8例囊性纖維化患兒臨床及基因突變分析

張娜 劉建華 褚亞娟 帥金鳳 黃坤玲

（1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北省兒童醫(yī)院呼吸二科，河北石家莊 050031）

囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）是一種常染色體隱性遺傳的慢性致死性疾病，發(fā)病機(jī)制為囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）突變導(dǎo)致CFTR通道蛋白的離子和水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，累及呼吸道、消化、生殖多個(gè)系統(tǒng)，臨床表現(xiàn)為反復(fù)呼吸道感染、胰腺功能不全、男性雙側(cè)輸精管缺失等［1］。CF 發(fā)病率存在種族、地域差異性，多見于白種人。美國(guó)發(fā)病率約1∶4 000［2］，英國(guó)約1∶2 500［3］，日本約1∶350 000［4］，我國(guó)少見，暫無該病的流行病學(xué)資料。近幾年隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)進(jìn)步，我國(guó)CF 患者被更多地確診，但存在診斷延遲現(xiàn)象。本文總結(jié)分析8 例CF 患兒的臨床及遺傳學(xué)特征，讓更多臨床醫(yī)生了解并重視該病，減少誤診漏診。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

以河北省兒童醫(yī)院2018～2021年確診的8例CF患兒為研究對(duì)象，進(jìn)行回顧性病例總結(jié)分析。

CF的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］：（1）一項(xiàng)或多項(xiàng)典型CF臨床特征；（2）CF家族史；（3）新生兒CF篩查試驗(yàn)陽 性；（4） 汗 液 氯 離 子 濃 度≥60 mmol/L；（5）CFTR2個(gè)致病變異（父母雙方等位基因各提供1個(gè)）；（6）CFTR 功能障礙（鼻電位差和/或腸道電流測(cè)量）。滿足其中（1）～（3）中至少1條，加上（4）～（6）中至少1條即可診斷為CF。

胰腺CF的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：符合CF的患兒具有胰腺受損的臨床表現(xiàn)，主要為胰腺外分泌功能不全（pancreatic insufficiency，PI）［7］導(dǎo)致的脂肪、蛋白質(zhì)和糖類的吸收障礙，可表現(xiàn)為腹瀉、體重下降，嚴(yán)重時(shí)可引起脂肪瀉、營(yíng)養(yǎng)不良及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等癥狀。影像學(xué)檢查可見胰腺受損征象，如胰腺飽滿、胰腺實(shí)質(zhì)回聲不均、胰腺脂肪化、胰腺纖維化、胰腺擴(kuò)張、胰腺萎縮、胰腺囊腫樣變等。

1.2 方法

病例資料收集：通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)，收集患兒的確診年齡、起病年齡、性別、既往史、個(gè)人史、家族史、體格檢查、各項(xiàng)檢查結(jié)果、治療及隨訪情況等。

CFTR基因變異分析：（1）突變篩查：高通量測(cè) 序（二 代 測(cè) 序， next‐generation sequencing，NGS） 檢測(cè)變異，多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiple ligation probe amplification，MLPA）檢測(cè)基因缺失與重復(fù)及拷貝數(shù)變異。（2）基因數(shù)據(jù)分析：變異分級(jí)依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì) （American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的2015測(cè)序變異的解讀指南進(jìn)行致病性等級(jí)分類，查詢CFTR2 數(shù)據(jù)庫（https://www. cftr2. org/）、CFTR‐France 數(shù) 據(jù) 庫（https://cftr.iurc.montp.inserm.fr/cgi‐bin/home.cgi#）行致病性分析。蛋白功能預(yù)測(cè)采用REVEL、SIFT、PolyPhen‐2、 MutationTaster、 GERP+ 軟 件 。（3）Sanger 測(cè)序、qPCR 測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。以上均由北京邁基諾基因科技有限公司、智因東方北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用描述性分析。計(jì)量資料采用范圍（中位數(shù)）表示，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及臨床特征

8 例CF 患兒中，男5 例，女3 例，無CF 家族史，父母非近親結(jié)婚，無白種人通婚史。診斷年齡為3～48個(gè)月（中位年齡8個(gè)月），發(fā)病年齡為0～24個(gè)月（中位年齡2.5個(gè)月）。8例患兒的臨床特征見表1。臨床表現(xiàn)為反復(fù)呼吸道感染7 例，鼻竇炎3例，支氣管擴(kuò)張4例，腹瀉8例，脂肪瀉3例，可疑PI 6 例，胰腺CF 1 例，營(yíng)養(yǎng)不良5 例，假性Batter 綜 合 征（Pseudo‐Bartter syndrome，PBS） 4例。2例（例3、例6）行汗液電導(dǎo)率檢測(cè)，顯示汗液電導(dǎo)率增高?；純鹤畛Ｒ姷暮粑栏腥静≡瓰殂~綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA；4例）。7 例行胸部CT 檢查，其中4 例存在支氣管擴(kuò)張，見圖1。5 例行支氣管鏡檢查及治療，均可見栓狀、條索狀分泌物，見圖2。

