不同佐劑偽狂犬病病毒主要抗原決定簇gBb亞單位疫苗免疫小鼠安全性及免疫效力測(cè)定

郭廣君，韓 強(qiáng)，呂素芳，王文秀，李 峰，李振偉，謝金文，張翠花，沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東省畜禽用蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

偽狂犬病(pseudorabies,PR)又稱奧耶斯基氏病(Aujeszky's disease)，是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的包括多種病畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染病[1]。豬是該病的自然宿主和貯存者，可引起新生仔豬大量死亡，育肥豬引起明顯的呼吸道癥狀，妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎等癥狀。該病可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一。自1902年發(fā)現(xiàn)以來，PR在全球范圍內(nèi)流行，歐、美等國家20世紀(jì)90年代啟動(dòng)根除計(jì)劃，先后經(jīng)歷30多年，成效顯著。在我國，已開展實(shí)施PRV凈化工作。PRV基因組可編碼70種蛋白，目前已經(jīng)鑒定了11種糖蛋白，其中g(shù)B(glycoprotein B)是皰疹病毒中最為保守的蛋白和最主要的保護(hù)性抗原之一，能刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體非依賴性的中和抗體及特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[2]，對(duì)病毒入侵細(xì)胞、病毒復(fù)制、細(xì)胞融合及細(xì)胞間傳播來說是必需的；同時(shí)gB糖蛋白也是重要的靶標(biāo)抗原，參與病毒抗體中和、補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞的溶解及抗體依賴性細(xì)胞毒性[3-5]。

隨著世界范圍內(nèi)動(dòng)物福利要求和我國養(yǎng)豬業(yè)集約化水平的提高，工業(yè)化水平的迭代升級(jí)和大規(guī)模生產(chǎn)成本的下降，下游純化工藝的日臻成熟，亞單位疫苗的研發(fā)和新型免疫佐劑的篩選愈加迫切?；蚬こ虂唵挝灰呙缰饕ㄟ^克隆表達(dá)病原菌保護(hù)性抗原，通過分離、純化、修飾或包裝等，加入免疫增強(qiáng)劑或佐劑而制成。這類疫苗含有病原菌主要保護(hù)性抗原成分。該類疫苗優(yōu)點(diǎn)在于降低臨床副反應(yīng)、節(jié)約生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益。亞單位疫苗抗原常用的表達(dá)系統(tǒng)包括大腸桿菌、酵母菌和昆蟲桿狀病毒載體等[6-9]。gB基因在皰疹病毒成員中屬于最保守的糖蛋白基因，在不同的皰疹病毒之間，gB蛋白的功能可相互取代[10]。其基因大小約2.8 kb，編碼913個(gè)氨基酸。gB蛋白C端的99個(gè)氨基酸位于跨膜的與細(xì)胞質(zhì)接觸的一側(cè)。gB蛋白N端58個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，成熟的gB蛋白C端有3個(gè)疏水區(qū)，其中最后一個(gè)疏水區(qū)為跨膜區(qū)(74～808 aa)。gB以二硫化物連接的三聚糖蛋白復(fù)合體形式存在，即gBa、gBb和gBc，大小分別為855 aa(59～913 aa)、444 aa(59～502 aa)和411 aa(503～913 aa)。gBb和gBc是gBa剪切后的產(chǎn)物[11-12]。根據(jù)gB蛋白特點(diǎn)，本試驗(yàn)以gBb為靶標(biāo)進(jìn)行原核表達(dá)，通過不同佐劑配制PRV gBb亞單位疫苗，評(píng)價(jià)其安全性及免疫效力，探討其作為候選亞單位疫苗的技術(shù)指標(biāo)，為PR防控和凈化提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 毒株及血清PRV SA強(qiáng)毒株為實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存?zhèn)溆?。PRV陽性血清、陰性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由山東省獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑T4DNA-ligase-內(nèi)切酶、BamHⅠ和SalⅠ購自New England Biolabs(NEB)公司；Primix TaqTM(LA TaqtmVersion 2.0)購自TaKaRa 公司;pET-28a表達(dá)載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室自制;卡那霉素、辣根過氧化酶標(biāo)記的抗豬IgG購自Sigma公司;病毒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司;白油佐劑購自愛得溫特生物科技(北京)有限公司;鋁膠佐劑(M402)購自成都依思康醫(yī)藥科技有限公司;蜂膠佐劑、霍亂弧菌菌影(VCG)由山東綠都生物科技有限公司提供;Poly I:C佐劑(PIC)由加拿大薩斯喀徹溫大學(xué)安德魯教授提供。

