豬圓環(huán)病毒三重PCR檢測(cè)方法的建立及其廣西地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查

趙 晶，施開創(chuàng)，劉惠心，尹彥文，龍 鳳，陸文俊，屈素潔，司紅彬*

(1.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種無(wú)囊膜單鏈環(huán)狀DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是目前已知最小的動(dòng)物病毒，迄今已發(fā)現(xiàn)PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四種病毒[1-2]。PCV1于1974年首次在豬腎細(xì)胞系(PK-15)培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，是非致病性病毒[3]，但最近的研究發(fā)現(xiàn)PCV1能在55日齡的豬胎兒肺中有效復(fù)制并產(chǎn)生病理變化，對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞有一定的影響[4]。PCV2最早是在20世紀(jì)90年代初從患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的豬中分離到，可以引起PCV相關(guān)疾病(PCVAD)，包括PMWS、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)和母豬繁殖障礙等[5]。PCV3是2016年報(bào)道的一種新型PCV，可以引起母豬繁殖障礙、PDNS等[6]。PCV4作為新近發(fā)現(xiàn)的一種病毒，其潛在影響尚待驗(yàn)證[2]。當(dāng)前，PCV2、PCV3在世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家普遍流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。迄今，PCV2、PCV3在我國(guó)大多數(shù)省份均有報(bào)道[7]，部分省份也有報(bào)道PCV1在豬群中的存在[2,8]。

當(dāng)前，PCV1、PCV2、PCV3在世界各國(guó)的豬群中普遍存在[9-10]，并且在病豬的臨床組織樣品中發(fā)現(xiàn)PCV2與PCV3存在混合感染現(xiàn)象[11-12]。由于PCV2、PCV3均可以導(dǎo)致母豬繁殖障礙、PDNS、PMWS等，其臨床癥狀和病理變化難以區(qū)分，須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)和診斷。迄今，已報(bào)道有鑒別檢測(cè)PCV1+PCV2的多重PCR[13]和多重?zé)晒釶CR[14]，PCV2+PCV3的多重PCR[15-16]、多重?zé)晒釶CR[17-18]、多重?cái)?shù)字PCR[19]，PCV1+PCV2+PCV3的多重PCR[20]，PCV1+PCV2+PCV3+PCV4的多重?zé)晒釶CR[21]。但是，迄今鑒別檢測(cè)PCV1、PCV2、PCV3的多重PCR和多重?zé)晒釶CR的報(bào)道仍然很少。本研究目的是針對(duì)PCV1、PCV2、PCV3設(shè)計(jì)特異性引物，建立同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法，并應(yīng)用于臨床流行病學(xué)調(diào)查以掌握當(dāng)前廣西省PCV的流行狀況，為有效防控該疾病提供技術(shù)方法和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株與臨床樣品PCV2疫苗株(SX07株)、豬瘟病毒(CSFV)疫苗株(C株)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)疫苗株(TJM-F92株)、偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株(Bartha-K61株)、豬口蹄疫病毒(FMDV)O型疫苗株(O/Mya98/XJ/2010株)、豬細(xì)小病毒(PPV)疫苗株(N株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)疫苗株(CV777株)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)疫苗株(H株)、PCV1和PCV3臨床陽(yáng)性樣品，均來(lái)自于廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃?zhèn)溆?。從廣西各地采集的來(lái)自2018—2020年1 312頭豬的病料，每頭豬均包括脾臟、肺臟、肝臟、腎臟、扁桃體和淋巴結(jié)等組織樣品，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑核酸提取試劑盒、Premix Taq、DNA Marker、膠回收試劑盒、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Solar Red 核酸染料購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank登錄的PCV1、PCV2和PCV3基因組序列，通過(guò)多序列比對(duì)，選擇PCV1 BJ-1株(登錄號(hào)：FJ475129)、PCV2 HX株(登錄號(hào)：KC860786)和PCV3 PCV3-US/MO2015株(登錄號(hào)：KX778720)作為參考序列，針對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(表1)，用于檢測(cè)PCV1、PCV2和PCV3。

