咖啡因治療早產(chǎn)兒呼吸暫停相關(guān)基因多態(tài)性的研究進(jìn)展

謝江彪 綜述 林新祝 審校

（廈門市婦幼保健院（廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院）新生兒科/廈門市圍產(chǎn)-新生兒感染重點實驗室，福建廈門 361001）

1 早產(chǎn)兒呼吸暫停

早產(chǎn)兒呼吸暫停（apnea of prematurity，AOP）是指胎齡＜37周的早產(chǎn)兒呼吸停止時間≥20 s，或不足20 s 但伴有心率下降（＜100 次/min）、出現(xiàn)青紫或蒼白［1］。AOP 的發(fā)生主要與呼吸控制系統(tǒng)的發(fā)育不成熟有關(guān)，發(fā)病率與胎齡和出生體重呈負(fù)相關(guān)。據(jù)報道，胎齡＜28 周和出生體重＜1 000 g 的早產(chǎn)兒幾乎都有AOP 的相關(guān)癥狀，胎齡為30 周、34周和＞34周的早產(chǎn)兒AOP發(fā)生率分別為85%、20%和10%；出生體重＜1 500 g 和＜2 500 g 的早產(chǎn)兒AOP發(fā)生率分別為53.7%和25%，一定程度上，早產(chǎn)兒胎齡和出生體重越低，呼吸中樞發(fā)育越不成熟，越容易發(fā)生呼吸暫停［1-4］。

研究發(fā)現(xiàn)，AOP 不僅與呼吸中樞發(fā)育程度相關(guān)，遺傳因素也參與了AOP 的發(fā)病。2003 年的一項研究顯示，父母為一級近親結(jié)婚的早產(chǎn)兒AOP患病率增高（OR=2.9，95%CI：1.3～6.4），首次表明了遺傳因素在AOP 發(fā)病中的重要作用［5］。一項單中心的回顧性研究納入了317 對胎齡＜37 周的雙胞胎，發(fā)現(xiàn)在同性別的雙胞胎中AOP 的遺傳效應(yīng)占87%（95%CI：0.64～0.97）［6］。Kumral 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AOP 的發(fā)病與早產(chǎn)兒攜帶的腺苷受體基因有關(guān)。因此，AOP 這種與呼吸控制系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的疾病同時具有重要的遺傳基礎(chǔ)。

2 咖啡因治療AOP的個體差異

甲基黃嘌呤類藥物，如咖啡因、茶堿、氨茶堿是治療AOP 的主要藥物，咖啡因與其他甲基黃嘌呤類藥物相比，其半衰期長、治療窗廣、不良反應(yīng)少、生物利用度高且通常不需要監(jiān)測血藥濃度［8］，現(xiàn)已成為治療AOP 的首選藥物。一項咖啡因治療AOP 的大型隨機(jī)對照研究，已經(jīng)證明了標(biāo)準(zhǔn)劑量枸櫞酸咖啡因（負(fù)荷劑量20 mg/kg，維持劑量為每日5 mg/kg）的安全性和有效性［9］，但實際臨床中發(fā)現(xiàn)，在相同的治療方案下，一些患兒對咖啡因療效不佳，使用咖啡因后仍然存在頻發(fā)的呼吸暫停［10-11］，需要更高劑量的咖啡因或必須聯(lián)合正壓通氣支持治療。Rosen 等［12］納入66 名胎齡＜33 周的早產(chǎn)兒，其中36 名對7.5 mg/kg 維持劑量的枸櫞酸咖啡因無反應(yīng)，需進(jìn)一步增至10 mg/kg。我國一項研究納入78 名極低出生體重兒，發(fā)現(xiàn)10 mg/kg 維持劑量枸櫞酸咖啡因與5 mg/kg 相比有效 率 更 高（71% vs 48%，P＜0.05）［13］。Mokhtar等［14］對43 名AOP 患兒的研究顯示，18 名對咖啡因反應(yīng)良好，使用咖啡因后呼吸暫停次數(shù)顯著減少，25 名對咖啡因治療無反應(yīng)，用藥后呼吸暫停頻率減少不足50%或必須聯(lián)合正壓通氣治療。這表明咖啡因治療AOP 的療效存在個體差異?？Х纫蚴鞘澜缟鲜褂米疃嗟木窕钚晕镔|(zhì)，對中樞神經(jīng)、呼吸、心血管等多個系統(tǒng)產(chǎn)生影響，有緩解疲勞、提高警覺、改善運(yùn)動性能等功效［15］。在成人中，不同個體對咖啡因的敏感性不同，使用咖啡因后的效應(yīng)存在個體差異，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)遺傳變異是引起這種差異的一個重要來源［16］。因此，遺傳變異可以解釋咖啡因治療AOP 患兒療效的個體差異。

