病原體宏基因組二代測序在兒童粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱中的應(yīng)用價(jià)值

朱珊 劉瑛 羅海燕 楊明華 楊良春 鄧文軍

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院兒科，湖南長沙 410011；3.湖南省兒童醫(yī)院急診科，湖南長沙 410007；4.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院兒科，湖南長沙 410008）

兒童粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱是兒童惡性血液腫瘤疾病治療期間常見并發(fā)癥之一。粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的出現(xiàn)往往會(huì)影響原發(fā)疾病的治療效果，并不同程度增加患兒的治療風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用，也是延長患兒住院時(shí)間的主要因素之一［1-2］。粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱往往發(fā)生在化療后骨髓抑制期，常常表現(xiàn)為起病急驟、發(fā)展迅速、感染灶不明、病原體不明、治療難度大、治療周期長，其中病原體不明往往給準(zhǔn)確用藥帶來很大困擾，甚至可能會(huì)造成治療延誤和藥物濫用。對于大多數(shù)病原體不明的粒細(xì)胞缺乏伴感染，常規(guī)應(yīng)用1種或多種廣譜抗生素的降階梯治療已經(jīng)是相關(guān)臨床工作者所認(rèn)同和接受的基本原則［3］。如果能在感染初期獲得病原體信息，則相當(dāng)于給臨床工作者提供了“導(dǎo)航定位”的條件，使準(zhǔn)確合理的抗感染用藥成為可能，由此可以降低治療風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用，并最大程度上避免藥物濫用。臨床上病原體檢查最常用的也是最有效、最有價(jià)值的檢查為病原微生物培養(yǎng)。病原微生物培養(yǎng)及藥物敏感性檢測給臨床用藥提供了巨大幫助，但培養(yǎng)本身存在檢測周期長、陽性率低等缺點(diǎn)，使得很大一部分粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的患兒并不能取得有價(jià)值的病原體檢測結(jié)果［4］。因此引入新的病原體檢測手段是非常必要和有價(jià)值的。

宏基因組二代測序（metagenomic next‐generation sequencing，mNGS）在感染性疾病中具有獨(dú)特優(yōu)勢。只要含有可檢測到的DNA 或RNA，mNGS就能同時(shí)檢測病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲等病原體。由于能檢測到其他傳統(tǒng)手段無法檢測到的病原體，因此其在臨床疑難雜癥或免疫抑制患者中具有重要意義［5］。在兒童膿毒血癥、下呼吸道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等疾病中，mNGS對細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等感染具有一定的診斷優(yōu)勢和臨床應(yīng)用價(jià)值［6］。現(xiàn)有關(guān)于免疫異常狀態(tài)如免疫缺陷并發(fā)重癥肺炎患兒及急性淋巴細(xì)胞白血病患兒早期誘導(dǎo)化療階段行mNGS檢測能協(xié)助明確病原體的相關(guān)報(bào)道［7-8］，但多為病例報(bào)道且病例數(shù)少。尚未見到較大病例數(shù)量的、涉及兒童粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱這類免疫異常狀態(tài)下利用mNGS檢測明確感染病原體的研究報(bào)道。本研究通過收集116例粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒，采用病原體mNGS檢查手段，來探討mNGS在兒童粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱中的應(yīng)用價(jià)值，以期為兒童粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的診治提供新的診療手段和經(jīng)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集中南大學(xué)湘雅醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院、中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院及湖南省兒童醫(yī)院小兒血液腫瘤病房2020 年1 月至2021 年12 月發(fā)生粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱并完成病原體mNGS 檢測的116 例患兒資料。mNGS 結(jié)果陰性患兒為陰性組（n=38），78 例陽性患兒根據(jù)主要病原體分為細(xì)菌組（n=22）、真菌組（n=23）及病毒組（n=31）。粒細(xì)胞缺乏判定標(biāo)準(zhǔn)：外周血中性粒細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)（absolute neutrophil count，ANC） ＜0.5×109/L，或預(yù)計(jì)48 h后ANC＜0.5×109/L；嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏指ANC＜0.1×109/L［3］。發(fā)熱判定標(biāo)準(zhǔn)：指單次口腔溫度≥38.3℃（腋溫≥38.0℃），或口腔溫度≥38.0℃（腋溫≥37.7℃）持續(xù)超過1 h［3］。