表1 引物信息

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建以核酸提取試劑盒提取PCV2疫苗毒和PCV1、PCV3陽(yáng)性樣品的總DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)0.4 μL，模板2.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，通過(guò)膠回收試劑盒回收、純化PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板，篩選陽(yáng)性重組克隆菌，經(jīng)PCR鑒定后抽提質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。

通過(guò)分光光度計(jì)在260 nm和280 nm處測(cè)定D值，計(jì)算質(zhì)粒濃度，并通過(guò)如下公式換算成拷貝數(shù)：拷貝數(shù)/μL=6.02×1023×質(zhì)粒濃度×10-9/(660×質(zhì)粒總堿基數(shù))。

1.5 三重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化為了獲得最佳的反應(yīng)條件，利用構(gòu)建的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，采取排列組合方法，在保持其他條件不變的情況下，通過(guò)改變單一反應(yīng)條件，分別對(duì)反應(yīng)體系的引物終濃度(0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55 μmol/L)、退火溫度(51 ～60℃)和循環(huán)次數(shù)(20，25，30，35，40個(gè)循環(huán))進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的反應(yīng)條件。

1.6 敏感性試驗(yàn)將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3等比例混合后進(jìn)行10倍倍比稀釋，使3種質(zhì)粒濃度均為1010～100拷貝/μL，作為模板，對(duì)所建立的三重PCR進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。

1.7 特異性試驗(yàn)以PCV1、PCV2、PCV3 DNA以及CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、PPV、TGEV、PEDV的DNA或cDNA為模板，對(duì)所建立的三重PCR進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)選取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3濃度為1.09×107拷貝/μL的等比例混合物作為模板，對(duì)所建立的三重PCR進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，每次間隔1周。

1.9 臨床樣品檢測(cè)隨機(jī)選取242份臨床樣品，同時(shí)應(yīng)用本研究所建立的三重PCR方法與之前報(bào)道的熒光定量PCR方法[14,17]，對(duì)PCV1、PCV2和PCV3進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率。隨機(jī)選取15個(gè)陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物，回收并送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果。

應(yīng)用本研究所建立的三重PCR方法對(duì)2018—2020年采集自廣西各地的1 308份病料樣品進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)凝膠電泳判定檢測(cè)結(jié)果，出現(xiàn)預(yù)期大小183，544，344 bp條帶者判為陽(yáng)性，未出現(xiàn)目的條帶者判為陰性。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析針對(duì)不同年度、季節(jié)、地區(qū)和病種，利用卡方檢驗(yàn)計(jì)算器V1.70發(fā)生數(shù)格式和配對(duì)資料對(duì)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算卡方進(jìn)行差異性分析，當(dāng)P≤0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建以提取的PCV1、PCV2和PCV3總DNA為模板，利用特異性引物PCV1-F/R、PCV2-F/R和PCV3-F/R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的183，544，344 bp擴(kuò)增片段。產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR、測(cè)序驗(yàn)證后，重組質(zhì)粒分別命名為p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，計(jì)算成拷貝數(shù)，獲得p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3濃度分別為1.09×1010，2.97×1010，2.36×1010拷貝/μL。將3種質(zhì)粒用雙蒸水稀釋成1.09×1010拷貝/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 三重PCR反應(yīng)條件的確定經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化反應(yīng)條件后，最終確立三重PCR反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系25 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物(25 μmol/L)0.3 μL，模板2.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 5 min；變性94℃ 30 s，復(fù)性54.5℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)后；72℃ 10 min。應(yīng)用所建立的三重PCR，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3作為模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果見圖1。

M.DL2000 DNA Marker；1.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3混合物;2.p-PCV1;3.p-PCV2;4.p-PCV3;5.ddH2O