3 咖啡因治療基因組學(xué)研究現(xiàn)狀

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對于咖啡因治療的研究已經(jīng)達(dá)到基因?qū)用妗魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是由基因組DNA序列中單個堿基的轉(zhuǎn)換或顛換所形成的變異，是人類遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。基因多態(tài)性尤其SNP 對咖啡因治療AOP療效的影響已成為近年來研究的熱點。

如前所述，AOP 的患病受到遺傳因素的影響，且觀察到在相同治療方案下咖啡因?qū)σ恍〢OP 患兒治療效果不佳，需要更高劑量或聯(lián)合呼吸支持，表明該藥在早產(chǎn)兒中存在療效的個體差異性。為了提高咖啡因使用的安全性和有效性，有必要對影響其療效的遺傳因素進(jìn)行分析。目前關(guān)于咖啡因治療AOP 療效的研究基因達(dá)20 余種。主要針對以下3個方面的基因：（1）咖啡因作用受體相關(guān)基因，包括4種腺苷受體基因；（2）咖啡因代謝相關(guān)基因，包括6 種CYP基因、AHR基因；（3）與咖啡因作用相關(guān)的其他14 種基因，包括9 種PDE基因和ADA、CLOCK、BMAL1、AHRR、ARNT基因。 其 中ADORA1、ADORA2A、ADORA3、PDE4D、AHR、ADA、CLOCK基因與咖啡因療效密切相關(guān)，且研究也較為深入。

3.1 咖啡因作用受體相關(guān)基因多態(tài)性

3.1.1ADORA1基 因ADORA1基 因 為 腺 苷 受體A1基因，位于染色體1q32.1上，長約39 kb，包含4個外顯子。ADORA1基因編碼的A1受體由326個氨基酸組成，在大腦中廣泛表達(dá)，含量最高，主要分布于神經(jīng)突觸［17］。咖啡因通過拮抗大腦內(nèi)A1 受體，減少腺苷對呼吸的抑制作用，提高呼吸中樞對高碳酸血癥的敏感性，增加神經(jīng)興奮性和呼吸驅(qū)動［18］。ADORA1基因在人群中表達(dá)為高度多態(tài)性，在不同地區(qū)和民族中各基因型分布頻率差異顯著，rs10920568、rs16851030、rs12744240、rs9660662、rs3766560、rs3753472 等是ADORA1基因常見且研究較多的SNP 位點。Kumral 等［7］的一項前瞻性病例對照研究首次證明了ADORA1基因多態(tài)性和咖啡因療效的相關(guān)性，在55 名AOP 患兒中，25名對咖啡因治療無反應(yīng)，在胎齡＞28周的早產(chǎn)兒中，對咖啡因治療有反應(yīng)的早產(chǎn)兒攜帶ADORA1rs16851030 位點CC 基 因 型，CT 和TT 基因型對咖啡因治療無反應(yīng)（P=0.002）。He等［19］的研究入選了14個ADORA1的SNP 位點，發(fā)現(xiàn)咖啡因療效在rs10920568和rs12744240位點不同基因型中存在差異，攜帶rs10920568 位點G 突變基因和rs12744240 位點T 突變基因?qū)Х纫驘o反應(yīng)（P＜0.05）。因此，咖啡因療效與ADORA1基因不同位點的SNP相關(guān)。

