母親MTHFD1及MTHFD2基因多態(tài)性與子代先天性心臟病的關(guān)聯(lián)

陳倩 黃鵬 宋欣俐 劉亦萍 孫夢婷 王婷婷 張森茂 秦家碧

（1.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計系，湖南長沙 410078；2.湖南省兒童醫(yī)院心胸外科，湖南長沙 410007）

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是新生兒中最常見的出生缺陷類型［1］，也是導(dǎo)致嬰兒死亡率升高的主要原因［2］。全球CHD 發(fā)病率約為0.9%，意味著全球每年至少有135 萬CHD 患兒出生［3］。目前許多學(xué)者認(rèn)為CHD 是由于遺傳、環(huán)境等因素單獨或綜合作用的結(jié)果［4-5］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，孕期葉酸的攝入可降低40%～60%子代CHD 的發(fā)生［6］。葉酸缺乏可導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，國內(nèi)外有研究表明母親同型半胱氨酸水平升高與子代CHD發(fā)生相關(guān)［7-8］。亞甲基四氫葉酸脫氫 酶1 （methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1，MTHFD1）基因位于染色體14q24，編碼的單一蛋白具有3 種酶的活性。MTHFD1基因編碼的C1 四氫葉酸（tetrahydrofolic acid，THF）合成酶，通過其甲酰‐THF 合成酶活性催化甲酸和THF 向10‐甲酰‐THF 的轉(zhuǎn)化，是一碳單位進(jìn)入葉酸代謝的切入點［9］。 亞 甲 基 四 氫 葉 酸 脫 氫 酶 2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，MTHFD2）是由第2 染色體上基因所編碼的線粒體酶，該酶于1960 年首次在埃利希腹水腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)［10-11］。MTHFD2具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶及環(huán)化水解酶的雙重活性，在葉酸代謝途徑中催化2個連續(xù)的反應(yīng)，MTHFD1、MTHFD2是體內(nèi)葉酸代謝產(chǎn)物相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶［12］。母親MTHFD1基因、MTHFD2基因缺陷可能會影響酶的活性，使葉酸代謝障礙及同型半胱氨酸再甲基化途徑受阻，從而引起同型半胱氨酸蓄積造成高同型半胱氨酸血癥。因此，母親MTHFD1基因、MTHFD2基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可能通過影響葉酸與同型半胱氨酸代謝改變后代對CHD 的易感性。目前，關(guān)于母親MTHFD1基因、MTHFD2基因與子代CHD關(guān)聯(lián)的研究較少，既往研究只關(guān)注MTHFD1基因的個別位點（rs2236225、rs1950902、rs1076991、rs8010584）［13-20］， 事 實 上，MTHFD1基 因、MTHFD2基因還有許多其他位點有待研究。本研究是基于醫(yī)院開展的病例對照研究，旨在評估母親MTHFD1基因、MTHFD2基因多態(tài)性及基因之間的交互作用與子代CHD的關(guān)聯(lián)，為葉酸-同型半胱氨酸代謝通路上相關(guān)基因?qū)HD 的易感性提供流行病學(xué)依據(jù)，也為揭示葉酸預(yù)防出生缺陷的潛在作用機制提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究，選取2017 年11 月至2020 年3 月在湖南省兒童醫(yī)院心胸外科就診的683 例CHD 患兒的母親作為病例組，選取同時間段內(nèi)就診于同一家醫(yī)院并排除任何先天畸形的740例兒童的母親作為對照組。本研究已獲中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會審批（審批號：XYGW‐2018‐07），并進(jìn)行了臨床試驗注冊（注冊號：ChiCTR1800016635）。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)彩色多普勒超聲和/或手術(shù)確診患單純性CHD（除心臟畸形外未合并其他系統(tǒng)畸形）患兒的母親；（2）患兒母親彼此間無親緣關(guān)系；（3）自愿參加本研究并簽署知情同意書。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患兒合并其他先天性疾??；（2）雙胎或多胎妊娠；（3）非自然受孕；（4）民族為少數(shù)民族；（5）因患精神疾病、情緒極度不穩(wěn)定而無法配合調(diào)查或?qū)υ星?、孕期暴露情況記憶不清；（6）與患兒無血緣關(guān)系；（7）無法提供血液樣本；（8）無法完成問卷調(diào)查。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病史詢問及臨床診斷排除了CHD和/或CHD以外的其他先天性疾病的患兒母親；（2）與病例無親緣關(guān)系，且對照彼此之間無親緣關(guān)系；（3）經(jīng)項目告知后，自愿加入研究并簽署知情同意書。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙胎或多胎妊娠；（2）非自然受孕；（3）民族為少數(shù)民族；（4）因患精神疾病、情緒極度不穩(wěn)定而無法配合調(diào)查或?qū)υ星?、孕期暴露情況記憶不清；（5）與患兒無血緣關(guān)系；（6）無法提供血液樣本；（7）未完成問卷調(diào)查。

