰甲喹、磷霉素和壯觀霉素對(duì)該蠟樣芽孢桿菌作用較弱，慶大霉素、萬古霉素、恩諾沙星、四環(huán)素與氟苯尼考對(duì)該蠟樣芽孢桿菌作用明顯。作為參考，畜牧生產(chǎn)中針對(duì)于蠟樣芽孢桿菌疾病的用藥可以優(yōu)先選擇慶大霉素、恩諾沙星、四環(huán)素與氟苯尼考。

本研究表明，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖中存在攜帶有多種毒素基因且對(duì)某些常用抗生素具有較強(qiáng)抵抗力的強(qiáng)毒力蠟樣芽孢桿菌菌株，與奶牛猝死密切相關(guān)。在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)蠟樣芽孢桿菌疾病的診斷和合理用藥，防止相應(yīng)蠟樣芽孢桿菌菌株經(jīng)奶制品對(duì)人類造成感染。