圖1 4例患兒胸部CT表現(xiàn) A：例3，雙肺炎癥伴小囊腔，左肺上葉支氣管起始部狹窄。雙側(cè)胸膜局部增厚，可見支氣管壁增厚、支氣管擴(kuò)張（箭頭所示）。B：例4，雙肺炎癥，右肺下葉支氣管壁增厚、擴(kuò)張（箭頭所示）。C：例6，雙側(cè)支氣管肺炎，小氣道病變不除外；右肺上葉支氣管起始部、右肺中間支氣管管腔細(xì)，可見支氣管壁增厚、支氣管擴(kuò)張（箭頭所示）。D：例7，雙側(cè)支氣管擴(kuò)張（箭頭所示）伴雙肺炎癥。

圖2 5例患兒支氣管鏡下表現(xiàn) A、B、C、D、E分別為例3、例4、例5、例6、例7，均可見栓狀、條索狀分泌物（箭頭所示）。

表1 8例CF患兒臨床表現(xiàn)、輔助檢查及診斷依據(jù)

例1、例2、例3、例4入院時(shí)行電解質(zhì)及血?dú)夥治?，發(fā)現(xiàn)存在電解質(zhì)紊亂及代謝性堿中毒，見表2。

表2 4例CF患兒血電解質(zhì)及血?dú)夥治鼋Y(jié)果

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

8 例患兒均行基因檢測(cè)，均檢出CFTR基因突變。例2 為純合突變，其余7 例為復(fù)合雜合突變。共發(fā)現(xiàn)16個(gè)變異位點(diǎn)（其中4個(gè)為新發(fā)現(xiàn)變異），包括移碼突變5個(gè)，無義突變4個(gè)，錯(cuò)義突變4個(gè)，外顯子缺失2個(gè)，剪接突變1個(gè)。最常見的基因突變類型是p.G970D（3 例），觀察到1 例F508del 基因突變。8 例CF 患兒的基因突變位點(diǎn)及致病性分析見表3。

表3 8例CF患兒基因突變位點(diǎn)及致病性分析

3 討論

CF 是一種多見于白種人的常染色體隱性遺傳疾病，預(yù)后差、病死率高。1989年Riordan等［9］首次發(fā)現(xiàn)CF 的致病基因位于7q31，致病機(jī)制是CFTR基因隱性突變致CFTR 通道蛋白活性減低或喪失引起疾病。CFTR 是一種cAMP 依賴調(diào)控的氯離子通道蛋白，是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的一員。CFTR蛋白廣泛存在于氣道、胃腸道、生殖道等多種器官的上皮組織頂膜，調(diào)節(jié)離子和水的轉(zhuǎn)運(yùn)。CFTR通道蛋白的離子和水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，黏液增加，管腔堵塞，引起多系統(tǒng)功能障礙。

CF 患者通常以反復(fù)呼吸道感染為首發(fā)表現(xiàn)［10］，常表現(xiàn)為鼻竇炎、鼻息肉、反復(fù)肺部感染、支氣管擴(kuò)張、氣胸、喘息、咯血、呼吸衰竭、杵狀指等。CFTR功能障礙，氣道上皮細(xì)胞Cl-分泌減少而上皮細(xì)胞鈉離子通道吸收Na+增加，造成細(xì)胞內(nèi)高滲，從而使得氣管表面液體減少，氣道內(nèi)黏液增加，纖毛擺動(dòng)受限、清除能力下降，細(xì)菌定植引起反復(fù)炎癥，肺結(jié)構(gòu)破壞，肺功能進(jìn)行性下降，最終患者呼吸衰竭造死亡［11］。本研究中7 例CF 患兒臨床表現(xiàn)為反復(fù)肺部感染，其中伴有鼻竇炎3 例，支氣管擴(kuò)張4 例，呼吸衰竭3 例，例7 反復(fù)肺部感染，出院3個(gè)月后因呼吸衰竭死亡。7 例患兒均存在肺部影像學(xué)異常表現(xiàn)，其中4例存在支氣管擴(kuò)張。胸部CT是檢測(cè)CF患兒肺部情況的重要檢查。有研究表明，影像學(xué)比肺功能更能敏感地反映肺部嚴(yán)重程度，CF典型胸部CT表現(xiàn)包括支氣管擴(kuò)張、黏液堵塞、空氣滯留、灌注異常和肺氣腫［12］。臨床醫(yī)師需定期監(jiān)測(cè)患者肺部情況，了解疾病進(jìn)展，對(duì)于反復(fù)呼吸道感染患兒應(yīng)警惕CF。