1.3 問卷調(diào)查

采用問卷調(diào)查以下內(nèi)容：孕母的社會人口學(xué)特征（孕齡、文化程度、過去1年的家庭收入、民族和居住地）、家族史（近親婚姻、先天畸形）、既往不良妊娠史（自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、早產(chǎn)、低出生體重、妊娠高血壓和妊娠糖尿?。?、圍孕期感冒和發(fā)熱史、圍孕期生活行為史（主動吸煙、被動吸煙、飲酒史等）、圍孕期飲茶習(xí)慣、圍孕期環(huán)境污染接觸史、圍孕期葉酸服用情況、孕母染發(fā)或燙發(fā)和飼養(yǎng)或親密接觸寵物等。

1.4 DNA的提取和基因多態(tài)性檢測

在研究對象入組后24 h 內(nèi)，由所在科室的護(hù)士采用乙二胺四乙酸抗凝管采集研究對象5 mL 外周靜脈血。血液采集后立即于4℃冰箱內(nèi)保存并在12 h 內(nèi)低溫運送回實驗室，3 500 r/min 下離心15 min，分離血漿及血細(xì)胞并進(jìn)行分裝，標(biāo)記研究對象分組及編號后保存于-80℃低溫冰箱。參考已發(fā)表的文獻(xiàn)所介紹的方法［21］篩選基因的待檢位點。具體為：檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），查詢并核實MTHFD1、MTHFD2基因的主要SNP 位點，并結(jié)合HapMap 數(shù)據(jù)庫核實SNP位點信息，要求選擇tanSNP時r2所設(shè)的閾值不小于0.8 且要求各位點最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥10%。最終選擇了13個基因 位 點 （rs1950902、 rs2236225、 rs2236222、rs11849530、 rs1256146、 rs2236224、 rs1256142、rs34616731、 rs7571842、 rs702466、 rs828858、rs828903、rs1095966）作為本研究的待檢基因位點。利用MassARRAY 飛行時間質(zhì)譜（Agena iPLEXassay，San Diego，CA，USA）對MTHFD1、MTHFD2基因的13個SNP 位點進(jìn)行檢測，具體檢測工作由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分率或構(gòu)成比（%）表示，2 組間計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，等級資料的比較采用Wilcoxon秩和檢驗。涉及多重比較時，采用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正的方法調(diào)整P值以控制假陽性率，得到校正P值（QFDR），并以QFDR≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在描述比較基因多態(tài)性位點基因型分布頻率之前，對照組人群進(jìn)行Hardy‐Weinberg平衡檢驗，P≥0.05則說明各基因頻率達(dá)到遺傳平衡。采用單因素和多因素logistic回歸分析，分別計算未調(diào)整和調(diào)整的相對危險比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），并控制潛在的混雜因素，以檢驗?zāi)赣HMTHFD1、MTHFD2基因多態(tài)性與CHD 的關(guān)聯(lián)強度。利用Haploview 4.2 軟件計算不同SNP 位點之間的r2值，r2＜0.8 表明SNP 位點之間不存在連鎖不平衡；同時，利用四配子檢驗法構(gòu)建單倍型，并分析各單倍型在病例組和對照組之間的分布。采用廣義多因子降維法（generalized multifactor dimensionality reduction，GMDR）和logistic 回歸法分析基因-基因交互作用，在模型有統(tǒng)計學(xué)意義的情況下，測試樣本的準(zhǔn)確度越大、交叉驗證一致性越接近10，其模型越好。