3.1.2ADORA2A基因ADORA2A基因為腺苷受體A2a 基因，定位于染色體22q11.23 上，長約18 kb，包含6個外顯子。ADORA2A基因編碼的A2a 受體由412個氨基酸組成，在大腦中主要分布于含有高濃度多巴胺的區(qū)域，在嗅覺結(jié)節(jié)和背側(cè)紋狀體神經(jīng)元也有高水平表達(dá)［20］。咖啡因作用于A2a受體，阻斷γ‐氨基丁酸的釋放，減少對低氧的抑制，增加呼吸輸出［18］，同時能調(diào)節(jié)膈肌的神經(jīng)活動而刺激膈肌收縮［21］。研究表明，咖啡因引起的焦慮反應(yīng)和對睡眠、運(yùn)動的影響受到ADORA2A基 因 多個 位 點SNP 的 影 響［22］。rs5751876 是ADORA2A中研究最多的常見SNP 位點，與其他SNP位點如rs2298383和rs3761422等處于高度連鎖不平衡狀態(tài)。此位點突變?yōu)橥x突變，不影響氨基酸序列，但其突變可能改變A2a受體活性和數(shù)量表達(dá)［23］。Childs等［24］研究發(fā)現(xiàn)rs5751876位點的不同基因型對服用咖啡因后引起的焦慮反應(yīng)有顯著影響（P＜0.05），相比于T等位基因攜帶者，C等位基因攜帶者攝入咖啡因后更容易產(chǎn)生焦慮，對咖啡因的敏感度更高。Mokhtar等［14］研究表明，對咖啡因無反應(yīng)的早產(chǎn)兒rs5751876 位點T 等位基因頻率顯著升高（P=0.019，OR=2.89，95%CI：1.17～7.13）。 Kumral 等［7］研究發(fā)現(xiàn) rs5751876、rs35320474、rs3761422位點CT和TT基因型AOP患病風(fēng)險顯著增高。此外，He 等［19］的研究中發(fā)現(xiàn)rs34923252 位點A 突變基因攜帶者和rs5996696 位點C突變基因攜帶者對咖啡因反應(yīng)優(yōu)于未突變的純合子基因型個體。

3.1.3ADORA2B、ADORA3基因ADORA2B基因為腺苷受體A2b 基因，定位于染色體17p12上，長約30 kb，包含6個外顯子。ADORA2B基因編碼的A2b受體由328個氨基酸組成，在全身都有表達(dá)，但表達(dá)程度普遍較低，在4種腺苷受體中對腺苷的親和力最低［25］。ADORA3基因為腺苷受體A3基因，定位于染色體1p13.2上，長約80 kb，包含2個外顯子，其編碼的A3受體由318個氨基酸組成，在睪丸、大腦、腎臟和肺中高表達(dá)［26］。A2b和A3 受體的激活都與肺部炎癥介質(zhì)釋放有關(guān)，拮抗A2b 和A3 受體可以減輕過敏原等誘導(dǎo)的肺部炎癥和支氣管痙攣，改善呼吸功能［27］。A2b 和A3 受體的抑制需要高濃度的咖啡因，而低濃度的咖啡因即可對A1 和A2a 受體產(chǎn)生拮抗作用，因此咖啡因治療AOP主要通過拮抗A1和A2a受體［28］。目前尚未發(fā)現(xiàn)ADORA2B基因的多態(tài)性與咖啡因療效的相關(guān)性，但在ADORA3基因中發(fā)現(xiàn)rs10776727 和rs2298191 位點的SNP 與咖啡因療效有關(guān)［19］，攜帶rs10776727 位點A 突變基因和rs2298191 位點C 突變基因?qū)Х纫蛑委煙o反應(yīng)，其具體機(jī)制尚不明確，這些位點的SNP 對咖啡因療效影響的相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.2 咖啡因代謝相關(guān)基因多態(tài)性