本研究中6 例患兒診斷為可疑PI，因存在CF基礎(chǔ)疾病，有腹瀉、脂肪瀉、營(yíng)養(yǎng)不良及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等癥狀，糞便常規(guī)可見大量脂肪球，影像學(xué)檢查可見胰腺回聲改變，口服胰酶癥狀可緩解，但我院不能進(jìn)行胰腺功能檢測(cè)，故最終不能確診。CFTR功能障礙時(shí)，黏稠液體阻塞胰腺管道，導(dǎo)致炎癥、脂肪變、纖維化，隨著年齡增長(zhǎng)胰腺功能失代償，PI比例逐漸升高。國(guó)外報(bào)道約90%CF患者合并PI［13］，我國(guó)學(xué)者報(bào)道14.1% CF 患者出現(xiàn)PI［14］。我國(guó)CF患者合并PI比例明顯低于國(guó)外，可能與我國(guó)CF 患者基因突變類型多為輕型有關(guān)，故臨床表現(xiàn)輕；也可能與胰腺功能檢測(cè)困難，大部分醫(yī)院不能完成該檢測(cè)至最終確診病例少有關(guān)。隨著診斷技術(shù)的推廣與提高，PI 確診率可能有所上升。

國(guó)外報(bào)道CF 相關(guān)性肝?。╟ystic fibrosis‐related liver disease，CFLD）為CF 患者繼呼吸衰竭、肺移植并發(fā)癥的第三大死亡原因，約10%患者進(jìn)展為肝硬化，2%～3%進(jìn)展為門脈高壓［15］，目前國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道數(shù)量少。CF 患者因黏稠且具有肝毒性膽汁阻塞膽道，早期可僅表現(xiàn)為肝臟氨基轉(zhuǎn)移酶升高，但隨病情進(jìn)展可能會(huì)出現(xiàn)膽汁淤積性肝硬化、門靜脈高壓、晚期肝病。本研究中例1、例3、例5、例6、例8存在肝功能異常，影像學(xué)示肝脾、膽囊改變，但國(guó)外研究顯示肝功能異常、黃疸、膽汁淤積、膽囊結(jié)石并不是CFLD 危險(xiǎn)因素，男性、小年齡、PI、嚴(yán)重CFTR突變等是CFLD 的危險(xiǎn)因素［16-17］，但是該5 例患兒仍需警惕CFLD，臨床醫(yī)師對(duì)存在高危因素的患兒應(yīng)提高警惕以早期識(shí)別CFLD。

例1、例2、例3、例4 嬰兒期均有PBS 且為首發(fā)或主要表現(xiàn)。PBS發(fā)病機(jī)制為CFTR介導(dǎo)的Cl-和上皮細(xì)胞鈉離子通道介導(dǎo)的Na+吸收減少，大量Na+和Cl-經(jīng)汗液丟失，引起機(jī)體腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，造成電解質(zhì)紊亂。國(guó)內(nèi)外報(bào)道PBS 可為CF 的首發(fā)表現(xiàn)，出現(xiàn)在疾病早期，且容易復(fù)發(fā)［18-19］。這提醒臨床醫(yī)師，具有PBS表現(xiàn)的兒童需警惕CF，注意監(jiān)測(cè)患兒電解質(zhì)情況，尤其是天氣炎熱季節(jié)。

本研究8 例患兒中有4 例為PA 定植感染，其中2 例為耐碳青霉烯類PA。PA 屬于機(jī)會(huì)致病菌，具有分泌毒素、形成生物膜、群體感應(yīng)等特點(diǎn)［20］。2019年美國(guó)CF基因會(huì)數(shù)據(jù)顯示CF肺部病原菌43%為PA，25%為耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，14%為非結(jié)核分枝桿菌，12%為甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌［2］。美國(guó)CF 基金會(huì)指南強(qiáng)烈建議首次感染PA患者應(yīng)行早期根除治療［21］。我國(guó)目前針對(duì)PA感染主要是依據(jù)藥敏試驗(yàn)選擇敏感抗生素抗感染治療，根除PA治療臨床少見。