2.3 敏感性試驗(yàn)以10倍倍比稀釋的p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3三種質(zhì)粒的混合物作為模板，檢測(cè)三重PCR敏感性。結(jié)果，p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3 的檢測(cè)下限分別為1.09×103，1.09×101，1.09×102拷貝/μL(初始質(zhì)粒濃度)，具有良好的敏感性(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1～11.初始質(zhì)粒濃度為1010～100 拷貝/μL;12.ddH2O

2.4 特異性試驗(yàn)應(yīng)用所建立的三重PCR方法對(duì)包括PCV1、PCV2、PCV3以及養(yǎng)豬場(chǎng)常見的重要病毒進(jìn)行檢測(cè)以驗(yàn)證其特異性。結(jié)果顯示，該方法只能擴(kuò)增出PCV1、PCV2和PCV3目的片段，而CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、PPV、TGEV、PEDV和ddH2O則未能擴(kuò)增出條帶(圖3)，表明所建立的三重PCR方法具有良好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p-PCV1、p-PCV2 和p-PCV3混合物；2.PCV1；3.PCV2；4.PCV3；5.CSFV；6.PRRSV；7.PRV；8.FMDV；9.PPV；10.TGEV；11.PEDV；12.ddH2O

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)以濃度均為1.09×107拷貝/μL的p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3三種質(zhì)?；旌衔餅槟０?，驗(yàn)證所建立三重PCR方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，5次反應(yīng)均能擴(kuò)增出均勻一致的目的條帶，表明該方法具有良好的重復(fù)性(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p-PCV1、p-PCV2和p-PCV3 混合物；6.ddH2O

2.6 臨床樣品檢測(cè)

2.6.1符合率的比較 隨機(jī)選取242份組織病料，同時(shí)應(yīng)用所建立的三重PCR方法與文獻(xiàn)報(bào)道的熒光定量PCR檢測(cè)方法[14,17]進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PCV1、PCV2、PCV3的陽(yáng)性率分別為4.55%(11/242)，64.46%(156/242)，7.02%(17/242)，PCV1+PCV2、PCV1+PCV3、PCV2+PCV3混合感染陽(yáng)性率分別3.31%(8/242)，0.83%(2/242)，6.20%(15/242)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為98.70%，95.51%，97.83%(表2)。隨機(jī)抽取15份陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和測(cè)序，證實(shí)為PCV1、PCV2和PCV3的目的片段。

表2 242份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 %

2.6.22018—2020年廣西各地臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用所建立的三重PCR方法，檢測(cè)2018—2020年采集自廣西各地的1 308份組織病料。結(jié)果由表3可見，2018—2020年，PCV1、PCV2和PCV3的陽(yáng)性率分別為2.14%，56.65%，5.58%，病毒間陽(yáng)性率差異顯著(P≤0.05)；其間，PCV1陽(yáng)性率分別為2.45%，2.51%，0.00%，2020年顯著下降(P≤0.05)；PCV2陽(yáng)性率分別為67.00%，50.00%,32.39%，逐年顯著下降(P≤0.05)；PCV3陽(yáng)性率分別5.76%，5.02%,6.25%，各年間差異不顯著(P>0.05)。

表3 1 308份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 %

2.6.3病原時(shí)間分布 將2018—2020年1 308份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果按季度匯總后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果由表4可見，PCV1在第一、三、四季度陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)，第二季度陽(yáng)性率顯著下降(P≤0.05)；PCV2在第一、二季度陽(yáng)性率比第三、四季度陽(yáng)性率顯著下降(P≤0.05)，而在第一、二季度之間和第三、四季度之間陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)；PCV3在第一、四季度陽(yáng)性率顯著低于第三季度陽(yáng)性率(P≤0.05)，而第一、二、四季度之間陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。