1.4 gB主要抗原決定簇的表達(dá)與鑒定

1.4.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的Bartha K-61株全基因序列，GenBank登錄號(hào)：JF797217.1，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增PR SA強(qiáng)毒株gB基因片段，在上、下游引物分別加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列g(shù)B-F:5′-CGCGGATCCATGGCGGCCGTGA-CGCGGGCCGCCTCGGCCT-3′；gB-R:5′-ACGC-GTCGACCTAGCTCCACCTGCTGGAAGCGCC-CGGG-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以PRV SA強(qiáng)毒株基因組為模板，gB-F、gB-R為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得gB基因片段。經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/gB，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，備用。

1.4.3gB主要抗原決定簇的原核表達(dá)及鑒定 將陽性單菌接種于10 mL LB/K+培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)；將過夜培養(yǎng)菌液按1∶100接種于1 L LB/K+培養(yǎng)液中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至菌液D值為0.5時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG 25℃誘導(dǎo)4 h，4℃、12 000 r/min瞬時(shí)離心收集菌體。樣品經(jīng)超聲破碎、高速離心，取上清及沉淀制備樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。利用BSA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。利用Western blot鑒定目的蛋白的反應(yīng)原性。

1.5 疫苗的配制利用gB蛋白和不同佐劑，配制亞單位疫苗。gB-白油佐劑(gB/Oil)按1∶3比例；gB-納米鋁膠佐劑(gB/M402)按1∶3比例，其中氫氧化鋁終質(zhì)量濃度為2.5 g/L；gB-蜂膠佐劑(gB/Propolis)按1∶3比例，其中蜂膠含量為9.0 g/L；gB-VCG菌影佐劑(gB/VCG)按1∶3比例，其中VCG含量為500.0 mg/L；gB-Poly I∶C佐劑(gB/PIC)按1∶3比例，其中Poly I∶C含量為200.0 mg/L；gB-復(fù)合因子佐劑(gB/rINF)按1∶3比例，其中rINF含量為250.0 mg/L。同時(shí)gB蛋白組及PBS組做對(duì)照，各疫苗組gB蛋白終質(zhì)量濃度為250.0 mg/L。各疫苗組加入7/10 000甲醛滅活，無菌檢驗(yàn)合格，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 疫苗免疫昆明小鼠選取體質(zhì)量18～22 g SPF級(jí)昆明小鼠230只，疫苗組每組10只，對(duì)照組10只。具體分組及免疫按表1進(jìn)行。疫苗組①組免疫1次；②組于15 d進(jìn)行第2次免疫，35 d后進(jìn)行攻毒PRV SA強(qiáng)毒株，皮下注射病毒液0.2 mL(含有100 TCID50)。

表1 小鼠試驗(yàn)分組及免疫程序

1.7 臨床癥狀觀察與體質(zhì)量測(cè)定觀察小鼠的精神、采食情況42 d。分別在免疫前、后 7，14，21，28，35，42 d對(duì)試驗(yàn)小鼠分別測(cè)體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)并分析各組增重情況。

1.8 免疫效力評(píng)價(jià)