2 結(jié)果

2.1 2組基線資料的比較

病例組和對照組的基線數(shù)據(jù)匯總見表1。結(jié)果顯示，孕母居住地、文化程度、家庭年收入、家族成員有先天畸形史、近親婚配史、既往不良妊娠史（死胎或死產(chǎn)、妊娠糖尿病、妊娠高血壓）及圍孕期感冒或發(fā)熱史、葉酸補充、不良生活習(xí)慣（主動或被動吸煙、飲酒）、圍孕期環(huán)境污染物接觸史、圍孕期孕母染發(fā)或燙發(fā)和飼養(yǎng)或親密接觸寵物等指標(biāo)在2 組間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在后續(xù)多因素分析中，這些因素將作為混雜因素進(jìn)行控制。

表1 病例組和對照組的基線資料比較 ［n（%）］

2.2 對照組MTHFD1 和MTHFD2 基因位點Hardy‐Weinberg平衡檢驗

對 照 組MTHFD1和MTHFD2基 因 型Hardy‐Weinberg 平衡檢驗結(jié)果如表2～3 所示，對照人群MTHFD1和MTHFD2基因的13個位點的基因型分布均符合Hardy‐Weinberg 平衡定律（均P＞0.05），表明對照組的樣本人群具有良好的群體代表性。

表2 母親MTHFD1基因型分布頻率及對照組Hardy‐Weinberg平衡檢驗

表3 母親MTHFD2基因型分布頻率及對照組Hardy‐Weinberg平衡檢驗

2.3 母親MTHFD1 和MTHFD2 基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)分析

母親MTHFD1和MTHFD2基因上13個位點的SNP與子代CHD的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表4～5所示。在調(diào)整表1基線資料比較中差異有有統(tǒng)計學(xué)意義的混雜 因 素 后， 母 親MTHFD1基 因rs1950902、rs11849530 和rs1256142 位 點 及MTHFD2基 因rs1095966位點的多態(tài)性與子代CHD存在關(guān)聯(lián)。

表4 （續(xù)）

表4 母親MTHFD1基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)

在位點rs1950902 上，攜帶AA 基因型的母親與攜帶GG基因型相比，子代CHD的風(fēng)險顯著降低（OR=0.57，QFDR=0.040）。該位點的隱性模型（OR=0.62，QFDR=0.048）和加性模型（OR=0.78，QFDR=0.040）可降低子代CHD的風(fēng)險。

在位點rs11849530 上，攜帶GA （OR=1.49，QFDR=0.011）或GG（OR=2.04，QFDR=0.002）基因型的母親與攜帶AA基因型相比，子代CHD的風(fēng)險顯著增加。該位點的顯性模型（OR=1.62，QFDR=0.002）、隱性模型（OR=1.71，QFDR=0.009）和加性模型（OR=1.44，QFDR=0.001）與子代CHD 風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。

在 位 點rs1256142 上，攜 帶GA （OR=2.34，QFDR＜0.001）或AA（OR=3.25，QFDR＜0.001）基因型的母親與攜帶GG基因型相比，子代CHD的風(fēng)險顯著增加。該位點的顯性模型（OR=2.59，QFDR＜0.001）、隱性模型（OR=1.77，QFDR=0.001）和加性模型（OR=1.78，QFDR＜0.001）與子代CHD 風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。

在 位 點rs1095966 上，攜 帶CA （OR=0.68，QFDR=0.032）基因型的母親與攜帶CC 基因型相比，子代CHD 的風(fēng)險顯著降低。該位點的顯性模型（OR=0.68，QFDR=0.040） 和加性模型（OR=0.78，QFDR=0.032）可降低子代CHD的風(fēng)險。

表5 母親MTHFD2基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)