3.2.1CYP1A2基因CYP1A2基因 屬 于細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶系基因家族，位于染色體15q24.1上，長約7.7 kb，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子，表達(dá)細(xì)胞色素酶系中CYP1A2酶?？Х纫蛴筛闻K中CYP1A2、CYP2E1 酶代謝，經(jīng)去甲基作用生成副黃嘌呤、茶堿和可可堿，其中CYP1A2酶占到了代謝的90%，并負(fù)責(zé)84%副黃嘌呤、12%茶堿和4%可可堿的代謝［16］。已經(jīng)報道的CYP1A2基因功能相關(guān)的SNP達(dá)40余種，其常見位 點 rs2069514、 rs35694136、 rs2069526 和rs762551等的SNP可以影響酶的活性，進(jìn)而表現(xiàn)出個體咖啡因代謝水平的差異。如rs762551 位點AA基因型對CYP1A2酶具有更高的誘導(dǎo)性，因而對咖啡因的代謝速率更高［29］。此外，有研究表明，rs2472299 位點的SNP 與咖啡因攝入習(xí)慣相關(guān)［30］。He等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在早產(chǎn)兒中，血漿咖啡因水平與CYP1A2基 因rs762551 和rs2472299 位點 的SNP無關(guān)。Gao 等［31］對早產(chǎn)兒咖啡因的藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行了研究，并且分析了CYP1A2基因的多態(tài)性和咖啡因藥物代謝的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP1A2基因 多 態(tài) 性（rs2069514、 rs2069521、 rs2069526、rs2470890、rs35694136、rs3743484、rs56107638和rs762551）不影響咖啡因的藥物代謝過程。

研究表明，CYP1A2 酶在新生兒期無顯著表達(dá)，1～3 月齡時只有成人的10%～15%［32］。早產(chǎn)兒由于肝酶系統(tǒng)發(fā)育的不成熟，咖啡因基本不經(jīng)過肝臟清除，因此CYP1A2基因的多態(tài)性不影響咖啡因在早產(chǎn)兒中的代謝，對咖啡因的療效也沒有顯著的相關(guān)性。

3.2.2AHR基因AHR基因為芳香烴受體基因，位于染色體7p21.1上，長約47 kb，由11個外顯子組成。AHR基因表達(dá)的芳香烴受體（arylhydrocarbon receptor，AHR）由848個氨基酸組成，作為1 種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)CYP1A1和CYP1A2基因的表達(dá)。AHR基因在胎盤、肺、胸腺、腎臟和肝臟中高度表達(dá)。全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定AHR基因的SNP 與咖啡因攝入量相關(guān)［33］。如歐洲人種咖啡因攝入量在rs4410790 位點不同基因型中存在顯著差異，同時此位點的SNP 已經(jīng)被證明影響咖啡因的去甲基化代謝過程［34］。He等［19］與Guo等［35］研究發(fā)現(xiàn)AHR基因rs4410790 和rs1476080 位點SNP 與咖啡因療效有關(guān)（P＜0.05）。如前所述，CYP1A2 酶在新生兒期基本不參與咖啡因的代謝，因此AHR基因可能不通過CYP1A2 酶的代謝途徑來影響咖啡因療效。然而，AHR 在支氣管、細(xì)支氣管和肺泡上皮細(xì)胞中高表達(dá)，參與呼吸功能的調(diào)節(jié)。AHR 缺乏會下調(diào)介導(dǎo)器官發(fā)育和細(xì)胞增殖的基因，上調(diào)增加炎癥的基因，影響肺的發(fā)育。此外，AHR 信號通路在保護(hù)新生小鼠和胎兒肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受高氧損傷中發(fā)揮重要作用［36］。因此AHR 信號通路可能通過影響早產(chǎn)兒肺功能而間接影響咖啡因療效。

3.3 與咖啡因作用相關(guān)的其他基因多態(tài)性

3.3.1PDE4D基因PDE4D基因?qū)儆诹姿岫ッ福╬hosphodiesterase，PDE）系基因家族，位于染色體5q11.2‐q12.1上，長約617 kb，包含39個外顯子，編碼PDE4D 酶?？Х纫蚴堑?個被確定的PDE 抑制劑，可非選擇性拮抗此酶，減少第二信使環(huán)磷酸腺苷的濃度，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放，拮抗γ‐氨基丁酸A型受體?，F(xiàn)普遍認(rèn)為生理濃度的咖啡因不發(fā)揮PDE 的抑制作用，因此與治療AOP 的關(guān)系不大［28］。但有研究發(fā)現(xiàn)，咖啡因療效與PDE4D基因rs10075508 位點多態(tài)性有關(guān)，攜帶TT基因型對咖啡因治療無反應(yīng)（P=0.032）［19］。此基因位點與咖啡因療效的相關(guān)性需更大樣本的研究進(jìn)一步論證，對其機(jī)制也需進(jìn)一步探究。