1.8.1利用ELISA方法檢測(cè)疫苗免疫后不同時(shí)間體液抗體水平情況 PRV gB蛋白按照100 ng/孔包被96孔板，用于小鼠血清ELISA檢測(cè)。分別在免疫前、后 7，14，21，28，35，42 d通過斷尾方法采血，分離血清，-40℃保存?zhèn)溆?。用PRV陽性血清和PRV陰性血清做對(duì)照，PBS緩沖液作為空白對(duì)照。取gB蛋白，按照100 μg包被ELISA酶標(biāo)板，備用。按照常規(guī)方法進(jìn)行，在波長630 nm下測(cè)定和記錄每孔的D值。結(jié)果判定：P/N值≥2.1，判定該檢測(cè)樣品為陽性；P/N值<2.1，判定該檢測(cè)樣品為陰性。

1.8.2利用PRV SA強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)力試驗(yàn) 取疫苗②組小鼠35 d進(jìn)行攻毒，每小鼠皮下注射攻毒菌液0.2 mL(100 TCID50)。按照《中國獸藥典》相關(guān)規(guī)程，攻毒后觀察7 d，觀察各組臨床癥狀并統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 目的蛋白的表達(dá)與鑒定電泳結(jié)果顯示，用 gB基因特異引物從PRV SA株基因組DNA中擴(kuò)增出1條約1 440 bp的特異條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的DNA片段長度相符(圖1)。將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a/gB用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切結(jié)果大小正確(圖2)。送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，表明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。將目的蛋白純化后得到45.0 kDa條帶單一的蛋白，符合預(yù)期大小(圖3)。PRV陽性血清為一抗，抗豬IgG的辣根過氧化物酶標(biāo)抗體為二抗，對(duì)目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果表明，表達(dá)的目的蛋白具有反應(yīng)原性(圖4)。

M.DL15000 DNA Marker;1.陰性對(duì)照；2.gB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DL15000 DNA Marker；1.pET-28a；2.pET-28a/gB雙酶切產(chǎn)物(BamHⅠ+SalⅠ)

M.蛋白Marker；1.目的蛋白

M.蛋白Marker;1.空載體pET-28a對(duì)照;2.pET-28a/gB未誘導(dǎo)表達(dá);3.pET-28a/gB誘導(dǎo)表達(dá)

2.2 疫苗安全性評(píng)價(jià)在觀察的42 d內(nèi)，一免各組小鼠精神、食欲、體溫正常。期間喂養(yǎng)嚴(yán)格定時(shí)定量飼喂，于7，14，21，28，35，42 d各測(cè)1次體質(zhì)量，并記錄每組的平均體質(zhì)量。免疫后各組之間體質(zhì)量增長無明顯差別，研究表明各佐劑亞單位疫苗對(duì)小鼠生長影響差異不顯著(圖5)。

圖5 免疫后小鼠體質(zhì)量變化

2.3 小鼠血清抗體測(cè)定由小鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果(表2、圖6)可看出，一免后14 d，各疫苗組抗體水平顯著提高，在21～28 d時(shí)抗體水平達(dá)到最高，之后開始出現(xiàn)下降，其中g(shù)B/Oil①、gB/M402①和gB/PIC①組較其他組升高顯著，gB/Propolis①、gB/VCG①、gB/rINF①和gB①組較對(duì)照組稍有提高但不顯著，對(duì)照組無明顯變化，二免后抗體顯著提高。

圖6 小鼠抗體曲線圖

表2 小鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果 D630 nm值

2.4 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)免疫攻毒組②組，35 d攻毒，每組10只小鼠，每只小鼠皮下注射0.2 mL(含有 100 TCID50)，按照《中國獸藥典》相關(guān)規(guī)程，觀察7 d，測(cè)定攻毒保護(hù)效果。效力檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，gB/Oil②組保護(hù)率為60%；gB/M402②和gB/PIC②組保護(hù)率為40%；gB/Propolis②和gB/VCG②組保護(hù)率為20%；對(duì)照組全部死亡(表3)。