2.4 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖不平衡分析顯示，母親MTHFD1和MTHFD2基因位點間不存在連鎖不平衡（r2＜0.8）。13個SNP位點共形成了3個單倍型塊（Block）（圖1）。SNP位點形成的單倍型在2組間的分布情況如表6 所示，Block1 內(nèi)包含3個位點：rs2236225、rs2236224 和rs1256142，構(gòu)成4 種單倍型：G‐G‐A、G‐G‐G、A‐A‐G 和G‐A‐G，其中G‐G‐G（OR=1.86，95%CI：1.53～2.26）、G‐A‐G （OR=1.35，95%CI：1.03～1.78）單倍型顯著增加子代CHD的風(fēng)險（QFDR≤0.05）；Block2 內(nèi) 包 含2個 位 點：rs1256146 和rs34616731，構(gòu)成3 種單倍型：G‐T、A‐A、G‐A；Block3 內(nèi) 包 含3個 位 點rs828858、rs828903 和rs7571842，構(gòu)成4 種單倍型：T‐A‐G、T‐A‐A、A‐G‐G、T‐G‐G。

表6 SNP位點形成的單倍型在病例組和對照組中的分布情況

圖1 MTHFD1 和MTHFD2 基因各位點連鎖不平衡圖 圖中紅色方框代表位點連鎖不平衡的程度，顏色越深表示位點之間連鎖不平衡強度越強?？蛑袛?shù)值為連鎖不平衡指標(biāo)的具體值，接近于100，提示兩位點之間連鎖不平衡強度越強；接近于0，則提示兩位點連鎖不平衡強度越弱，即趨向于遺傳平衡?？蛏戏綌?shù)字1～13分別對應(yīng)數(shù)字上方的位點rs號。

2.5 基因-基因交互作用分析

運用GMDR 分析母親MTHFD1和MTHFD2基因13個SNP 位點間的交互作用，結(jié)果如表7所示：2個位點（rs1950902、rs2236222）的一階交互作用、3個位點（rs1950902、rs1256142、rs1095966）的二階交互作用可能與CHD 的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)（P＜0.05）。采用logistic回歸法分析上述3個位點的二階交互作用，顯示母親rs1950902 位點攜帶基因型GA+AA、 rs1256142 位點攜帶基因型GG、rs1095966 位點攜帶基因型CC（OR=0.02，95%CI：0.01～0.12），以及rs1950902 位點攜帶基因型GA+AA、rs1256142 位點攜帶基因型GG、rs1095966 位點攜帶基因型CC+CA（OR=0.32，95%CI：0.14～0.72） 可能降低子代CHD 的風(fēng)險（QFDF＜0.05），見表8。

表7 MTHFD1和MTHFD2基因位點間交互作用分析

表8 MTHFD1和MTHFD2基因位點間交互作用的logistic回歸分析

3 討論

CHD 是影響兒童健康水平和人口素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問題［22］。研究母親葉酸代謝過程關(guān)鍵酶（如MTHFD1、MTHFD2）基因多態(tài)性與子代CHD的關(guān)聯(lián)，可為判斷親代是否為高風(fēng)險個體提供科學(xué)依據(jù)。但目前相關(guān)研究多傾向于關(guān)注患兒MTHFD1基因多態(tài)性與CHD發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)［13-19］，涉及母親MTHFD1基因多態(tài)性與子代CHD 風(fēng)險的關(guān)聯(lián)的流行病學(xué)證據(jù)還十分有限。Cheng 等［20］發(fā)現(xiàn)母親MTHFD1基因rs2236225 位點多態(tài)性與子代CHD 存在有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，并且指出，CHD患兒的母親具有較低的葉酸水平及較高的血清同型半胱氨酸濃度，這從流行病學(xué)的角度部分解釋了母親rs2236225位點基因多態(tài)性和子代CHD發(fā)生的生物學(xué)合理性。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)母親MTHFD1基因rs2236225 位點多態(tài)性與子代CHD 發(fā)生風(fēng)險的關(guān)聯(lián)，與Song等［9］和Christensen等［15］研究結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)母親MTHFD1基因rs1950902、rs11849530 和rs1256142 位點多態(tài)性與子代CHD 存在有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，與Song等［9］研究結(jié)果一致。有研究者報道了MTHFD2基因多態(tài)性與癌癥的關(guān)聯(lián)［23］，但目前尚無關(guān)于MTHFD2基因多態(tài)性與CHD關(guān)聯(lián)的研究。