3.3.2ADA基因ADA基因為腺苷脫氨酶基因，位于染色體20q13.12 上，長約32 kb，包含12個外顯子，編碼腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）。人體內(nèi)腺苷由ADA 脫氨生成肌酐而被清除。ADA可通過與腺苷受體A1、A2a、A2b結(jié)合而影響腺苷受體的可用性［37］。研究表明，ADA 活性受到ADA基因多態(tài)性的影響，如rs73598374 位點G到A的突變導(dǎo)致ADA的活性降低，在GA基因型個體中，ADA 活性下降20%～30%，而攝入咖啡因可以作為ADA基因多態(tài)性功能效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑進(jìn)而影響ADA 的功能［38］。He 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，咖啡因治療AOP 的療效在ADA基因rs521704 位點不同基因型中表現(xiàn)出了顯著差異，CA和CC基因型對咖啡因反應(yīng)較好（P＜0.05）。因此ADA基因多態(tài)性可能與咖啡因療效相關(guān)，由于相關(guān)研究尚少，需要在更大樣本、不同種群的研究中加以論證。

3.3.3CLOCK基因CLOCK基因為晝夜節(jié)律基因，位于染色體4q12，長約118 kb，由28個外顯子組成，編碼CLOCK 蛋白。CLOCK 蛋白由846個氨基酸組成，與芳香烴受體核轉(zhuǎn)錄蛋白樣1形成異二聚體，控制內(nèi)源性晝夜節(jié)律系統(tǒng)。CLOCK基因的常見SNP（次要等位基因頻率≥1%）在非洲人中有406個，歐洲人中有271個，亞洲人中有278個，美洲大陸人中有277個［39］，這些SNP 的遺傳變異引起生理變化，進(jìn)而導(dǎo)致睡眠結(jié)構(gòu)和對精神疾病的易感性改變。如rs1801260 位點的SNP 影響CLOCK基因mRNA 的表達(dá)、功能和穩(wěn)定性，與晝夜節(jié)律紊亂相關(guān)，rs12649507位點G等位基因攜帶會增加睡眠障礙風(fēng)險［40-41］。晝夜節(jié)律的調(diào)控在人體細(xì)胞內(nèi)普遍存在，有研究表明晝夜節(jié)律與藥物在組織的循環(huán)和分布有關(guān)，影響組織對藥物的反應(yīng)［42］。咖啡因通過拮抗腺苷受體而促進(jìn)覺醒，干擾睡眠，并調(diào)節(jié)CLOCK基因的表達(dá)而影響晝夜節(jié)律［43］。Guo 等［35］的研究發(fā)現(xiàn)包括rs12649507 在內(nèi)的18個CLOCK基因位點SNP與咖啡因療效顯著相關(guān)。因此晝夜節(jié)律可能對咖啡因的療效起著關(guān)鍵作用。此外，與咖啡因代謝相關(guān)的AHR 同樣是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律周期的關(guān)鍵因子，和CLOCK 晝夜節(jié)律信號通路相互作用［44］，共同對咖啡因的療效產(chǎn)生影響，其機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

4 小結(jié)

AOP 這種與發(fā)育相關(guān)的疾病也具有遺傳學(xué)因素，咖啡因是目前應(yīng)用最廣泛的治療藥物，其療效受到遺傳因素的影響，與多種基因SNP 密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全明確。目前國內(nèi)外研究尚處于起步階段，未來需對AOP 的易感基因進(jìn)行探索，以及開展更為全面的影響咖啡因療效相關(guān)基因多態(tài)性研究，以揭示AOP 發(fā)病和治療的遺傳學(xué)機(jī)制，對攜帶AOP 不同易感基因的早產(chǎn)兒進(jìn)行干預(yù)，并優(yōu)化咖啡因在早產(chǎn)兒中的應(yīng)用，進(jìn)一步提高治療效果，改善早產(chǎn)兒預(yù)后。