表3 疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

佐劑作為免疫增強(qiáng)劑可增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，作為載體來遞送抗原到相應(yīng)的免疫細(xì)胞，降低抗原的降解，以此增強(qiáng)機(jī)體的免疫保護(hù)[13-14]。復(fù)合佐劑是將兩種或多種不同免疫效果的佐劑按一定比例進(jìn)行搭配，以發(fā)揮各種佐劑的最大效果，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，起到更強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。

PIC是20世紀(jì)60年代由美國默克公司研制。在小鼠試驗(yàn)中，PIC是IFN-α誘生劑，有抗病毒活性[15-16]。細(xì)菌菌影(bacterial ghosts，BG)是革蘭陰性菌被噬菌體q-X174裂解基因E編碼的裂解蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后形成的產(chǎn)物，是無細(xì)胞漿和核酸的細(xì)菌體[17]。細(xì)菌菌影疫苗作為一種新型疫苗，既可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫與黏膜免疫，又能產(chǎn)生細(xì)胞免疫。近年來，利用細(xì)菌菌影可遞送載體的特性，構(gòu)建重組多價(jià)亞單位疫苗、DNA疫苗及藥物遞送的應(yīng)用越來越受到人們的重視[18]。蜂膠是一種天然的免疫增強(qiáng)劑，大量的研究表明蜂膠可做為疫苗和菌苗的免疫佐劑來增強(qiáng)疫苗的免疫效果[19-20]。鋁膠佐劑是一種廣泛用于人類疫苗和獸用疫苗的佐劑，具有抗原吸附力強(qiáng)、緩釋、副作用小等特點(diǎn)[21]。白油佐劑對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的激活作用，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格相對(duì)低廉，制備工藝完備，利于大規(guī)模生產(chǎn)。利用各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的病原微生物的保護(hù)性抗原，具有成分單一、抗原純凈、安全性高等特點(diǎn)。同時(shí)也存在一些缺點(diǎn)，如免疫原性弱、半衰期短等。要增強(qiáng)抗原在機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答能力，延長其半衰期，提高抗原免疫效力，必須篩選合適的佐劑。

PRV糖蛋白B(gB)可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫[22]。近年來對(duì)gB研究較多。CODY等[23]研究發(fā)現(xiàn)，gB+MF59佐劑亞單位疫苗可有效預(yù)防產(chǎn)后和青春期女性人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染；MARIJA等[24]研究了EB病毒(epstein-barr virus，EB)gB蛋白結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，為研究EB病毒的特異性及gB亞單位疫苗作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)；田克恭等[25]發(fā)明了一種PRV亞單位疫苗，將gB、gC、gD、gII和gC蛋白混合后加入佐劑配成疫苗，可對(duì)仔豬產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。gB和 gD 糖蛋白是 PRV 重要的免疫原性蛋白，PRV 的gB和 gD 蛋白的編碼基因是開發(fā) PRV 的重組載體疫苗的目標(biāo)基因[26]。本研究使用白油佐劑、PIC佐劑、復(fù)合佐劑、鋁膠佐劑、VCG佐劑和蜂膠佐劑與gB蛋白主要抗原決定簇gBb經(jīng)過乳化制成疫苗。通過超劑量免疫體質(zhì)量18～22 g昆明鼠，免疫后小鼠精神、采食及體溫等均正常，注射部位未見異常，體質(zhì)量無明顯變化，疫苗免疫對(duì)小鼠生長無影響。研究發(fā)現(xiàn)，gB/Oil、gB/PIC和gB/M402疫苗保護(hù)率達(dá)到40%～60%，gB/VCG和gB/Propolis疫苗保護(hù)率達(dá)到20%。為進(jìn)一步研究PRV疫苗引起的免疫機(jī)制和新型亞單位疫苗及新型免疫佐劑研究提供了依據(jù)。其中針對(duì)不同佐劑gB蛋白主要抗原決定簇免疫作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。