1.2 資料收集

回顧性收集患兒的臨床信息，包括診斷年齡、病因、C‐反應(yīng)蛋白（C‐reactive protein，CRP）水平、 降 鈣 素 原（procalcitonin， PCT） 水 平、(1,3)‐β‐D 葡聚糖/半乳甘露聚糖［(1,3)‐β‐D glucan/galactomannan test，G/GM］試驗(yàn)、熱程、調(diào)整用藥及預(yù)后情況。

1.3 mNGS方法流程

mNGS檢測樣品采集要求：對于粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的患兒首先常規(guī)進(jìn)行微生物培養(yǎng)及廣譜抗生素治療，在治療滿3 d 病情未控制及血培養(yǎng)3 d 未回報(bào)陽性結(jié)果患兒［5］，采集外周血、痰液/肺泡灌洗液或骨髓標(biāo)本用于mNGS 檢測。mNGS 檢測的方法及報(bào)告判讀：標(biāo)本經(jīng)離心獲得血漿后進(jìn)行DNA提取，采用磁珠法（廣州美基生物科技有限公司）提取與純化。提取完畢的核酸按照建庫試劑盒Nextera XT（illumina，USA）說明書進(jìn)行宏基因組文庫的構(gòu)建， 后使用 Qubit 4 熒光計(jì)（Thermofisher）與瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫大小分析與定量后，將加有不同index 接頭序列的文庫等量混合后，使用Illumina NextSeq 550 DX 測序平臺進(jìn)行高通量測序。獲取的序列數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、比對獲取病原微生物的檢出序列數(shù)，同時(shí)計(jì)算病原體的相對豐度。獲得可信的分析數(shù)據(jù)后，進(jìn)行報(bào)告判讀，根據(jù)病原體致病性分為3 級，其判讀標(biāo)準(zhǔn)為：（1）高等級的致病性病原體如結(jié)核分枝桿菌等，檢出即報(bào)告；（2）中等級的條件致病菌，檢出序列數(shù)≥3 即報(bào)告；（3）低等級的條件致病菌/常見定植菌如凝固酶陰性葡萄球菌，報(bào)告在疑似背景微生物中。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（Q1，Q3）］表示，多組間比較采用Kruskal‐WallisH法；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、百分率（%）或構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；組間兩兩比較均采用Bonferroni校正法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共有116 例患兒完成了病原體mNGS 檢測，中位診斷年齡為8.00（4.00，11.25）歲，其中男性68例（58.6%），女性48 例（41.4%），基礎(chǔ)疾病為急性白血病85 例（73.3%），再生障礙性貧血、淋巴瘤各11例（9.5%），噬血細(xì)胞綜合征3例（2.6%），髓母細(xì)胞瘤、地中海貧血各2 例（1.7%），神經(jīng)母細(xì)胞瘤、粒細(xì)胞肉瘤各1例（0.9%）。

2.2 病原體mNGS檢測結(jié)果

116 份標(biāo)本的mNGS 中位結(jié)果回報(bào)時(shí)間為2（1，2）d，陽性率為67.2%（78/116）。78 例陽性患兒中檢出2 種及2 種以上病原體26 例（22.4%）；主要病原體為病毒31例（26.7%），真菌23 例（19.8%），細(xì)菌22 例（19.0%），其他2 例（1.7%），見表1。78例陽性患兒原發(fā)病情況見表2。

表1 78例mNGS陽性患兒主要病原體分類結(jié)果

表1 （續(xù)）

表2 78例mNGS陽性患兒原發(fā)病情況 （例）

微生物培養(yǎng)標(biāo)本來源包括血液、痰液/肺泡灌洗液、骨髓、大便，其中培養(yǎng)陽性22 例（細(xì)菌17例，真菌5例），陽性率為19.0%。mNGS標(biāo)本來源包括血液、痰液/肺泡灌洗液及骨髓，檢測出細(xì)菌和真菌總例數(shù)45 例（38.8%）。22 例培養(yǎng)陽性標(biāo)本中，與mNGS 結(jié)果一致共9 例（41%），包括細(xì)菌6例，真菌3 例；mNGS 陽性但與培養(yǎng)結(jié)果不一致8例（36%）；mNGS 陰性5 例（23%）?；純喊l(fā)熱全程中通常會(huì)行多次血培養(yǎng)，其中任意1次血培養(yǎng)陽性即標(biāo)記為陽性。血培養(yǎng)陽性共17 例，陽性率15%（17/116），mNGS 與血培養(yǎng)結(jié)果一致共8 例，達(dá)47%（8/17）。