本研究分析了母親MTHFD1 和MTHFD2基因13個 位 點（rs1950902、rs2236225、rs2236222、rs11849530、 rs1256146、 rs2236224、 rs1256142、rs34616731、 rs7571842、 rs702466、 rs828858、rs828903、rs1095966）的SNP 與子代CHD 的關(guān)聯(lián)，結(jié) 果 表 明， 母 親MTHFD1基 因rs1950902、rs11849530、 rs1256142 位 點 及MTHFD2基 因rs1095966位點的多態(tài)性與子代CHD 存在關(guān)聯(lián)，沒有觀察到MTHFD1基因rs2236225 位點與子代CHD風(fēng)險之間的顯著相關(guān)性，可能是由于不同人群之間的遺傳差異造成的，也可能是葉酸-同型半胱氨酸失衡對CHD 各亞型的易感性不同［24］。由于本研究中CHD 各亞型病例的樣本量有限，我們沒有分析特定CHD 亞型與母親MTHFD1、MTHFD2基因多態(tài)性之間的關(guān)聯(lián)?？偟膩碚f，本研究中涉及的一些多態(tài)性之前還沒有得到證實，而且關(guān)于母親MTHFD1、MTHFD2基因多態(tài)性與子代CHD關(guān)聯(lián)性的文獻(xiàn)仍然有限，需要更進(jìn)一步、更明確的證據(jù)來明確其機制。

本研究在基因與疾病的關(guān)聯(lián)分析中，13個位點共形成了3個單倍型塊，Block1中的單倍型G‐G‐G和G‐A‐G顯著增加了子代CHD的風(fēng)險。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CHD 具有多基因遺傳疾病的特征，疾病的發(fā)生往往是由于多個基因共同作用的結(jié)果。不同基因之間或同一基因不同位點間可能通過相互作用影響疾病的發(fā)生發(fā)展，若研究忽略了基因-基因之間的交互作用，遺傳變異的真實效應(yīng)則將無法被準(zhǔn)確地描述出來［25］。目前關(guān)于母親基因-基因交互作用對子代CHD 影響的研究較少，且不同的研究所關(guān)注的基因及位點存在差異。本研究運用了GMDR 和logistic 回歸法分析基因-基因的交互作用，結(jié)果顯示，2個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs2236222）的一階交互作用、3個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs1256142、MTHFD2rs1095966）的二階交互作用可能與CHD的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。

本研究存在以下局限性：第一，本研究是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究，通過問卷訪談的方式回顧性收集研究對象及其配偶圍孕期的相關(guān)暴露因素信息，可能存在回憶偏倚；第二，由于CHD 兒童是一個相對特殊的人群，不可能通過隨機抽樣來選擇研究對象，且本次研究只選擇了一家醫(yī)院，結(jié)果的代表性有待進(jìn)一步研究；第三，由于樣本量的限制，本研究未對MTHFD1、MTHFD2基因多態(tài)性與不同CHD 亞型的關(guān)聯(lián)進(jìn)行評估。

綜上所述，本研究顯示，母親MTHFD1基因rs1950902、 rs11849530、 rs1256142 位 點 和MTHFD2基因rs1095966 位點的多態(tài)性與子代CHD存在關(guān)聯(lián)，MTHFD1、MTHFD2基因位點構(gòu)成的單倍型（G‐G‐G 和G‐A‐G）也與子代CHD 的發(fā)生有關(guān)。MTHFD1、MTHFD2基因2個位點（MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs2236222）的一階交互作用、3個 位 點 （MTHFD1rs1950902、MTHFD1rs1256142、MTHFD2rs1095966）的二階交互作用可能與子代CHD 的發(fā)生風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)。然而，MTHFD1、MTHFD2基因的遺傳變異影響CHD發(fā)生的作用機制仍不明確，未來還需要開展更多研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無任何利益沖突。