目前已有2 000 多種CFTR基因突變類型［10］。國(guó)外研究報(bào)道，該基因最常見的突變類型是cDNA的508 位點(diǎn)苯丙氨酸缺失（p.F508del），90%的CF患者中發(fā)現(xiàn)至少有1個(gè)F508del 等位基因，屬于第Ⅱ類突變，CFTR 蛋白功能嚴(yán)重喪失，多伴有PI［10，22］。目前我國(guó)僅報(bào)道3 例攜帶F508del 突變患者［23-25］。Tian等［25］報(bào)道我國(guó)CF突變類型多為少見突變，最常見的突變類型為p.G970D。本研究最常見的突變類型亦為p.G970D，共檢出3例，F(xiàn)508del突變1 例，與ACMG/美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）［26］提議的23個(gè)突變篩查模板不同，與國(guó)外報(bào) 道［27］的CF 最 常 見 的5 種 突 變c. 1521_1523delCTT、c.1624G＞T、c.1652G＞A、c.350G＞A、c.3909C＞G 不同，提示我國(guó)與國(guó)外CF 基因突變譜不同。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因大重排，例1患兒行全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)CFTRdel2,3突變，例3患兒全外顯子基因檢測(cè)只檢測(cè)到1個(gè)基因突變位點(diǎn)，進(jìn)一步行MLPA 檢 測(cè) 發(fā)現(xiàn)deletion exon15 突變。2018 年美 國(guó)CF 基因會(huì)病人登記信息示約3%患者檢測(cè)出＜2個(gè)致病性變異［28］。這提醒臨床醫(yī)師疑診CF患者若只檢測(cè)出1個(gè)基因突變位點(diǎn)，可進(jìn)一步行全基因組測(cè)序及MLPA 檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)deletion exon15、c. 3796_3797dupGA(p. I1267Kfs*12)、 c. 2328dupA(p.V777Sfs*2)、c.2950G＞A(p.D984N)在人類基因突變數(shù)據(jù)庫中未收錄，為新發(fā)現(xiàn)的變異，這擴(kuò)大了我國(guó)CF的基因突變譜。

汗液氯離子水平升高是CF 患者主要臨床表現(xiàn)及診斷條件之一。我國(guó)研究報(bào)道，汗液電導(dǎo)率檢測(cè)可用來代替汗液氯離子水平檢測(cè)進(jìn)行CF診斷，當(dāng)汗液電導(dǎo)率超過80 mmol/L，考慮CF診斷［8］。本研究中2 例患兒在北京兒童醫(yī)院行汗液電導(dǎo)率檢測(cè)，汗液電導(dǎo)率分別為110 mmol/L、140 mmol/L，均高于80 mmol/L，支持CF診斷。

本研究中8例患兒診斷中位年齡為8個(gè)月，中位發(fā)病年齡為2.5個(gè)月，提示CF患者存在診斷延遲現(xiàn)象，考慮以下原因：（1）我國(guó)CF 患兒臨床表現(xiàn)不典型，以肺部疾病為主要表現(xiàn)，合并PI比例低，診斷困難；（2）我國(guó)CF 診斷試驗(yàn)不完善，尚未開展新生兒CF 篩查、鼻腔電位差、腸道電流測(cè)量，開展汗液氯離子/電導(dǎo)率檢測(cè)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)少，基因檢測(cè)因價(jià)格昂貴致應(yīng)用受限；（3）在我國(guó)CF 屬于罕見病，臨床醫(yī)師對(duì)該疾病認(rèn)識(shí)不足，造成誤診漏診。

綜上，我國(guó)CF存在診斷延遲現(xiàn)象。我國(guó)CF患兒臨床表現(xiàn)不典型，最常見的臨床表現(xiàn)為反復(fù)呼吸道感染，合并PI 比例明顯低于國(guó)外。臨床上如果發(fā)現(xiàn)患兒存在反復(fù)呼吸道感染（支氣管擴(kuò)張、鼻竇炎等），合并或不合并消化系統(tǒng)表現(xiàn)和PBS，呼吸道病原學(xué)檢測(cè)示PA 陽性，需警惕CF。p.G970D 為CF 患兒最常見的突變類型，F(xiàn)508del 少見，與國(guó)外CF基因突變譜不同。本研究為CF未來精準(zhǔn)治療、制定我國(guó)基因突變譜、研究基因突變譜與臨床表型關(guān)系、產(chǎn)前診斷提供了參考依據(jù)。