表4 1 308份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果季度統(tǒng)計(jì)表 %

2.6.4病原地區(qū)分布 將2018—2020年1 308份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果按地區(qū)匯總后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果由表5可見，PCV1在河池市陽(yáng)性率最高(4.00%)，在南寧市、欽州市和玉林市未能檢出(0.00%)；PCV2在北海市陽(yáng)性率最高(79.80%)，在欽州市陽(yáng)性率最低(22.22%)；PCV3在欽州市陽(yáng)性率最高(8.33%)，在北海市陽(yáng)性率最低(1.66%)。PCV1、PCV2、PCV3的陽(yáng)性率在部分地區(qū)之間差異顯著(P≤0.05)。

表5 1 308份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果地區(qū)統(tǒng)計(jì)表 %

2.6.5混合感染情況 將2018—2020年1 308份臨床樣品的混合感染情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果由表6可見，混合感染率達(dá)到5.58%，其中，PCV2+PCV3(3.52%)、PCV1+PCV2(1.83%)以及PCV1+PCV3(0.15%)和PCV1+PCV2+PCV3(0.08%)之間的混合感染率差異顯著(P≤0.05)。

表6 1 308份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果混合感染統(tǒng)計(jì)表

3 討論

由于PCV2、PCV3在世界各國(guó)豬群的普遍流行，其所致豬的多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，而PCV2與PCV3的混合感染更加重了這些疫病的復(fù)雜性和危害性[11-12]。由于PCV2和PCV3所致臨床癥狀和病理變化具有相似性，臨床上難以區(qū)分，加上PCV1在豬群中的普遍存在對(duì)養(yǎng)豬業(yè)具有的潛在危害[4]，需要對(duì)3種病毒加以鑒別檢測(cè)，以準(zhǔn)確診斷該疫病。為此，本研究試圖建立鑒別檢測(cè)PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法。

在建立三重PCR過(guò)程中，引物是影響三重PCR擴(kuò)增效率和特異性最重要的因素[22]。為此，本研究先對(duì)大量PCV1、PCV2、PCV3毒株的基因序列進(jìn)行比對(duì)，選取病毒基因組的高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)針對(duì)不同保守區(qū)域的3對(duì)特異性引物，且擴(kuò)增PCV1(183 bp)、PCV2(544 bp)、PCV3(344 bp)的片段大小差異在100 bp以上，以便于瓊脂糖凝膠電泳判定時(shí)區(qū)分條帶。另外，需要考慮優(yōu)化反應(yīng)的最佳條件[23]。本研究應(yīng)用的商品化Premix Taq PCR反應(yīng)預(yù)混液，已包括反應(yīng)所需的PCR緩沖液、Taq聚合酶、dNTP和Mg2+，并且是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的最適比例，因此只需對(duì)引物濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終，確定3對(duì)引物的最佳終濃度均為0.3 μmol/L，最佳退火溫度為54.5℃，最佳循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，并且PCV1、PCV2、PCV3最低檢出下限分別達(dá)到1.09×103，1.09×101，1.09×102拷貝/μL(初始質(zhì)粒濃度)，成功建立了鑒別檢測(cè)PCV1、PCV2和PCV3的三重PCR方法，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)目的片段、鑒別3種病毒的目標(biāo)。