2.3 不同感染灶的mNGS陽性率比較

116例患兒綜合臨床癥狀、體征、相關(guān)檢驗(yàn)指標(biāo)及影像學(xué)結(jié)果，判定主要感染灶來源仍以呼吸道感染為主（52.6%，61/116）。不同感染來源病例mNGS檢測具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 不同感染灶患兒的mNGS陽性率

2.4 4 組患兒CRP、PCT 水平及G/GM 試驗(yàn)結(jié)果比較

細(xì)菌組PCT水平高于陰性組（P=0.016），真菌組CRP水平、G/GM試驗(yàn)陽性率高于陰性組（分別P=0.020、P＜0.001），見表4。

表4 4組患兒CRP、PCT水平及G/GM試驗(yàn)結(jié)果比較

2.5 治療及預(yù)后

細(xì)菌組、真菌組、病毒組、陰性組患兒熱程分別為8.50（7.00，19.50）、15.00（9.00，29.00）、8.00（5.00，15.00）、9.50（6.00，18.25）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=12.405，P=0.006）；經(jīng)兩兩比較顯示，真菌組患兒熱程長于陰性組（P=0.005）。

78例mNGS陽性患兒中，28例（36%）根據(jù)陽性結(jié)果調(diào)整用藥，其中26例治愈好轉(zhuǎn)，1例未愈出院，1例因合并水痘感染最終導(dǎo)致多器官功能衰竭死亡；50 例未調(diào)整用藥，其中48 例治愈好轉(zhuǎn)，2例未愈出院。38 例mNGS 陰性患兒均治愈好轉(zhuǎn)出院。

3 討論

mNGS技術(shù)能夠克服當(dāng)前臨床基于微生物培養(yǎng)的診斷方法的局限性，允許直接從臨床標(biāo)本中進(jìn)行無假設(shè)、獨(dú)立于培養(yǎng)的病原體檢測。mNGS的優(yōu)勢在于更快速、更全面、更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析作用，尤其在特殊病原體的檢測方面優(yōu)勢明顯［9-11］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在血源性感染中mNGS結(jié)果與血培養(yǎng)結(jié)果基本一致，且具有更高的陽性率［12-13］。因此我們把mNGS引入粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱的輔助診療中。

mNGS在病原體檢測方面具有良好的時(shí)效性和陽性率。以傳統(tǒng)的血培養(yǎng)檢測方法為例，往往需要革蘭染色、快速抗原反應(yīng)、分子生物學(xué)檢測、分離鑒定、藥敏試驗(yàn)等相關(guān)鑒定步驟。血培養(yǎng)陰性報(bào)告程序中自動(dòng)化儀器培養(yǎng)一般周期設(shè)定為細(xì)菌5 d、真菌14 d、分枝桿菌42 d；手工法培養(yǎng)一般周期設(shè)定為細(xì)菌7 d、真菌14 d、分枝桿菌8周［14］。本研究采用mNGS 進(jìn)行病原體檢測，結(jié)果回報(bào)時(shí)間為1～5 d，中位時(shí)間為2 d。相較于傳統(tǒng)的病原體檢測方法，mNGS技術(shù)可以通過單一樣本及單一檢測項(xiàng)目完成對病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲及其他罕見病原體的檢測，由此帶來以下優(yōu)勢：（1）陽性率高，我們檢測了116例粒細(xì)胞減少伴發(fā)熱患兒，陽性率高達(dá)67.2%；（2）檢測面廣，在陽性結(jié)果中檢測出27種病原體，囊括了細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、立克次體等病原體?？紤]到粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒早期廣譜抗生素的應(yīng)用，必然會(huì)降低對某些病原體的檢出率。即使檢測前已使用廣譜抗細(xì)菌及真菌藥物，本研究mNGS檢測中細(xì)菌檢出率仍有19.0%，真菌檢出率為19.8%。檢出的細(xì)菌及真菌基本均為粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱常見的類型，與國內(nèi)外既往報(bào)道感染菌譜一致、耐藥菌譜一致［15-17］。

一般認(rèn)為，CRP、PCT顯著升高提示細(xì)菌與真菌感染，并與感染嚴(yán)重程度相關(guān)。G/GM試驗(yàn)更是真菌感染較為特異的指標(biāo)，而相對的病毒感染時(shí)上述炎癥指標(biāo)升高不明顯。本研究中CRP、PCT水平及G/GM試驗(yàn)結(jié)果變化與臨床細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染的炎癥指標(biāo)特征基本一致，進(jìn)一步印證了mNGS檢測結(jié)果的可靠性。同時(shí)我們也驗(yàn)證了CRP 顯著升高、G/GM 陽性時(shí)mNGS 檢測發(fā)現(xiàn)真菌感染可能性更大，而PCT 顯著升高發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染可能性更大，均提示mNGS檢查結(jié)果與臨床指標(biāo)具有一致性。