應(yīng)用所建立的PCV1、PCV2和PCV3三重PCR方法，對(duì)2018—2020年采集自廣西各地的1 308 份病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果PCV1、PCV2和PCV3陽(yáng)性率分別為2.14%，56.65%，5.58%，表明PCV在廣西豬群中廣泛流行，尤其是PCV2的感染率高達(dá)56.65%。LIU等[7]統(tǒng)計(jì)涉及我國(guó)PCV2流行情況的53篇報(bào)道，2015—2019年21個(gè)省平均陽(yáng)性率46.0%(14 230/29 051)，其中上海最低(4.7%)、新疆最高(86.3%)；XIA等[24]報(bào)道，2015—2018年從我國(guó)10個(gè)省采集的樣品，PCV2平均陽(yáng)性率為50%；這些結(jié)果表明，PCV2在我國(guó)豬群流行極為嚴(yán)重。由于PCV2感染可以抑制機(jī)體的免疫功能[25]，除了PCV2相關(guān)疫病的損失外，還會(huì)降低其他疫病的疫苗免疫效果[26-27]，導(dǎo)致混合感染、繼發(fā)感染其他疫病，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]，應(yīng)加強(qiáng)PCV2的疫苗免疫和綜合防控措施，減少PCV2所致的各種危害和損失。值得注意的是，PCV3作為2016年才發(fā)現(xiàn)的新病原，QI等[28]報(bào)道2015—2017年我國(guó)21個(gè)省174個(gè)豬場(chǎng)中豬場(chǎng)水平的陽(yáng)性率為24.1%(42/174)、樣品水平的陽(yáng)性率為12.2%，HA等[29]報(bào)道2016—2019年我國(guó)10個(gè)省271個(gè)豬場(chǎng)中豬場(chǎng)水平的陽(yáng)性率達(dá)到74.2%(201/271)、樣品水平的陽(yáng)性率高達(dá)29.3%(1 200/4 094)，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害日益顯現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)2018—2020年P(guān)CV3在廣西病料樣品的平均陽(yáng)性率達(dá)5.58%，略低于其他省份，但PCV3的危害仍然不可輕視。至于PCV1、PCV2、PCV3的混合感染，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[10,20]，而本研究發(fā)現(xiàn)2018—2020年廣西各地PCV1+PCV2、PCV1+PCV3和PCV2+PCV3混合感染的陽(yáng)性率分別為1.83%，0.15%，3.51%，其危害有待進(jìn)一步評(píng)估。

對(duì)PCV1、PCV2、PCV3的時(shí)間、空間分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，首先，PCV1、PCV2的陽(yáng)性率逐年下降，PCV3則穩(wěn)定控制。尤其是PCV2在2018—2020年間陽(yáng)性率顯著下降(P≤0.05)，這可能與2018年非洲豬瘟在我國(guó)暴發(fā)后，散戶比例明顯下降，而各規(guī)模豬場(chǎng)高度重視動(dòng)物疫病的綜合防控，大力加強(qiáng)生物安全體系構(gòu)建與運(yùn)行管理，豬場(chǎng)的整體衛(wèi)生條件和健康水平大大提高有關(guān)。其次，不同季節(jié)PCV1、PCV2、PCV3的陽(yáng)性率也有差異，第三、四季度的病原陽(yáng)性率顯著提高，可能與廣西秋冬季節(jié)天氣持續(xù)陰冷、潮濕，致使豬群應(yīng)激較大，且此季節(jié)豬群飼養(yǎng)量較大、豬群密度大有關(guān)。再次，PCV1、PCV2、PCV3的陽(yáng)性率在不同地市之間也有差異，可能與各地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化程度、管理水平有關(guān)。值得注意的是，PCV2陽(yáng)性率逐年下降，對(duì)提高豬群整體健康和免疫水平極為重要，可以提高豬群的疫苗免疫效果和降低豬群感染其他疫病的幾率。最后，PCV3在2016年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多國(guó)家均有報(bào)道[9-10]，國(guó)內(nèi)多數(shù)省份已有報(bào)道[7]。本研究中，廣西各地PCV3在2018—2020年的陽(yáng)性率分別為5.76%，5.02% 和6.25%，處于穩(wěn)定控制狀態(tài)，低于上述報(bào)道的國(guó)內(nèi)其他省份陽(yáng)性率[28-29]，但仍需持續(xù)關(guān)注并做好各項(xiàng)綜合防控措施。

綜上所述，本研究建立了一種快速、特異、靈敏、便利的PCV1、PCV2和PCV3三重PCR方法，可用于鑒別檢測(cè)3種PCV，為臨床樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)方法。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，PCV2、PCV3在廣西各地豬群廣泛流行，應(yīng)該加強(qiáng)PCV2的疫苗免疫和豬圓環(huán)病毒病的綜合防控，減少PCV對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害和損失。