培養(yǎng)是臨床最常用的病原體檢測方法之一，可用于常見細(xì)菌、真菌的檢測，提供的藥敏信息可以直接為治療提供指導(dǎo)。但基于培養(yǎng)結(jié)果與病原體滴度、采集方法、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，可能導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)間長、培養(yǎng)陽性率低。粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒往往發(fā)病急、病程長，常常選擇多部位進(jìn)行培養(yǎng)以期找到病原學(xué)證據(jù)，若治療效果不佳則會(huì)反復(fù)多次進(jìn)行培養(yǎng)檢測。本研究發(fā)現(xiàn)即使在多部位、多次檢測情況下，培養(yǎng)檢測的陽性率也只有19.0%。而mNGS 受限于高檢測費(fèi)用，患兒的檢測往往是在廣譜抗感染藥物治療后且通常檢測次數(shù)有限，即使如此，本研究中mNGS細(xì)菌和真菌陽性率也有38.8%。我們檢測到的mNGS 與血培養(yǎng)陽性符合率相較其他報(bào)道低，主要是由于我們將粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒反復(fù)多次血培養(yǎng)結(jié)果合并計(jì)算所致［13］。值得注意的是其中1 例患兒大便培養(yǎng)為銅綠假單胞菌，反復(fù)多次血培養(yǎng)均為陰性，而血mNGS結(jié)果同樣提示為銅綠假單胞菌。綜合臨床信息考慮該患兒為原發(fā)腸道感染后繼發(fā)血流感染，而相較于持續(xù)陰性的血培養(yǎng)，mNGS早期即檢測出病原體在血液中的表達(dá)，也側(cè)面驗(yàn)證了mNGS 的時(shí)效性及準(zhǔn)確性。有研究提出mNGS 檢測陰性有助于排除感染性疾病的診斷，但要求測序覆蓋度足夠高，能確保樣本中存在的病原微生物被檢測出來［18］。因此，雖然mNGS 不能提供藥敏信息，但其與微生物培養(yǎng)存在優(yōu)勢互補(bǔ)，能在早期協(xié)助病原體尤其是少見或需要特殊培養(yǎng)條件病原體的檢出。

mNGS的引入主要目的是為了早期明確導(dǎo)致感染的病原體以指導(dǎo)臨床抗感染藥物的應(yīng)用，從而縮短病程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒mNGS陽性結(jié)果指導(dǎo)抗感染治療的調(diào)整比例并不很高，主要是因?yàn)榇祟惢純和ǔＴ诎l(fā)熱出現(xiàn)即刻啟動(dòng)抗感染藥物降階梯治療，廣譜藥物可能覆蓋了檢測出的病原體，因此治療上未予調(diào)整。另外某些病原體本身也缺乏特異性抗感染藥物。本研究顯示真菌患兒具有更長的熱程，這與真菌感染的臨床經(jīng)過一致。

mNGS 在感染性疾病的應(yīng)用中也還存在局限性，包括多重感染/背景菌的判斷、胞內(nèi)菌/真菌檢出率相對較低、RNA 病原體檢測要求較高等等。本研究結(jié)果也反映出mNGS檢測存在較高的多重感染率。目前相關(guān)指南建議檢測機(jī)構(gòu)必須盡可能提供檢測列表，而不是做出判斷，這也提示臨床醫(yī)生在解讀報(bào)告時(shí)需結(jié)合采集樣本類型、微生物背景、患者的臨床特征、傳統(tǒng)的病原體檢測報(bào)告和輔助檢查等進(jìn)行定植菌、背景菌和致病菌的判斷［19］。

粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱屬于血液系統(tǒng)疾病治療中的常見急重并發(fā)癥，早期有效的治療能明顯縮短病程、降低病死率。mNGS作為病原體檢測的新技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、不受病原體種類影響、陽性率高的特點(diǎn)。同時(shí)mNGS的檢測結(jié)果可以指導(dǎo)臨床抗感染治療，改善患兒預(yù)后。綜上所述，mNGS可以作為傳統(tǒng)檢測手段的補(bǔ)充檢查，對于粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患兒具有重要臨床指導(dǎo)及應(yīng)用價(jià)值。